Comunicación corta

Efecto del pH del medio de cultivo en el crecimiento presimbiótico de Rhizoglomus irregulare

Martha de la Caridad Arocha-Rodríguez^{1  *}  , Eduardo Pérez-Ortega¹  , Kalyanne Fernández-Suárez¹  , Geert Haesaert² 

¹Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA), carretera San José-Tapaste, km 3½, Gaveta Postal 1, San José de las Lajas, Mayabeque, Cuba. CP 32 700

²Facultad de Ingeniería en Biociencias, Universidad de Gent, Bélgica

RESUMEN

Los hongos micorrízicos arbusculares (HMA) están representados en casi todos los ecosistemas terrestres y colonizan a más del 90 % de las plantas. Su asociación depende de muchos factores edafoclimáticos entre ellos el pH, uno de los parámetros químicos más importantes del suelo, que regula directamente la disponibilidad de los nutrientes y puede afectar la germinación, diversidad, densidad de esporas y colonización de raíces por HMA El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del pH del medio de cultivo Strullu y Romand Modificado (SRM) en el crecimiento presimbiótico de Rhizoglomus irregulare (INCAM 11) en condiciones “in vitro”. Para el desarrollo del experimento las esporas de HMA se expusieron a diferentes pH (4,5; 5,5; 6,5 y 7,5) y se evaluó el crecimiento del tubo germinativo durante 4 semanas presentando los mayores valores de crecimiento en el pH 7,5. Este resultado está dentro del rango de pH óptimo recomendado para esta cepa en experimentos de campo, en los cuales muestra su mayor eficiencia.

Palabras-clave: micorrizas; germinación de esporas; cultivo in vitro

INTRODUCCIÓN

Los hongos micorrizógenos arbusculares (HMA, Phyllum Glomeromycota) son parte integral de numerosos ecosistemas y se consideran particularmente ventajosos debido a que se asocian a la mayoría de las plantas vasculares ¹. Esta simbiosis mutualista facilita la captación de nutrientes minerales y agua a la vez que protege a las plantas contra distintas enfermedades ^2,3. La mayoría de los HMA contribuyen a la estabilidad de los agregados del suelo ⁴ y se adaptan a un amplio espectro de condiciones edáficas que están relacionadas con su desarrollo y eficacia ^5,6. El pH es considerado uno de los parámetros químicos más importantes del suelo ⁷, debido al efecto que ejerce tanto sobre las características físicas, químicas y biológicas de éste, como también sobre el rendimiento de los cultivos. A través del intercambio iónico el pH regula directamente la disponibilidad de los nutrientes, lo que determina la riqueza de especies y la composición de la comunidad de microrganismos entre los que se encuentran los HMA ⁷.

El pH determina en muchos casos la eficiencia del endófito, el porcentaje de germinación y el desarrollo de las esporas de los HMA ^6,7. Por tanto, es muy importante en los estudios de selección de especies de HMA, con alta eficiencia simbiótica, tener en cuenta el efecto del pH, ya sea, sobre la productividad de la asociación o sobre los mecanismos de reproducción fúngicos, con el fin de poder seleccionar las especies o ecotipos de mayor eficiencia en un rango amplio de pH o en los rangos que resulten de interés ^8,9. A pesar de la importancia de los hongos HMA en la fisiología y nutrición de las plantas, así como en la formación de comunidades de plantas, los factores que afectan la germinación, diversidad, densidad de esporas y colonización de raíces por HMA son poco conocidos ⁸.

Atendiendo a los aspectos anteriormente descritos el trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto del pH del medio de cultivo Strullu y Romand Modificado (SRM) en el crecimiento presimbiótico de Rhizoglomus irregulare (INCAM 11) en condiciones “in vitro”.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el presente estudio se evaluó el crecimiento del tubo germinativo de Rhizoglomus irregulare (INCAM 11), en diferentes condiciones de pH (4,5; 5,5; 6,5 y 7,5) del medio de cultivo Strullu y Romand Modificado (SRM).

Material biológico

Para la ejecución del experimento se extrajeron esporas de INCAM11 procedente de la colección de HMA del Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) de Cuba mediante la técnica de Tamizado húmedo y decantado y posterior extracción por centrifugación en gradiente de sacarosa + Tween 80 a 2000 rpm en centrifuga de mesa (KUBOTA) durante cinco minutos ^10,11. Una vez obtenida la interfase agua - sacarosa + Tween 80, las esporas se extrajeron empleando una jeringa de 30 mL.

