Instituto de Hematología e Inmunología

Estudio de la compatibilidad por métodos serológicos (HLA) y celulares (CML) en 22 años de trabajo en el Instituto de Hematología e Inmunología

Lic. Luz M. Morera Barrios,1 Dr. Catalino R. Ustáriz García,1 Lic. Ana M. Guerreiro Hernández,1 Lic. Lázaro O. del Valle Pérez,1 Dra. Consuelo Macías Abraham,1 Dra. Marta Paradoa Pérez 2 y Dra. Elvira Dorticós Balea1

Resumen

Se estudió la histocompatibilidad de los loci ABC y del locus D del sistema principal de histocompatibilidad mediante las técnicas serológicas de microlinfocitotoxicidad en 383 pacientes con diferentes enfermedades hematológicas. Se realizó una comparación por la técnica celular y la reactividad linfocitaria en el cultivo mixto de linfocitos (CML), en 39 de los 145 individuos idénticos para los antígenos HLA, tomados de los estudios familiares realizados en el IHI. Resultaron 29 CML negativos, para el 74,35 %. No se corresponden en el 100 % los estudios serológicos y celulares, ya que no se compatibilizó en todos los casos para los antígenos HLA de clase II, y en ninguno para los antígenos menores de histocompatibilidad, que influyen tanto en los resultados del CML y en las causas de fracaso del trasplante de médula ósea (TMO) en individuos idénticos. Esto corrobora la importancia de los estudios de tipificación de biología molecular y antígenos menores de histocompatibilidad.

DeCS: ANTIGENOS HLA / genética; ANTIGENOS DE HISTOMPATIBILIDAD; TEST SEROLOGICOS; TRASPLANTACION DE MEDULA OSEA; TRANPLANTACION HOMOLOGA.

El complejo principal de histocompatibilidad (CPH) es una región genética que alberga genes altamente polimórficos, cuyos productos se expresan en una gran variedad de células. Las proteínas codificadas por la región del CPH que se denominan "moléculas" o "antígenos" son una barrera formidable al éxito de los trasplantes e injertos, cuando el donante y el receptor presentan diferencias en esta región genética. 1

La histocompatibilidad entre individuos puede definirse mediante reacciones serológicas y celulares. Hay múltiples técnicas para las pruebas serológicas, pero la más usada es la técnica de microlinfocitotoxicidad de Terasaki 2 y la celular más usada es el cultivo mixto de linfocitos (CML), considerado como el modelo in vitro para el reconocimiento in vivo del rechazo al alotrasplante. 3

El uso clínico fundamental del CML y la técnica de tipaje serológico, consiste en la selección de un donante compatible para el trasplante de tejidos y de órganos entre individuos vivos relacionados, especialmente hermanos consanguíneos. 4,5

Múltiples evidencias indican que los antígenos de clase II constituyen fuertes aloantígenos para la formación de anticuerpos, para la proliferación de las células T en el CML y para la citotoxicidad mediada por células. 6-8

Numerosos investigadores consideran que otros genes están también comprometidos en la estimulación del CML, y que diferencias en las regiones HLA: A y B causan estimulación. Los anticuerpos dirigidos contra determinantes antigénicos codificados por estas regiones, son capaces de inhibir las funciones estimuladoras y respondedoras en el CML. 9-!2

Se ha comprobado que hay otros antígenos HLA menores que crean disparidad y desarrollo de la enfermedad de injerto contra huésped en el TMO. 13,14

Desde la década de los 80 en nuestro país se desarrolló el TMO por lo que los estudios relacionados con la histocompatibilidad resultan de gran interés.

El objetivo de este trabajo fue estudiar la histocompatibilidad por los métodos serológico y celular entre posibles receptores y donantes de médula ósea, así como comparar la reactividad linfocitaria en el CML con el grado de compatibilidad entre donante y receptor para los antígenos clase I (A;B;C).

