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Introducción
El análisis coproparasitológico es un instrumento relevante que permite la identificación de los parásitos que viven en el tubo digestivo o utilizan las heces como el vehículo normal para la difusión de sus formas al ambiente externo. En parasitología, la inclusión de los diferentes métodos de diagnóstico depende de cada parásito, teniendo en cuenta la variabilidad biológica y morfológica del microorganismo a ser examinado.1,2) Hay varios métodos cualitativos y cuantitativos para el diagnóstico parasitológico, siendo las técnicas de concentración ampliamente empleadas a dicho nivel. Las técnicas de concentración se llevan a cabo con el fin de separar los parásitos de la materia fecal. Tales técnicas no solo aumentan el número de parásitos en el sedimento sino también los desenmascaran, haciéndolos más visibles mediante la eliminación de desechos orgánicos e inorgánicos.3,4,5,6,7
Unas de las técnicas de concentración más empleadas a nivel mundial es la sedimentación en formol-éter (o método de Ritchie). La técnica es adecuada para concentrar enteroparásitos en general, especialmente huevos de tremátodes y quistes de protozoos, en heces con un alto contenido de grasa.7 Sin embargo, esta técnica presenta importantes limitaciones para su implementación dentro de los laboratorios de parasitología debido a que requiere el uso de dos compuestos químicos altamente tóxicos para el analista. Uno es el formol, declarado por la Agencia Internacional de Investigación en Cáncer como un agente carcinogénico para humanos,8 y el otro es el éter, compuesto volátil altamente corrosivo e insumo químico fiscalizado por agencias gubernamentales, debido a su uso en el proceso de producción de cocaína y derivados. Por lo tanto, en un intento por seguir utilizando la técnica dentro de los laboratorios de parasitología, diversos investigadores la han modificado utilizando insumos que no tengan un nivel de toxicidad que comprometa la salud de los analistas y que además presente el mismo rendimiento para concentrar enteroparásitos.9
El Departamento de Ica en Perú, no es ajeno al problema de la enteroparasitosis, la cual se ubica dentro de las primeras diez causas de morbilidad según la Dirección Regional de Salud de Ica.10 Sin embargo, las cifras señaladas probablemente estén subestimadas debido a factores como la falta de registro de casos y el empleo de técnicas adecuadas para la identificación y diagnóstico de las enteroparasitosis, considerando que la mayoría de laboratorios únicamente emplea el examen coproparasitológico directo simple y/o seriado. Por otro lado, el método de Ritchie, es considerado como una de las mejores técnicas para recuperar y concentrar enteroparásitos, pero debido a la accesibilidad limitada de sus insumos, se complica su implementación dentro de los laboratorios de parasitología. En ese sentido, esta investigación tuvo por objetivo comparar tres métodos de concentración de enteroparásitos en muestras fecales humanas.
Métodos
Se diseñó un estudio analítico de corte transversal. A los pacientes atendidos previamente en el laboratorio Arcángel de Ica en Perú y que habían sido diagnosticados de parasitosis intestinal por examen parasitológico seriado y técnica de sedimentación simple, se les invitó a participar en el estudio y se les solicitó una nueva muestra de heces para su evaluación por examen parasitológico simple, técnica de sedimentación y Ritchie modificado. Se estimó el tamaño de muestra por cálculo probabilístico basado en intervalo de confianza para pruebas diagnósticas, considerando una sensibilidad y especificidad esperada de 95 % y 99 %, respectivamente, y una precisión del 5 %. La muestra fue de 154 (127 parasitados y 27 no parasitados) y se calculó con el programa Epidat 4.1. Se excluyeron muestras de pacientes que no cumplieron con aspectos preanalíticos como obtención de material fecal en recipientes no proporcionados por el laboratorio, muestras fecales obtenidas de pañal, muestras con un tiempo de entrega mayor a las 2 h desde su obtención o evidencia de heces mezcladas con orina.
Toma de muestras de heces
Se explicó a los participantes sobre las condiciones preanalíticas de la prueba parasitológica y se les entregó un frasco estéril de polipropileno con boca ancha y tapa rosca para que realizaran la colección de muestra de heces. Se les indicó que las muestras debían ser entregadas al laboratorio en un tiempo no mayor a las 2 h desde su obtención. No se utilizó algún tipo de conservante sobre las muestras de heces, dado que el procesamiento fue realizado de forma inmediata a su recepción.
Parasitológico directo
Se empleó 1-2 mg de heces sobre una gota de suero fisiológico y lugol por separado sobre una lámina cubierta con un cubreobjeto, para evaluar a un aumento microscópico de 10 y 40X.
