Instituto de Hematología e Inmunología

Anticuerpos monoclonales anti-Rh(D): antecedentes y estado actual

Lic. René A. Rivero Jiménez

RESUMEN

Se describen los antecedentes y el estado actual de los anticuerpos monoclonales (AcM) anti-Rh(D). Estos AcM han dado lugar a una vía alternativa de producción de reactivos hemoclasificadores no dependientes de la inmunización deliberada de humanos basada en la tecnología de hibridomas. Los AcM contra el antígeno D son imposibles de obtener en roedores por la poca immunogenicidad de este antígeno en dichas especies, pero los linfocitos B de los humanos sensibilizados con hematíes Rh(D) positivos pueden producir anticuerpos anti-Rh(D) en cultivo de tejidos después de la infección y la transformación de las células con el virus de Epstein Barr (VEB). No obstante, la complejidad de esta obtención viene dada por la existencia de individuos con hematíes con fenotipos D débiles (D^U) que tienen una expresión cualitativamente menor del antígeno y los D parciales (variantes de D) (categorías) donde el antígeno se puede presentar incompleto, ya que carecen de uno o más epítopes del mosaico D "normal", que posee más de 30. Para lograr una especificidad adecuada de un reactivo basado en AcM, este debe reconocer varios epítopes de los más comunes, y usualmente se prefiere una mezcla de anticuerpos clase IgG e IgM. Gracias a la nueva generación de reactivos anti-Rh(D) basados en AcM se ha incrementado la proporción de individuos previamente reconocidos como D^U, que ahora son agrupados por pruebas directas de hemaglutinación como Rh(D) francamente positivos.

Descriptores DeCS: ANTICUERPOS MONOCLONALES; HERPESVIRUS 4 HUMANO; BIOLOGIA MOLECULAR; GRUPOS SANGUINEOS.

Este trabajo trata sobre los antecedentes y avances en la tecnología para obtener reactivos hemoclasificadores anti-Rh(D) basados en anticuerpos monoclonales (AcM) humanos y su significado para corregir errores relacionados con la tipificación incorrecta de la sangre según el grupo Rh, debidos a la poca disponibilidad de reactivos adecuados en algunos países, incluido el nuestro, donde aún no se cuenta con estos productos en toda la red de bancos de sangre.

La producción de antisueros policlonales confiables y de alta calidad para la tipificación de la sangre es una tarea muy laboriosa, que tarda tiempo y depende de la inmunización de seres humanos altruistas que actúan como donantes especialmente sensibilizados, para a partir de su sangre, obtener este tipo de reactivos. En este principio se basa la producción de reactivos hemoclasificadores en Cuba y otros países y el autoabastecimiento de este tipo de reactivos es esencial para el funcionamiento adecuado del Sistema Nacional de Salud. Sin embargo, hay muchas dificultades para obtener reactivos policlonales normalizados a partir de donantes humanos, en particular los reactivos anti-Rh(D) y éstos, por lo general, no detectan a determinadas expresiones parciales del antígeno D.