Métodos

Se estudió la histocompatibilidad de los antígenos HLA en estudios familiares de 383 pacientes con diferentes enfermedades hematológicas y su posibles donantes consanguíneos (hermanos), mediante el método de microlinfocitotoxicidad descrito por Terasaki y recomendadas por el NIH. 2

Posteriormente a los estudios que resultaron compatibles se les realizó histocompatibilidad del locus D entre donante- receptor por la técnica del CML. 3

Los estudios serológicos y del CML corresponden al trabajo de 22 años del Instituto de Hematología e Inmunología (IHI).

Resultados

Se realizaron 383 estudios familiares de tipaje HLA, por técnica serológica; se encontraron 145 pacientes con hermanos HLA idénticos como donantes de médula ósea.
Posteriormente se realizó CML a 39 casos de los que fueran HLA idénticos; se reportaron 29 CML negativos, para el 74,35 % (tabla ).

Tabla. Prueba del CML entre individuos relacionados HLA idénticos

	Fenotipo HLA
Número	L o c u s A		L o c u s B		CML
1	3	10	35	-	P
2	10	-	12	-	P
3	10	-	5	18	N
4	2	29	35	-	N
5	2	10	5	-	N
6	2	3	12	27	N
7	10	-	35	-	N
8	3	10	35	-	P
9	3	24	21	35	P
10	2	9	12	-	N
11	1	2	5	-	N
12	2	10	7	-	N
13	19	-	8	-	N
14	2	9	5	15	N
15	2	28	12	-	N
16	2	11	15	-	N
17	9	19	8	18	P
18	28	-	35	12	N
19	2	9	8	12	P
20	28	19	39	-	N
21	9	11	12	-	N
22	9	11	17	35	N
23	3	30	5	7	P
24	10	-	35	-	N
25	2	-	5	-	N
26	1	-	12	-	N
27	9	10	7	-	N
28	10	11	18	44	N
29	9	-	38	14	N
30	1	9	8	-	N
31	2	-	15	-	P
32	9	-	15	-	P
33	2	-	12	-	N
34	9	-	35	21	P
35	2	-	14	16	N
36	1	2	5	8	N
37	11	-	5	-	N
38	1	2	7	35	N
39	3	9	40	7	N

    Leyenda: -: no identificado; P : positivo; N : negativo.

Luego por el criterio clínico se realizaron 14 TMO alogénicos en el IHI.

Discusión

Los resultados de los tipajes familiares HLA concuerdan con lo que plantean las leyes mendelianas que 25 % de los hermanos son idénticos. En el caso nuestro, de 383 estudios familiares 145 fueron compatibles, que representa el 37,8 %, pero debemos señalar que se utilizó la técnica serológica, que no es tan específica como las de biología molecular que discriminan los alelos en cada uno de los antígenos. 14

Los CML entre individuos idénticos para los loci estudiados, concuerdan con lo encontrado con diferentes autores, 15 si se tiene en cuenta la mayor probabilidad genética de que estos pacientes y sus posibles donantes muestren identidad fenotípica para los antígenos de clase II del locus que mide las diferencias DR, DQ entre las células del donante y del receptor.

Diversas consideraciones pueden explicar las reacciones positivas o dudosas que se observaron en este grupo:

El polimorfismo genético del sistema HLA con varios loci aún no definidos, de manera tal que no todos los determinantes antigénicos y alotipos importantes para la estimulación del CML fueron identificados. 16

La existencia de otros loci estrechamente ligados al sistema HLA (aloantígenos no HLA), que controlan o que sean responsables de la estimulación linfocitaria junto con los antígenos del sistema principal de histocompatibilidad. 17

La selección de donantes HLA idénticos no garantiza la presencia de CML, e incluso siendo CML negativos, pueden desarrollar enfermedad de injerto contra huésped (EICH).