Sedimentación simple
Se empleo la técnica de Lumbreras y otros (1962), según instrucciones señaladas en el Manual de procedimientos para el diagnóstico de parásitos intestinales del Instituto Nacional de Salud.11 Del frasco con la muestra de heces, se extrajo 3 g de heces aproximadamente y se homogenizó con 5 mL de suero fisiológico. Sobre un vaso de precipitado, se colocó una coladera con dos capas de gasa en la abertura del vaso y la muestras de heces fue filtrada a través de ella. Se retiró la coladera y gasa, y se llenó con agua destilada hasta 1 cm debajo del borde, equivalente a 15-20 veces el volumen de la muestra. Se mantuvo en reposo por 45 min, se decantó las 2/3 partes del contenido del vaso y se añadió nuevamente agua, y por réplicas consecutivas hasta obtener un sobrenadante transparente. Con una pipeta Pasteur, se aspiró la parte media del vaso y se colocó una gota en una lámina portaobjeto con lugol y se observó a 10 y 40X.
Ritchie modificado
Se realizó según las instrucciones del Laboratorio de Ecotoxicología y Parasitología Ambiental de la Universidad de São Paulo, Brasil.9 Se suspendió aproximadamente 2 g de heces en 10 mL de agua, se homogenizó y filtró utilizando doble gasa y embudo que fue sobre un tubo cónico de 15 mL. Se centrifugó el tubo con el filtrado a 2500 rpm por 1 min, para decantar el sobrenadante y añadir 10 mL de agua tibia (45 °C) con 100 μL de detergente neutro (Tween 20). Este paso se repitió por duplicado hasta obtener un sobrenadante limpio. Se decantó el sobrenadante, resuspendió y extrajo 1 gota del sedimento sobre una lámina portaobjeto que contuvo 1-3 gotas de lugol parasitológico. Finalmente, se observó al microscopio a 10 y 40X en toda la lámina. El informe de resultados fue el mismo para todos los instrumentos: en escala de cruces (negativo, ½+, 1+, 2+ y 3+) y dicotómico (presencia o ausencia de estructuras parasitarias).
Análisis estadístico
La comparación de las tres técnicas diagnósticas se realizó con la prueba chi cuadrado de Pearson considerando como diferencia significativa un valor p< 0,05. Además, se empleó la curva ROC para valorar el rendimiento diagnóstico de la técnica de Ritchie modificada, usando como parámetro el valor AUC (área bajo la curva), y su intervalo de confianza al 95 %, los cuales también fueron estimados según sexo y grupos etarios. Todos los cálculos fueron realizados con el programa estadístico Stata corporation versión 14.0
Resultados
De las 27 y 127 personas evaluadas sin y sin parasitosis intestinales, respectivamente, hubo una distribución similar entre el sexo masculino y el femenino en ambos grupos de estudio. La edad en el grupo de parasitados tuvo una mediana de 14 años y en el grupo de no parasitados fue de 11 años.
En la tabla 1 se observa que en el grupo de no parasitados, la técnica que permite la mayor recuperación de estructuras parasitarias fue la de Ritchie modificado, seguido de la sedimentación simple y parasitológico directo; mientras que en el grupo de parasitados, todas las técnicas generaron resultados positivos en diferentes escalas.
En la tabla 2 se agruparon los resultados con presencia de parásitos intestinales y se observa que la técnica de Ritchie modificada obtuvo menor frecuencia de parásitos como E. coli, E. nana y B. hominis; respecto al resto de parásitos intestinales, los resultados fueron iguales.
La técnica de Ritchie modificada presentó el rendimiento diagnóstico más alto en comparación a las otras (Tabla 3).
Tabla 3 Rendimiento diagnóstico de las técnicas parasitológicas
IC95: intervalo de confianza al 95%.
En la figura se muestra el mayor valor AUC de la técnica de Ritchie modificada en comparación a las otras dos. También se observa que la sensibilidad fue de 100 % para las tres técnicas, y mayor especificidad para la técnica de Ritchie modificada, seguida de la sedimentación simple y parasitológico directo.
En la tabla 4, el rendimiento diagnóstico de la técnica de Ritchie fue mayor entre los del sexo masculino, y se presentó el mismo patrón para las otras dos técnicas. En cuanto al grupo etario, el mejor rendimiento diagnóstico para la técnica de Ritchie se obtuvo en los de 40 años a más y en menores de 12 años. Sin embargo, en la sedimentación simple, el mejor rendimiento se obtuvo en aquellos entre 12 y 17 años; mientras que en el parasitológico simple, el mejor rendimiento fue en los menores de 12 años.