Fenotipos d débiles y d parciales

Desde 1946, Stratton describió la existencia de hematíes que reaccionaban más débilmente con los antisueros anti-Rh(D) que las células D normales y les llamó hematíes D^U,¹ (actualmente D débiles) y surgieron los términos alto grado y bajo grado, para la clasificación serológica de los fenotipos D^U.² Ya en 1953 se describió el primer ejemplo inequívoco de una aloinmunización anti-D en un individuo D positivo,³ y a partir de este momento, se reconoció que los hematíes de ciertas personas pueden carecer de porciones del mosaico D, y así, estos individuos podrían resultar inmunizados contra epítopes del antígeno D que ellos no poseen. Las células D^U podrían tener todos los epítopes del antígeno D normal, pero en una densidad más baja⁴ o podrían ser tanto cualitativa como cuantitativamente diferentes del D normal, y de ser así, se designan como D parcial.⁵ Hoy se sabe, gracias a los AcM, que el antígeno D cuenta con más de 30 epítopes.⁶ Dos grupos de inves-tigadores han categorizado a los hematíes con antígenos D parciales (variantes de D): Wiener y Unger, que los clasificaron como Rh^A, Rh^B, Rh^C, Rh^D,⁷ y Tippett y Sanger⁸ que los clasificaron en categorías I-VI,⁹ pero ahora se excluye la categoría D^I,⁵ y se incluyen la categoría D^VII y otras como la DFR, DBT, R₀^Har, HMi y HMii.⁶ Ambos estudios visualizan al antígeno D como una estructura tipo mosaico con fenotipos parciales de D que carecen de una o más partes del mosaico D normal. Es probable que los fenotipos D parciales sean más frecuentes en los individuos de la raza negra que en otras poblaciones, en otros países, del 5 al 10 % de los D^U son D parciales (variantes de D).¹⁰ En Cuba la incidencia de fenotipos D parciales no se conoce con exactitud, sin embargo, un ejemplo se encontró en un estudio realizado en 529 pacientes con anemia drepanocítica realizado en el Instituto de Hematología e Inmunología (IHI), donde se detectaron 2 individuos definidos como variantes de D con expresión normal del antígeno D en los hematíes y anticuerpos anti-D (aloinmunizados) en el suero.¹¹ Estos resultados indicaron una incidencia de variantes de D del 0,37 % en este grupo de enfermos, 18 veces más elevada que la informada por investigadores en los Estados Unidos de América, Australia, la región sudoeste de Inglaterra, Francia y Holanda, en estudios realizados en poblaciones de donantes no seleccionados.^12-17 Es muy probable que la incidencia de categorías de D en la población de donantes de Cuba sea alta, si tenemos en cuenta que alrededor del 40 % de los donantes cubanos se clasifican como no blancos. Otro dato que apoya esta hipótesis, que tiene relevancia desde el punto de vista transfusional, está dado por un estudio de embarazadas Rh-negativas, donde se encontró una frecuencia de aloinmunización contra el antígeno D del 4,6 %, en la cual se definió que las transfusiones de sangre fueron la primera causa de esta aloinmunización.¹⁸ Es evidente que la calidad de los reactivos disponibles no es lo suficientemente homogénea y no es capaz de detectar a las variantes parciales del antígeno D en la población de donantes D^U, por lo que no se logra una completa y adecuada compatibilización de la sangre con respecto al grupo Rh, lo que explica la aloinmunización en receptores Rh-negativos. Estos resultados tienen relevancia si tenemos en cuenta que en el grupo de embarazadas aloinmunizadas, el 4 % de los recién nacidos vivos sufrieron de enfermedad hemolítica. La predicción se confirmó posteriormente cuando se encontró un antecedente de transfusiones en el 31,25 % de las mujeres multigestas no protegidas por la inmunoglobulina IgG anti-D y en el 100 % de las primogestas aloinmunizadas.¹⁹ En un estudio preliminar sobre la incidencia de fenotipos D débiles y parciales en 4 339 donantes de sangre de Guanabacoa, se encontró 0,11 % de fenotipos D débiles en los blancos y no se encontraron variantes D en este grupo racial; sin embargo, en los no blancos la frecuencia de D^U fue de 0,43 % y la de D parciales fue del 0,16 %.²⁰ Se sabe que entre los individuos con fenotipos D parciales las expresiones más inmunogénicas son las categorías D^IV, D^V y D^VII, que son detectables como D positivos por los reactivos convencionales clase IgG, mientras que la categoría D^VI es la menos inmonogénica y esto provoca errores en la clasificación de estos donantes.¹⁰ Los eritrocitos de fenotipo categoría D^VI sólo poseen 3 epítopes (según el modelo de los 9 epítopes) de los identificados para el antígeno D; esto explica por qué no se detecta por los reactivos basados en antisueros policlonales obtenidos mediante la inmunización de donantes voluntarios.²¹ ¿Qué reactivos hemoclasificadores anti-Rh(D) serían necesarios para obtener una adecuada compatibilización de la sangre a transfundir? ¿Cómo poder identificar a los individuos con expresión parcial del antígeno D?