Se ha comprobado que el 80 % de los que se han seleccionado por serología y entre el 15 y 35 % de los pacientes por DNA, pueden tener EICH. Entre los factores que contribuyen, se ha sugerido que los antígenos menores (mHag), son un riesgo potencial para ambas situaciones en pacientes que requieren inmunosupresión prolongada. Los mHag inducen las puestas intensas de TC y TH restringidas por moléculas del CPH. 18,19

Los estudios inmunogenéticos han demostrado que algunos mHag están presentes con una frecuencia del 69 al 95 %, y otros entre el 7 y 16 % en la población sana. Se heredan en forma mendeliana e independiente del los antígenos HLA. 20,21

En estudios familiares se comprobó que factores ambientales como infecciones microbianas, embarazos y transfusiones de sangre, pueden provocar intolerancias específicas a ciertos determinantes antigénicos, a causa de una preinmunoinmunización a aloantígenos linfocitarios no HLA, y es el CML positivo el reflejo de una respuesta de memoria inmunológica in vitro. 22- 25

Diversos autores demostraron que anticuerpos presentes en eluídos plaquetarios, con especificidad para los determinantes antigénicos HLA de clase I, pueden inhibir las funciones estimuladoras y respondedoras en la prueba del CML. 26

Nuestro trabajo corroboró la importancia de la histocompatibilidad de los loci de clase I y II por las técnicas más avanzadas, ya que se ha comprobado que los antígenos de clase II son los máximos responsables de la estimulación en el CML.

Se plantea que el tipaje serológico y el CML son una solución para poder compatibilizar estudios familiares, pero no podemos olvidar que las técnicas de biología molecular son las óptimas y representan una mayor seguridad a la hora de decidir un TMO.

Agradecimientos

A la Técnica Mayra Agüero Martínez por su labor abnegada, sin la cual no hubiera sido posible la realización de este trabajo.

Summary

Compatibility study by serological (HLA) and cellular methods (MLC) during 22 years of work at the Institute of Hematology and Immunology
The histocompatibility of the loci ABC and of the locus D of the main histocompatibility system was studied by the serological techniques of microlymphocytoxicity in 383 patients with different hematological diseases. A comparison was made in 39 of the 145 identical individuals for the HLA antigens obtained from the family studies conducted at the Institute of Hematology and Immunology by using the cellular technique and the lymphocytary reactivity in the mixed lymphocyte culture (MLC). 29 MLC proved to be negative, accounting for 74.35 %. There was not a 100 % correspondance between the serological and cellular studies, since it was not compatibilized in all cases for class II HLA antigens and in no case for the minor histocompatibility antigens that influence on the results of the MLC and on the causes of the failure of bone marrow transplantation (BMT) in identical individuals. This confirms the importance of the typing studies of molecular biology and minor histocompatibility antigens.

Subject headings: HLA: ANTIGENS/ genetics; HISTOCOMPATIBILITY ANTIGENS; SEROLOGIC TEST; BONE MARROW TRANSPLANTATION; TRANSPLANTATION, HOMOLOGOUS.