Discusión
Las técnicas para el diagnóstico de parasitosis intestinales son muy numerosas y variadas y por ende, la evaluación de parámetros como sensibilidad y especificidad consideran los resultados de una de las dos pruebas a comparar (normalmente la prueba tradicional) o la combinación de los resultados de pruebas diagnósticas como el diagnóstico de oro.12 El mundo de las pruebas de diagnóstico es muy dinámico; las pruebas se desarrollan a un ritmo acelerado, y van surgiendo nuevas tecnologías de diagnóstico.13 Sin embargo, la mayoría de los métodos utilizados para el diagnóstico de parasitosis intestinales en seres humanos han sufrido de muchas modificaciones durante los últimos años, y aun así todavía se utilizan rutinariamente.14
El método de Ritchie es utilizado en laboratorios de parasitología a nivel mundial; sin embargo, su implementación es restringida debido al uso insumos de elevada toxicidad para el analista. En Perú, son pocos los laboratorios que utilizan el método de Ritchie, mientras que la sedimentación simple es más empleada, aunque con desventajas como la presencia de abundante detritus fecales (Fig.), presencia de falsos negativos debido a su baja capacidad para recuperar estructuras parasitarias. Diversas investigaciones coinciden en que el método de Ritchie mantiene su validez, aun cuando se realizan modificaciones en su procedimiento (reemplazo del formol y éter), por otros inocuos (detergentes neutros), con la obtención de valores de sensibilidad y especificidad significativos.15
Nuestros hallazgos confirman lo informado por Almeida y otros,9 pues la modificación del método de Ritchie presentó mayor rendimiento diagnóstico (AUC= 0,87) en la recuperación de estructuras parasitarias que la sedimentación simple (AUC= 0,648), con la presencia además de resultados con diferencias altamente significativas (p< 0,001). Fresco y otros informaron que el método de Ritchie tuvo una sensibilidad del 100 % para identificar infecciones por protozoos en comparación contra la sedimentación simple cuyo valor fue de 68,1 %; estos hallazgos son muy similares a los que alternativamente estimamos, con la obtención de valores de 100 % y 74,1 % para el método de Ritchie y sedimentación simple, respectivamente. Además, se debe señalar que mediante el método de Ritchie modificado se obtuvo mayor frecuencia de personas diagnosticadas con poliparasitismo (48,7 %), en comparación con la sedimentación simple (45,5 %). También hemos evidenciado que el rendimiento diagnóstico de la técnica de Ritchie modificada es mejor entre los varones y menores de 12 años de edad, al alcanzar valores de AUC de 0,933 y 0,867, respectivamente.
Con respecto al método de sedimentación simple, este presentó al igual que el de Ritchie modificado, una sensibilidad del 100%, el cual es ideal como técnica para el cribado de enteroparasitosis en poblaciones en riesgo. Sin embargo, su limitante es la baja especificidad para discriminar los resultados que realmente son negativos. Asimismo, la sedimentación simple ha tenido modificaciones importantes por otros investigadores en Perú, con la obtención de resultados satisfactorios para sensibilidad y especificidad, e incluso a bajo costo.16 Por otro lado, a pesar de no haber realizado un estudio de costos sobre el método de Ritchie modificado, se presume que los costos de los insumos para la técnica modificada resultarían más económicos y de fácil acceso en comparación a los utilizados en la versión clásica de la técnica.
Una de las limitaciones del estudio es no haber realizado un análisis de costos del método de Ritchie original, aunque resulta muy evidente que los insumos para la técnica de Ritchie modificada son menos costosos, los que ofrecen alta factibilidad para su implementación, en forma segura dada la ausencia del uso de sustancias nocivas para la salud de los analistas. Otra limitación tiene que ver con la ausencia de una prueba de oro ideal para el diagnóstico de parasitosis intestinales,17 aspecto que dificulta el diseño muestral.
Analizando los valores obtenidos para el área bajo la curva (AUC), y la figura de la curva ROC, se puede evidenciar claramente que el método de Ritchie modificado es una prueba que presenta un buen rendimiento. En resumen, se concluye que el método de Ritchie modificado resulta una técnica con mejor rendimiento diagnóstico que la sedimentación simple y parasitológico directo, además de su fácil implementación debido al acceso de los insumos utilizados en el desarrollo de la misma.