Anticuerpos monoclonales hemoclasificadores

Una vía alternativa de producción de hemoclasificadores se basa en la tecnología de hibridomas desarrollada por Köhler y Milstein,²² para la obtención de AcMo murinos y/o humanos. La administración profiláctica posparto de la inmunoglobulina humana anti-Rh(D) en mujeres D-negativas ha provocado una reducción del número de mujeres aloinmunizadas por vía natural.^19,23 Por eso hoy en día es más escasa la fuente de obtención de reactivos hemoclasificadores policlonales humanos anti-Rh(D), pues ahora descansa únicamente en la inmunización de donantes voluntarios (especiales) con los riesgos que este tipo de proceder genera. Pero en la preparación de los AcM contra el antígeno Rh(D), se han observado dificultades adicionales, ya que son difíciles de obtener a partir de sistemas en roedores, por la poca inmunogenicidad de este antígeno en dichas especies. Sin embargo, se ha incursionado con éxito en la generación de AcM anti-Rh(D) humanos.

Transformación de linfocitos con el virus de EPSTEIN BARR (VEB)

Se demostró que los linfocitos B de los donantes sensibilizados con hematíes Rh(D) positivos pueden producir anticuerpos anti-Rh(D) en cultivos de tejidos después de una infección con el VEB.^24,25 La subpoblación de células inmortalizadas por el VEB se describe como formada por células pequeñas, de alta densidad, en reposo o alternativamente como una célula de gran ciclaje,²⁶ pero desafortunadamente, estas líneas celulares linfoblastoides B (LCL-B) usualmente cesan la producción del anti-Rh(D) después de unos pocos meses en cultivo.²⁵ Para obtener líneas celulares humanas secretoras de Igs más estables, varios investigadores han intentado la estabilización mediante la fusión con una línea de mieloma murino. Otras fusiones emplearon linfocitos B obtenidos del bazo, ganglios linfáticos, o sangre periférica.²⁷ Para estas fusiones se usaron las líneas de mieloma de ratón NS1 o SP1. También se publicó en la solicitud de patente No. 85/02413 de la PCT,²⁸ la fusión de linfocitos B de sangre periférica transformados por el VEB con un hetero-hibridoma, formado por una célula de mieloma humano y la de ratón X63-Ag8.653 y la obtención por esta vía de líneas secretoras de AcM anti-Rh(D), de las clases IgM o IgG. Por otra parte, en la solicitud de patente No. 0251440 de la EPO,²⁹ se informó que se pueden obtener hetero-hibridomas que cultivados en condiciones apropiadas, permiten obtener títulos de AcMo anti-Rh(D) en ausencia de Ig de ratón, mediante la fusión de una línea celular de mieloma de ratón no secretora de Igs, directamente con linfocitos B humanos transformados con VEB y obtenidos de donantes hiperinmunes para el antígeno Rh(D), con más de 20 m g de anticuerpos anti-Rh(D)/mL/24 horas cuando se cultivan a una concentración de 1x10⁶cel/mL.

Se sabe que sólo 1 en 10³ ó 10⁴ de los linfocitos B de sangre periférica de los donantes hiperinmunes para el Rh(D) son secretores de anticuerpos anti-Rh(D). La transformación con VEB de los linfocitos B de los donantes Rh(D) negativos inmunizados por vía natural o deliberadamente con el antígeno Rh(D), facilita la selección según los criterios de un crecimiento vigoroso en cultivo y alto título de anticuerpos anti-Rh(D) in vitro, antes de llevar a cabo la fusión con la línea de mieloma. Los linfocitos B transformados por VEB se conoce que tienen una frecuencia de fusión superior con la línea X63-Ag8.653, si se compara con los linfocitos B no transformados con VEB bajo idénticas condiciones.²⁸

Reactivos anti-rh(d) que reconocen fenotipos d débiles y a las variantes D

Una de las dificultades en la clasificación parcial de los hematíes D es la escasez de reactivos adecuados, los cuales se han obtenido del suero de individuos con fenotipos parciales de D que se han aloinmunizado anti-D, o a través de los AcM. Aunque los primeros AcM humanos clase IgG obtenidos en el mundo^30,31 no fueron superiores a los sueros policlonales y fallaban en la detección de los fenotipos D débiles y de las variantes D,³² la obtención de AcM clase IgM anti-D estables, como los clones MAD-2 y FOM-1³³ provocó un cambio radical en la serología del sistema Rh. Estos AcM dieron lugar a reactivos con altos títulos de anticuerpos, que trabajan bien tanto a temperatura ambiente como a 37 °C, que unidos a los AcM clase IgG, desarrollados al final de la década del 80,^27,34 han convertido a los hemoclasificadores basados en AcM humanos en los productos de elección para la clasificación sanguínea en el sistema Rh.

