Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Aislamiento, identificación y tipificación de levaduras en pacientes VIH positivos con candidiasis oral

Dr. GERARDO MARTÍNEZ MACHÍN,¹ Lic. MAYDA PERURENA LANCHA,² Lic. JOSÉ NÚÑEZ CARVAJAL,³ Lic. CARLOS M. FERNÁNDEZ ANDREU⁴ y Dr. FRANCISCO BANDERA TIRADO⁵

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1. Especialista de I Grado en Microbiología. Investigador Agregado.
2. Licenciada en Microbiología. Aspirante a Investigadora.
3. Licenciado en Microbiología.
4. Licenciado en Microbiología. Investigador Auxiliar.
5. Especialista de I Grado en Microbiología.

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RESUMEN

Se realizó un estudio de candidiasis oral a 25 pacientes VIH positivos y SIDA. La forma clínica de presentación predominante fue la pseudomembranosa y las especies de levadura más frecuentes en los aislamientos fueron Candida albicans (54,1 %), Candida tropicalis (8,1 %) y Torulopsis glabrata (8,1 %). Se demostró que los pacientes con infecciones recurrentes suelen tener colonización de la cavidad oral por múltiples cepas y/o especies de levaduras con mayor frecuencia (30,8 %) que los que cursan por su primer episodio de candidiasis oral (12,5 %). De los 3 medios de cultivo utilizados para el aislamiento inicial, la combinación del agar papa dextrosa (APD) y el agar Sabouraud trifeniltetrazolium (AST) permitió obtener el máximo de aislamiento y de diferenciación entre cepas. El agar Sabouraud (AS), el medio más utilizado para estos fines internacionalmente, fue menos útil que los anteriores. El AST resultó ser, además, un medio de gran utilidad para estudios de tipificación fenotípica de la mayoría de las especies de levaduras aisladas y especialmente de C. albicans, lo cual permitirá abordar estudios epidemiológicos.

Descriptores DeCS: CANDIDIASIS BUCAL/microbiología; INFECCIONES OPORTUNISTAS RELACIONADAS CON SIDA/microbiología; LEVADURAS/aislamiento & purificación; LEVADURAS/clasificación; MEDIOS DE CULTIVO; TECNICAS BACTERIOLOGICAS; SINDROME DE INMUNODEFICIENCIA ADQUIRIDA/complicaciones; SEROPOSITIVIDAD PARA VIH/complicaciones.

En los años 60 la infección por Candida era principalmente un problema en Ginecología y Pediatría. El impacto de la creciente incidencia de infecciones diseminadas por Candida en hospederos inmunocomprometidos no fue realmente evidente hasta los años 80. En estos años, el comienzo de la epidemia de SIDA, la incidencia de la micosis y en particular la candidiasis, ha aumentado considerablemente.¹

La candidiasis se ha convertido en la infección oportunista más frecuente en pacientes VIH positivos y SIDA. La casi totalidad de los pacientes están colonizados por Candida y entre el 75 y el 95 % desarrollan al menos 1 episodio de candidiasis oral en el curso de la evolución de su enfermedad de base.

Un aspecto importante en estudios de prevalencia, recurrencia y evaluación de las propiedades de los aislamientos de Candida obtenidos de la cavidad oral de pacientes VIH positivos, es el referente a los medios de cultivo utilizados para el aislamiento inicial.³ Este elemento, al parecer tan simple cuando no se le da la importancia necesaria, puede llevar a falsas conclusiones sobre la flora presente en una muestra clínica.

La identificación hasta el nivel de especie de los aislamientos de levaduras obtenidos a partir de muestras clínicas, es otro aspecto de gran interés actual. La prevalencia casi absoluta de Candida albicans y la ausencia de resistencia a los antimicóticos que caracterizaba los estudios de candidiasis oral han cedido terreno a la aparición de cepas de Candida albicans menos sensibles,⁴ y adicionalmente otras especies de levaduras como Candida tropicalis, y Candida krusei y Torulopsis glabrata son reportadas con frecuencia creciente como patógenos oportunistas en la cavidad oral de estos pacientes, y algunas de estas especies son resistentes a los tratamientos antifúngicos.^5,6

Por último, la marcada recurrencia de los cuadros de candidiasis oral en pacientes VIH positivos y SIDA, y la necesidad de desarrollar estudios epidemiológicos y de patogenicidad, han promovido el desarrollo de métodos de tipificación que permitan estudiar el modo de transmisión, la patogenia de la infección por Candida albicans, así como la persistencia de una cepa o la reinfección con una nueva en casos de recurrencia.⁷

Con el presente trabajo nos proponemos comparar diferentes medios de cultivo como medios de aislamiento, identificar las especies de levaduras asociadas con los cuadros de candidiasis oral y validar, en nuestras condiciones, un sistema de tipificación basado en la morfología colonial, que pueda ser de utilidad en estudios futuros.