Desinfección de esporas de Rhizoglomus irregulare. (INCAM-11)

De los propágulos extraídos se seleccionaron ramilletes de esporas según la técnica de desinfección previamente propuesta por Cranenbrouck et al. ¹², modificado por Perera ¹³, los cuales se colocaron sobre una membrana (0,44 μm de poro) y se lavaron tres veces con agua destilada estéril. Posteriormente, se pusieron en contacto con una solución de Cloramina T al 2 % y dos gotas de Tween 20 durante 10 minutos. Seguidamente se lavaron tres veces con agua destilada estéril y se trataron con una solución de antibióticos durante 10 minutos que contenía Sulfato de estreptomicina (0,02 %) y Sulfato de gentamicina (0,01 %), la cual se esterilizó con ayuda de filtro miliporo (tipo HA, 4,0 cm de diámetro y 0,22 μm de poro). Pasado este tiempo la membrana con los propágulos fue transferida a la solución antibiótica, previamente filtrada en placa Petri estéril (90 mm diámetro) durante 24 horas.

Posteriormente, los propágulos se inocularon en placas Petri de 90 mm diámetro, divididas en 4 compartimentos que contenían cada uno, medio de cultivo SRM con los diferentes pH en estudio 4,5; 5,5; 6,5 y 7,5 ajustados con HCL o NaOH según correspondiera.

Evaluación del crecimiento del tubo germinativo de propágulos de Rhizoglomus irregulare (INCAM - 11) en condiciones in vitro

Este experimento se diseñó con el propósito de realizar una dinámica de crecimiento del tubo germinativo de propágulos de INCAM-11. Esta variable se evaluó a partir del momento en que se observó crecimiento del tubo germinativo a partir del esporóforo o de la hifa de sustentación. Las mediciones del mismo se realizaron una vez por semana durante un mes, con un micrómetro acoplado al microscopio de disección (Novel, Aumento 40X), partiendo del comienzo de la nueva hifa formada y hasta el ápice de la misma.

Análisis estadístico

Una vez comprobada la normalidad, se calculó el intervalo de confianza de las medias al 95 % de probabilidad, atendiendo al número de repeticiones (10 réplicas por tratamiento) y la reproducibilidad de los datos. Los análisis de comparación de medias y la determinación de los intervalos de confianza fueron realizados por el programa STATISTIC versión 6.1.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En la Figura 1 se muestra el efecto de los diferentes pH en el crecimiento del tubo germinativo de la cepa Rhizoglomus irregulare (INCAM 11). Se observó que los mayores valores de longitud del tubo germinativo los mostró la cepa en el pH 7,5, presentando diferencias estadísticamente significativas desde el inicio del experimento con el resto de los tratamientos.

Las barras representan los intervalos de confianza de la media de tratamientos para p≤ 0,05 (n=4tratamientos)

Figura 1 Dinámica del crecimiento del tubo germinativo de propágulos de INCAM 11 inoculados en medio SRM durante cuatro semanas 

Investigaciones dirigidas al estudio del efecto del pH en la colonización micorrízica, plantean que hay determinadas cepas de HMA insensibles al aumento del pH (valores de pH 7), aunque éstas, de manera general, tienen un mejor rendimiento en suelos alcalinos, o en condiciones de pH neutro ⁷. No obteniéndose los mismos resultados para suelos ácidos donde el número de hifas y arbúsculos presentes en las raíces examinadas eran escasas.

En el Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA) se trabaja desde 1992 en la utilización y extensión de estos hongos en la nutrición vegetal en general y en la fosforada en particular, contando con un sistema de recomendación de cepas por tipo de suelo, en función de su pH, contenido de materia orgánica y nivel de fertilidad ¹⁴. De esta forma, estudios realizados en suelos Pardo Mullido Carbonatado con un pH-H₂O ligeramente alcalino ^2,7 se observó que la cepa INCAM 11 presentó siempre un efecto superior y significativo (p≤0,05), diferenciándose de los obtenidos por las cepas restantes Glomus cubense y Funneliformis mosseae¹⁵. En la presente investigación, este resultado permitió corroborar que la mencionada cepa presentó los mejores valores de germinación en un pH cercano al que se empleó para el estudio de extensión antes mencionado ¹⁵. Con lo cual se corrobora que el efecto del pH es determinante para la eficiencia de la cepa empleada por tipo de suelo, lo que evidencia que su potencialidad está relacionada con el pH del medio en que se desarrolla. Esto le permite acceder al sitio de infección con más facilidad lo que le posibilita establecerse en estas condiciones y ejercer su efecto.

Recientemente, algunos autores han planteado que la relación que se establece entre los rangos de pH del suelo y el efecto de la colonización micorrízica es verdaderamente complejo, dependiendo no sólo de la especie micótica, sino también del tipo de suelo, la forma en que se encuentran los nutrientes (fundamentalmente P y N y otros elementos como Cu, Zn, Mo, B, etc.) y en menor medida de la especie de planta sobre la que se desarrolla ⁸, en este sentido, es de destacar que estos efectos son importantes desde el inicio del ciclo de vida del simbionte, como se observó en este experimento, lo cual confirma la teoría de que el funcionamiento óptimo está determinado por el pH del sustrato en el cual se desarrolla el simbionte.