En relación con los requerimientos de especificidad, por la complejidad del antígeno Rh(D), muchos consideran que un buen hemoclasificador no se debe elaborar sobre la base de un solo AcM, sino que es preferible una mezcla, por lo que hay que evaluar mediante la prueba de antiglobulina (prueba de Coombs) la presencia de la variante D^U en casos críticos del estudio del grupo Rh(D) negativo y utilizar células D^U en el panel celular, para la generación de reactivos basados en AcM anti-Rh(D), con vistas a monitorear su calidad. Con la nueva generación de AcM reactivos anti-Rh(D) se ha incrementado la proporción de individuos previamente reconocidos como D^U (débil D, positivo por prueba de antiglobulina indirecta) que ahora son agrupados por pruebas directas de hemaglutinación como Rh(D) francamente positivos. Sin embargo, el primer requisito de un reactivo anti-Rh(D) debe ser que de forma segura y sin ambigüedades aglutine a los hematíes que aparentemente expresan un complemento completo de epítopes D, por lo cual la mayoría de los expertos considera que la prueba de antiglobulina indirecta no es ya esencial para la detección de los débiles D positivos (D^U), siempre que se usen AcM que reconozcan a esta expresión, aunque para obtener la licencia o registro sanitario no es necesario que los reactivos anti-Rh(D) detecten a todas las variantes de hematíes D débiles o parciales. Se insiste en la necesidad de un panel celular internacional para la evaluación definitiva de estos reactivos y la obtención de AcM en diferentes países, lo que sin dudas contribuirá a su más rápida creación.³⁵

Entre los aportes más recientes, 5 trabajos describen AcM con reactividad con hematíes D parciales, 3 AcM con actividad contra la categoría D^VI,uno que no se podía mantener en cultivo por más de 3 meses,³⁴ otro con una reactividad muy débil³⁶ y un tercero con reactividad anti-D^VI y crecimiento celular estable.³⁷ Los AcM anti -Rh(D) producidos a partir de cultivos de larga duración por otros 2 grupos, no reaccionan con las categorías D^VI, ^27,33 y el trabajo de Leader y otros,¹⁵ que describe 3 AcM humanos con reactividad contra la categoría D^VI y uno, el AcM H-26, que se enlaza tanto a los hematíes con fenotipo D^VI como D normal.

Por otra parte, en relación con su uso como elementos terapéuticos en humanos, ya se han obtenido AcM humanos anti-Rh(D) que se pueden utilizar como inmunizantes pasivos anti-D para la prevención de la enfermedad hemolítica del recién nacido. En su excelente revisión sobre este novedoso tema, Fletcher y Thomson³⁸ describen los ensayos que se han llevado a cabo para evaluar in vitro a los AcM humanos anti-D, que incluyen la medición de la adherencia de los eritrocitos sensibilizados con estos anticuerpos a los receptores Fc de las células efectoras (por ejemplo, mediante rosetas), la fagocitosis por los monocitos de los eritrocitos sensibilizados o la lisis citotóxica de estas células por efectores a través de ensayos de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), y también por quimioluminiscencia se ha evaluado la respuesta metabólica de los monocitos durante la fagocitosis de los eritrocitos sensibilizados con AcM anti-D. Así se ha visto que los monoclonales clase IgG3 son más eficientes que los IgG1 en varios ensayos, incluyendo la formación de rosetas, la ADCC mediada por monocitos, la adherencia y la fagocitosis. También se han descrito las características que deben reunir los AcM anti-D para ser buenos agentes terapéuticos, tales como especificidad, potencia, afinidad, grado de glicosilación, y ausencia de reactividad cruzada con otros tejidos humanos. Finalmente, los ensayos clínicos en curso, permitirán obtener los datos necesarios para obtener los permisos de las agencias reguladoras.^37,38