MÉTODOS

PACIENTES

Se tomaron muestras a 25 pacientes VIH positivos, ingresados en el Hospital del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK), de La Habana. Todos presentaban signos y síntomas de una candidiasis orofaríngea en algunas de sus manifestaciones clínicas. Fueron recogidos datos de interés referentes a las caraterísticas clínicas de las lesiones y su tratamiento.

TOMA DE MUESTRA

A cada paciente se le realizó exudado de las lesiones orales. Se utilizaron 2 hisopos estériles, con uno se sembró directamente en placas de agar papa dextrosa (APD) y agar Sabouraud trifeniltetrazolium (AST) en ese orden. Con el otro se sembró la placa de agar Sabouraud (AS) y se conservó en 1 mL de solución salina a 4 C para su posterior utilización, de ser necesario. Los medios inoculados se incubaron a 37 EC durante 40 h.

OBTENCIÓN DE CULTIVO PURO

Pasadas las 48 h de incubación, las placas con crecimiento característico de hongos levaduriformes fueron observadas al microscopio estereoscópico, con el objetivo de distinguir la presencia de más de 1 morfología de colonia. Las características morfológicas que se tuvieron en cuenta fueron: textura, color, intensidad del color y presencia de halo micelial.

Cada colonia morfológicamente distinta se resembró en una placa de agar Sabouraud cloranfenicol (SCL) por el método de agotamiento en estrías, y se incubaron a 37 EC por 48 h para obtener colonias aisladas en cultivo puro.

A partir de una colonia aislada y tras verificar su pureza se procedió a realizar los estudios morfológicos y fisiológicos necesarios para identificar el género y la especie de la levadura aislada.

IDENTIFICACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS

Las cepas aisladas fueron identificadas como Candida albicans por su capacidad para emitir tubos germinativos al ser incubadas en suero equino por 2,5 h a 37 EC y para producir clamidosporas en agar maíz tween 80 según la técnica de Dalmau. Aquellos aislamientos que no formaron tubo germinativo y que no producían clamidosporas se identificaron mediante las pruebas de auxonograma, zimograma y otras técnicas, mediante la metodología de McGinnis.⁸

TIPIFICACIÓN DE LAS CEPAS EN AST

Una vez concluida la identificación de todas las cepas hasta especie, se procedió a la tipificación de éstas, según la metodología de Quindos y otros⁹ modificada. Brevemente, cultivos de 48 h de incubación en AS fueron sembrados por estrías en placas que contenían AST e incubados a 37 EC durante 6 d. Pasado este tiempo, las cepas fueron tipificadas según las características morfológicas de las colonias basándose en los códigos siguientes:

Textura: Lisa = L. Rugosa = R.

Color: Rosado = D. Violeta = V. Blanco = B. Naranja = A.

Intensidad del color: Claro = 1. Oscuro = 2.

Presencia de halo micelial: Sí existe = S. No existe = N.

No se observa crecimiento: NC.

La secuencia que se iba a seguir fue la siguiente: textura, color, intensidad del color y presencia de halo micelial.

RESULTADOS

De las 4 formas clínicas de candidiasis oral descritas en pacientes positivos al VIH y SIDA,² la forma pseudomembranosa fue la más común, se presentó en 17 de los 25 pacientes estudiados (68 %). Esta forma clínica se caracterizó por la presencia de placas blanco-amarillas removibles y localizadas frecuentemente en la superficie dorsal de la lengua, los carrillos y el paladar. La candidiasis eritematosa se presentó en 8 de los pacientes (32 %) y se caracterizó por manchas rojas sobre la mucosa oral en ocasiones extendidas en forma de sábanas y localizadas preferentemente sobre la superficie dorsal de la lengua.

Las muestras tomadas a los 25 pacientes fueron sembradas en los 3 medios de cultivo, en 21 (84 %) de ellas no se obtuvo crecimiento de hongos levaduriformes, en las 4 restantes (16 %) no se observó crecimiento en ninguno de los medios empleados.