Referencias bibliográficas

1. Bodmer WF. HLA polymorfhism: origen and maintenance. En: Bidwell JL Navarrete C, eds. Histocompatibility testing. London: Imperial College Press; 2000. p. 1- 9.
2. Terasaki L. Microdoplet testing for HLA- B-C and- D antigens. J Clin Pathol 1978: 69-105.
3. Stiller CR, Sinclair NR. Monitoring of rejetion. Trasplant Proc 1979; 11: 343.
4. Hamberger J, Crosnier T, Descamps B, Rowins KA. The value of present methods use for the selection of organ donors. Trasplant Proc 1971; 3: 260- 79.
5. Dupont B, Hansen JA . Human mixed lymphocyte culture reaction: genetics, specificity and biological implications. Adv Inmunol 1976; 26: 107- 12.
6. Cresswell P. Assembly, transport and function of MHC class II molecules. Annu Rev Immunol 1994; 12: 259-94.
7. Ettenger RB, Terasaki PI, Tinga A, Malekzadeh MH, Pennisa AJ, Ulterbaguart C, et al. Anti- B lymphocytotoxins in renalallograft rejetion. N Engl J Med 1976; 295: 35-9.
8. Thoraby RD, Albreschtsen D, Hirchberg H, Kaukinen A, and Solheim B G : MLC- activating HLA-D determinants: Identification, tissue distribution and significance. Transp Proc 1977; 9.
9. Germain RH, Marguilles DM. The biochemistry and cell biology of antigen processing and presentation. Annv Rev Immunol 1993; 11: 403- 50.
10. Sherman LA, Chattopadhyay S. The molecular basis of allorecognition. Annv Rev Immunol 1993; 11: 385- 402.
11. Bijnen AB, Schreurder I, Volkers W S, Parteulie TJ, Van Rood JJ. The lymphocyte activating influence of the HLA region. J Immunogenet 1977: 1-5.
12. Dupon B. Two separate genes controlling stimulation in mixed lymphocyte reaction in man. Proc Natl Acad SC; (USA) 1979; 71: 52-6.
13. Tseng Llt, Lin MT, Hansen JA, Gooley T, Pei J, Smith AG, et al. Correlation betwen disparity for the minor histocompatibility antigen HA-1 and the development of acute graft- versus- host disease after allogeneic marrow trasplantation. Blood 1999; 94 (8): 2911-4.
14. Ota M, Seki T, Fukushima H. HLA- DR Bl genotyping by modifed PCR- RFLP method combined with group specific primers. Tiss Antig 1992; 32: 180-9.
15. Keuning JJ. LD (MLC) population and family studies in a Dutch, population. Histocompatibility testing 1975: 533-8.
16. Schreder GM, Hurley CK, Marsh SGE, Lau M, Maiers M, Kollman C, et al. The HLA dictionary 1999: Summary of HLA-A-B-C, -DRB1/3/4/5, -DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-a, -B, -C, -DR and -DQ antigens. Tissue Antigens 1999; 54:409-37.
17. Godoresky C. Papel de la Inmunogenética en la distribución y frecuencia de las enfermedades tropicales. En: Valdespino JL, Velasco GO, Escobar CA, Rio GA del, Ibañez ZS, Magas C, eds. México DF: Indre, SSA; 1994. p. 67-82.
18. Goulmy E. Human minor histocompatibility antigens. Curr Immunol 1996; 8: 75- 81.
19. Visentainer JE, Lieber SR, Persoli LB,de Souza Lima SC, Vigorito AC, Aranha FJ, et al. Correlation of mixed lymphocyte culture with chronic graft- versus host disease following allogeneic Stem cell transplantation. Br AZ J Med Biol Res 2002; 35 (5): 567- 72.
20. Goulmy E, Schipper R, Pool J. Mismatches of minor histocompatibility antigens between HLA identical donor and recipent and the develofment of graft versus- host disease after bone marrow transplantation. N Engl J Med 1996: 334; 281-5.
21. Goulmy E. Nature of minor histocompatibility antigens. V.2. En: Genetic Diversityof HL. Funtional and Medical Implication. Vol II. Paris: Ed. D.Charron; 1997. p. 39-41.
22. Shoskes DA, Wood KJ. Indirect presentation of MHC antigens in transplantation. Immunol Today 1994; 15: 32-8.
23. Rocc KL. A new foreign policy: MHL clas I molecules monitor the out side word. Immunol Today 1996, 17: 131- 7.
24. Jaraquemada D, Martin M, Long EO. AN endogenous processing patway in vaccinia virus infected cells for presentation of cytoplasmic antigens to class II restrited T cells. J Exp Med 1990; 172: 947-54.
25. Eijsvoogel VP. Mixed lymphocyte cultures and HLA. Trasplant Proc 1971; 1: 85- 90.
26. Jonker M, Van Rood J. Can anti HLA- A and- B antibodies inhibit the MLC test? Tiss Antig 1978; 11; 251- 5.
    

Recibido: 15 de agosto del 2003. Aprobado: 20 de agosto del 2003.
Lic. Luz M. Morera Barrios. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Tel [phone], 544214. Fax [phone]. e-mail: [e-mail]

1 Instituto de Hematología e Inmunología. Ciudad deLa Habana, Cuba.
2 Hospital Pediátrico "Juan Manuel Márquez". Ciudad deLa Habana, Cuba.