Otras alternativas para la obtención de AcM

Los anticuerpos humanos se pueden generar también por la tecnología recombinante.^39,40 El repertorio de las inmunoglobulinas humanas se puede copiar de manera muy efectiva según la tecnología de despliegue de fagos de los genes V. Con el uso de estas técnicas, los genes que codifican para los dominios variables de un anticuerpo de interés, se pueden capturar del repertorio de las células B. Con estos genes V se pueden obtener moléculas de reconocimiento inmunológico por una estrategia de diseño y construcción. Estos descubrimientos recientes aportan una oportunidad única para estudiar la estructura molecular de la región variable de los anticuerpos contra los antígenos en células sanguíneas, y estos estudios podrían dar la posibilidad de desarrollar nuevas estrategias, incluso terapéuticas, para la prevención y eliminación de la enfermedad hemolítica del feto y del recién nacido.⁴¹

Un producto muy atractivo de esta tecnología son los fragmentos de Ac producidos en microorganismos a partir de bibliotecas de fagos con aplicación en la inmunohematología.^43,44 Esta tecnología, al utilizar microorganismos como célula productora, facilita y abarata en gran medida el proceso de escalado. Estas opciones, basadas en la ingeniería genética, serían otra alternativa para la obtención de Ac anti-(D) en sustitución de los que se obtienen a partir de los donantes sensibilizados.

Comentarios finales

Los aportes de la biología molecular al entendimiento de la complejidad antigénica del sistema Rh y los avances alcanzados en la serología, gracias a los AcM, han permitido tener hoy por hoy un mejor conocimiento de este sistema de grupos sanguíneos. En este sentido, los AcM están contribuyendo decisivamente a la definición de algunos antígenos sanguíneos cuyas características estructurales son desconocidas y al conocimiento de la expresión de los antígenos sanguíneos en los diversos tejidos y su relación con la significación funcional de estos antígenos, que obviamente nada tiene que ver con las transfusiones, y probablemente está muy relacionado con los procesos de diferenciación y crecimiento celular.⁴⁵ En el IHI se desarrolla en la actualidad un proyecto de investigación para la obtención de AcM anti-Rh(D) que sean adecuados para el escalado industrial y la formulación de estos reactivos, y la firma CIMAB SA ha iniciado la distribución de pequeños volúmenes de reactivos monoclonales anti-Rh(D) elaborados a partir de sobrenadantes (de cultivo de células B transformadas por el VEB) importados desde el extranjero.

SUMMARY

Antecedents and present state of Anti-Rh (D) monoclonal antibodies (MAB) are described. Theses MAB have give rise to alternative way of production of non-dependent hemoclassifiers of deliberate immunization of humans, based on hybridomes technology. The MAB to D antigens are impossible to obtain in rodents because of low immunogenicity of this antigen in such species, but human B lymphocytes sensitized with positive Rh (D) red cells, may produce anti-Rh (D) antibodies in tissue culture after infection and cell transformation using Epstein Barr virus (EBV). Nevertheless, complexity of this obtention is in ciew of existence of individuals carriers of red cells with weak D phenotypes (D^u) showing an expression qualitatively minor of antigen, and partials D(variants of D) (category), where presentation of antigen may be incomplete, since they lack of one or more epitopes of "normal" D mosaic, which has more than 30. To obtain a proper specificity of a reagent based on MAB, this must recognize some of the commonest epitopes, and usually is prefered a mixture of class IgG and IgM antibodies. Thaks to the fact that there is a new generation of anti-RH (D) reagents, based on MAB, it was possible increase in ratio of individuals previously recognized as D^u, that at present time are grouped by hemagglutination direct tests as Rh (D) obviously positives.

Subject headings: ANTIBODIES, MONOCLONAL; HERPESVIRUS 4, HUMAN; MOLECULAR BIOLOGY; BLOOD GROUPS.

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Lic. René A. Rivero Jiménez. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Teléf: (537) 578268. Fax: [phone]. e mail:[e-mail]