Al comparar el crecimiento en los 3 medios de cultivo utilizados para el aislamiento inicial (tabla 1), se observa que en agar Sabouraud, de las 21 muestras positivas, 4 (19 %) poseían colonias con diferentes morfologías y de éstas, ninguna presentó más de 2 tipos morfológicamente diferentes. En el medio APD se obtuvieron 5 muestras (24 %) con colonias de diferentes morfologías, 4 de las cuales tenían 3 tipos de morfología diferentes. El medio donde se observó un mayor porcentaje de muestras con colonias morfológicamente diferentes fue el AST, con el 29 %. En las 6 muestras con diferentes morfologías de colonias se observaron entre 2 y 5 tipos morfológicos distintos por muestras. En este medio las diferencias morfológicas entre las colonias fueron más fácilmente apreciables.

TABLA 1. Comparación entre los medios de cultivo utilizados para el aislamiento inicial

 

Medio	Muestras con diferentes morfologías	Tipos morfológicamente diferentes	Cepas identificadas n = 37
AS	4	8	25
APD	5	14	29
AST	6	17	32

 

AS: Agar Sabouraud. APD: Agar papa dextrosa. AST: Agar trifeniltetrazolium.

Con los medios empleados se aislaron 37 cepas de levaduras, las cuales fueron identificadas hasta el nivel de especie. En el medio AS se obtuvieron 25 cepas (67,6 %); en el medio APD se determinó la presencia de 29 cepas (78,4 %) y en AST se obtuvo el mayor resultado al encontrarse 32 cepas (86,5 %).

La identificación de levaduras se realizó según la metodología de trabajo del Laboratorio de Micología del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).⁸ El esquema general resultó de gran utilidad, pues permitió identificar el 100 % de los aislamientos hasta el nivel de especie.

FIGURA. Total de especies de levadura aisladas y frecuencia de aparición.

La figura relaciona el total de las especies de levaduras aisladas y la frecuencia de aparición de cada una. De las 25 muestras clínicas, se aislaron e identificaron 37 cepas correspondientes a hongos levaduriformes, de las cuales 31 pertenecían al género Candida. Dentro de este género, el mayor porcentaje correspondió a C. albicans, seguida en frecuencia por C. tropicalis y otras especies que fueron identificadas en menor cuantía. Otros géneros de levaduras de interés clínico encontrados fueron, Torulopsis glabrata (8,1 %) y Trichosporon beigelii (5,4 %). Es de señalar el aislamiento de una cepa de Kloeckera apiculata, nunca antes reportada en nuestro laboratorio.

En la tabla 2 se establece una relación entre el número de especies y el tipo de infección. En sólo 1 paciente (12,5 %), de los 8 con infección primaria, se identificó más de 1 especie a partir del cultivo primario, mientras que en el 30,8 % de los pacientes con infección recurrente coexistieron más de 1 especie en el aislamiento primario.

TABLA 2. Relación entre el número de especies de levaduras y el tipo de infección

 

Asilamiento	Pacientes con infección primaria (%)	Pacientes con infección recurrente (%)
Una especie	7(87,5)	9(69,2)
Más de 1 especie	1(12,5)	4(30,8)
Total	8(100)	13(100)

 Los resultados de la tipificación en AST se observan en la tabla 3. En las 20 cepas de C. albicans aisladas se observaron 4 morfotipos. El morfotipo predominante (65 %) fue el LD1N, seguido por el LD1S con 20 %, los otros 2 morfotipos aparecieron en menor cuantía. Para C. krusei se obtuvieron 2 morfotipos: LD1S y LD1N. En el resto de las especies del género Candida se encontró un mismo morfotipo para cada una de ellas. De los otros géneros de levaduras, sólo las 2 cepas de T. beigelii crecieron y presentaron el mismo morfotipo RAS. Las cepas de T. glabrata y K. apiculata fueron incapaces de crecer en este medio.