CONCLUSIÓN

Los resultados obtenidos en este experimento están dentro del rango de pH óptimo recomendado para esta cepa en experimentos de campo, en los cuales muestra su mayor eficiencia.

BIBLIOGRAFÍA

1.  Ortiz N, Armada E, Duque E, Roldán A, Azcón R. Contribution of arbuscular mycorrhizal fungi and/or bacteria to enhancing plant drought tolerance under natural soil conditions: effectiveness of autochthonous or allochthonous strains. Journal of plant physiology. 2015;174:87-96.

2.  Augé RM, Toler HD, Saxton AM. Arbuscular mycorrhizal symbiosis alters stomatal conductance of host plants more under drought than under amply watered conditions: a meta-analysis. Mycorrhiza. 2015;25(1):13-24.

3.  Sánchez-Romera B, Calvo-Polanco M, Ruiz-Lozano JM, Zamarreño ÁM, Arbona V, García-Mina JM, et al. Involvement of the def-1 mutation in the response of tomato plants to arbuscular mycorrhizal symbiosis under well-watered and drought conditions. Plant and Cell Physiology. 2017;59(2):248-261.

4.  Wu Q-S, Cao M-Q, Zou Y-N, He X. Direct and indirect effects of glomalin, mycorrhizal hyphae, and roots on aggregate stability in rhizosphere of trifoliate orange. Scientific Reports. 2014;4:5823. doi:10.1038/srep05823

5.  Khan A, Sharif M, Ali A, Shah SNM, Mian IA, Wahid F, et al. Potential of AM fungi in phytoremediation of heavy metals and effect on yield of wheat crop. American Journal of Plant Sciences. 2014;5(11):1578-86.

6.  Kanwal S, Bano A, Malik RN. Role of arbuscular mycorrhizal fungi in phytoremediation of heavy metals and effects on growth and biochemical activities of wheat (Triticum aestivum L.) plants in Zn contaminated soils. African Journal of Biotechnology. 2016;15(20):872-883.

7.  Ouzounidou G, Skiada V, Papadopoulou KK, Stamatis N, Kavvadias V, Eleftheriadis E, et al. Effects of soil pH and arbuscular mycorrhiza (AM) inoculation on growth and chemical composition of chia (.Salvia hispanica L.) leaves. Brazilian Journal of Botany. 2015;38(3):487-95. doi:10.1007/s40415-015-0166-6

8.  Kawahara A, An G-H, Miyakawa S, Sonoda J, Ezawa T. Nestedness in Arbuscular Mycorrhizal Fungal Communities along Soil pH Gradients in Early Primary Succession: Acid-Tolerant Fungi Are pH Generalists. PLOS ONE. 2016;11(10):e0165035. doi:10.1371/journal.pone.0165035

9.  Vyas D, Gupta RK. Effect of edaphic factors on the diversity of VAM fungi. Trop Plant Res. 2014;1:14-25.

10.  Gerdemann JW, Nicolson TH. Spores of mycorrhizal Endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society. 1963;46(2):235-44. doi:10.1016/S0007-1536(63)80079-0

11.  Herrera RA, Ferrer RL, Furrazola E, Orozco MO. Estrategia de funcionamiento de las micorrizas VA en un bosque tropical. Biodiversidad en Iberoamérica. Ecosistemas, evolución y procesos sociales. Programa Iberoamericano deficiencia y tecnología para el desarrollo. Subprograma XII. Diversidad Biológica: Mérida. 1995.

12.  Cranenbrouck S, Voets L, Bivort C, Renard L, Strullu D-G, Declerck S. Methodologies for in Vitro Cultivation of Arbuscular Mycorrhizal Fungi with Root Organs. In: Declerck S, Fortin JA, Strullu D-G, editors. In Vitro Culture of Mycorrhizas [Internet]. Berlin, Heidelberg: Springer; 2005 [cited 05/05/2019]. p. 341-75. doi:10.1007/3-540-27331-X_18

13.  Perera García SS. Cultivo in vitro de Glomussp13.  . (INCAM 11) asociado a raíces transformadas de Cichoriumintybus.13.  [Trabajo de Diploma]. Universidad de La Habana, Facultad de Biología. 2017. 32p.

14.  Rivera R, Fernández F, Fernández K, Ruiz L, Sánchez C, Riera M, et al. Advances in the management of effective arbuscular mycorrhizal symbiosis in tropical ecosystesm. In: Ed. Hamel E, Plenchette C, editors. Mycorrizae in Croup Productions. 2007. p. 151-95.

15.  João JP, Espinosa Cuellar A, Ruiz Martínez L, Simó González J, Rivera Espinosa R. Efectividad de cepas de HMA en el cultivo de la yuca (Manihot esculenta Crantz) en dos tipos de suelos. Cultivos Tropicales. 2016;37(1):48-56.

Recibido: 26 de Diciembre de 2018; Aprobado: 14 de Mayo de 2019

^*Autor para correspondencia. [e-mail]