TABLA 3. Morfotipos de las 37 cepas de levadura en agar Sabouraud trifeniltetrazolium

 

Especies identificadas (n)	Morfotipos	No. de cepas (%)
Candida albicans(20)	LD1N	13(65)
	LD1S	4(20)
	RD1S	2(10)
	RD2N	1(5)
Candida tropicalis(3)	LV2S	3(100)
Candida krusei(2)	LD1S	1(50)
	LD1N	1(50)
Candida parapsilosis(2)	RV2N	2(100)
Candida kefyr(2)	LAN	2(100)
Candida lusitaniae(1)	LV2N	1(100)
Candida utilis(1)	RD1S	1(100)
Torulopsis glabrata(3)	NC	3(100)
Trichosporon beigelii(2)	RAS	2(100)
Kloeckera apiculata(1)	NC	1(100)

 

DISCUSIÓN

El aislamiento de levaduras de interés médico de la cavidad oral de pacientes portadores del VIH, la identificación de éstas hasta el nivel de especie, así como la tipificación de los aislamientos, adquiere cada día mayor importancia clínica y epidemiológica.

Los reportes de las formas clínicas de candidiasis oral en pacientes VIH/SIDA difieren en cuanto a la forma de presentación predominante. Algunos autores^10,11 reportan prevalencia de las lesiones pseudomembranosas, como ocurrió en nuestro grupo de estudio, en el que 2 de cada 3 pacientes tenían esta forma de presentación. Algunos como Mac Carthy y otros¹² encuentran en su estudio mayor porcentaje de pacientes con lesiones eritmatosas. Ambas lesiones, así como las otras 2 formas clínicas de candidiasis oral, hiperplásica y quelitis angular, no encontradas en nuestro estudio, son reconocidas como importantes marcadores de inmunosupresión y progresión a SIDA en pacientes VIH positivos.¹¹

En 4 muestras de los 25 pacientes estudiados no se obtuvo aislamiento de levaduras. Existen muchos factores que afectan la presencia o cantidad de especies de levaduras en una muestra clínica, entre los que se destacan la existencia o no de lesiones indicativas de candidiasis, el uso de drogas antimicóticas, el sitio de dónde se toman las muestras, así como la técnica y los medios de cultivo utilizados.¹³

Las 4 muestras clínicas en las que no se obtuvo crecimiento procedían de pacientes con lesiones sugestivas de candidiasis oral. El uso de 2 hisopos independientes y la inoculación de 3 medios de cultivo diferentes para cada paciente hacen poco probable que el no crecimiento esté relacionado con la técnica de muestreo o con inhibición del crecimiento por el medio de cultivo. La presencia de levaduras en 2 de estas muestras, observadas al examen directo realizado a partir de la solución salina conservada a 4 EC, sugiere que fue el tratamiento con antifúngicos tópicos, al que estaban sometidos estos pacientes, lo que pudo afectar el crecimiento en todos los medios de cultivo señalados.

Al comparar los medios de cultivo empleados para el aislamiento, encontramos que el APD fue más útil que el AS al ser utilizado como medio de aislamiento inicial, ya que permitió una mayor diferenciación entre colonias y un mayor recobrado final de cepas y de especies de levaduras. El medio AS es el que se utiliza con mayor frecuencia para el aislamiento primario de hongos y levaduras a partir de muestras clínicas¹⁴ y tiene como inconveniente el no permitir una buena diferenciación inicial de las especies de levaduras, lo que trae como consecuencia que cuando se escoge 1 o más colonias para realizar las pruebas de identificación, lo más probable es que sea de la especie más abundante en la muestra, que generalmente es C. albicans.

El AST resultó el medio más eficaz para detectar colonias con variadas morfologías, éste nos indicó la presencia de diferentes especies de levaduras o de diferentes morfotipos de una misma especie. Esto se corresponde con lo reportado por Samaranayake y otros.¹⁵ Sin embargo, de haber utilizado sólo este medio de cultivo no se habría aislado ninguna cepa de T. glabrata.

Los resultados anteriores demuestran la importancia de realizar una adecuada selección de los medios que se van a utilizar para el aislamiento de levaduras a partir de muestras clínicas. Existieron especies que sólo crecieron en 1 de los 3 medios, por lo que si en lugar de emplear esta combinación hubiéramos utilizado sólo 1, como es habitual, el número de cepas obtenidas hubiese sido inferior.

La combinación de los medios APD y AST permitió obtener el máximo de aislamientos y de diferenciación de las cepas en morfotipos. Esto es muy importante cuando se realizan estudios sobre la causa de infecciones recurrentes, pues pudieran interpretarse como nuevas cepas, aislamientos no detectados inicialmente y que persisten al no responder al tratamiento utilizado. Además, estos medios permitieron detectar 2 pacientes en los cuales existió coinfección con 2 cepas de C. albicans de diferentes morfotipos. El análisis posterior de los valores de concentración mínima inhibitoria (datos no publicados) demostró que uno de los pacientes tenía coinfección con una cepa de C. albicans sensible y otra resistente a fluconazol. El predominio del género Candida y en particular la especie C. albicans, en las cepas aisladas, se corresponde con los reportes internacionales.^16,17 No obstante, el porcentaje relativo de esta espeie es inferior a los obtenidos en estudios previos de nuestro grupo (1991, datos no publicados), lo que pudiera relacionarse con el uso actual en nuestro medio del fluconazol como profilaxis, lo cual se ha asociado con la selección de otras especies resistentes a los azoles.^3,18

El mayor número de cepas que coloniza la cavidad oral de los pacientes con infecciones recurrentes en relación con los que presentan una infección primaria resultó ser un hallazgo de interés. Aunque nuestro estudio no establece una relación causa-efecto, la recurrencia se ha relacionado con el estadio evolutivo y está considerada un marcador del grado de inmunosupresión.¹⁹ Estos pacientes fueron sometidos tambien a ciclos repetidos de tratamiento con antifúngicos, y estudios recientes de los patrones de recurrencia confirman que la recurrencia producida por una cepa diferente a la que originó el episodio inicial prevalece en pacientes con tratamiento previo de antifúngicos.²⁰

El morfotipo predominante entre los aislamientos de C. albicans fue el LD1N seguido por el LD1S, lo cual se corresponde con los resultados obtenidos por Quindós y otros en 1992, quienes estudiaron 394 cepas de C. albicans cuyo morfotipo predominante fue el LD1N, con 162 cepas (41,12 %).⁹

El medio agar Sabouraud trifeniltetrazolium, además de ser un excelente medio para el aislamiento inicial de levaduras de muestras clínicas, puede ser usado para tipificar cepas dentro de una misma especie. Este medio no es útil para la identificación de especies de Candida, ya que puede observarse un mismo morfotipo en diferentes especies del género; así sucede con el morfotipo LD1N, que apareció en cepas de C. albicans y C. krusei, al igual que el morfotipo RD1S que se observó en cepas de C. albicans y C. utilis.

Comparado con otros sistemas para la tipificación de cepas, la utilización del presente código basado en 4 caracteres morfológicos, posee la ventaja de ser simple, de bajo costo, no requiere equipamiento adicional y resulta asequible a los laboratorios de escasos recursos.

Este sistema, junto a la serotipificación²¹ y los procedimientos de tipificación al nivel genómico en fase de normalización, dotan a nuestro grupo de trabajo de valiosas herramientas para futuros estudios epidemiológicos mediante la cambinación de varios métodos, como ha sido recomendado.¹⁴

SUMMARY

A study of oral candidiasis was conducted among 25 HIV-positive and AIDS patients. The predominant clinical form of presentation was the pseudomembranous one, whereas the most frequently yeast species found in the isolations were: Candida albicans (54.1 %), Candida tropicalis (8.1 %), and Torulopsis glabrata (8.1 %). It was demonstrated that patients with recurrent infections have colonization of the oral cavity by multiple strains and/or yeast species more often (30.8 %) than those through their first episode of oral candiadisis (12.5 %). Of the 3 culture media used for the initial isolation, the combination of the potato-dextrose agar (PDA) with Sabouraud triphenytletrazolium agar (STA) allowed to obtain the maximum isolation and differentiation among strains. The Sabouraud agar (SA), the most used medium to these ends at the international level, proved to be less useful than the previous ones. The STA was very efficient in the studies of phenotypic typing of most of the isolated yeast species and specially of C. albicans, which will make possible to approach epidemiological studies.

Subject headings: CANDIDIASIS, ORAL/microbiology; AIDS-RELATED OPPORTUNISTIC INFECTIONS/microbiology; YEAST/isolation & purification; YEAST/classification; CULTURE MEDIA; BACTERIOLOGICAL TECHNIQUES; ACQUIRED IMMUNODEFICIENCY SYNDROME/complications; HIV SEROPOSITIVITY/complications.

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Recibido: 25 de marzo de 1997. Aprobado: 14 de julio de 1997. Dr. Gerardo Martínez Machín. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí. Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.