Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras"

Obtención y procesamiento de células progenitoras hematopoyéticas periféricas

Dr. Jesús Diego de la Campa,1 Dr. Adalberto Ballester Santovenia,1 Dr. José Carnot Uría,1 Dr. Alejandro Álvarez,2 Lic. Margarita Quiala Reyes,1 Lic. Lourdes Morera Carrillo3 y Lic. Mayra Pérez Pérez1

Resumen

Se realizó un estudio descriptivo de la totalidad de las colectas de células progenitoras hematopoyéticas realizadas en el Banco de Sangre del Hospital "Hermanos Ameijeiras" desde abril del 2001 hasta abril del 2002, mediante leucoféresis. Se utilizó un equipo de flujo continuo (FRESENIUS ASTEC 204) y se empleó el programa mononucleares con el set P1Y. Se determinó peso, talla, hematócrito, hemoglobina, conteo de leucocitos y plaquetas de los donantes previo a la colecta. En el producto de la leucoféresis se analizó el conteo de leucocitos con diferencial, conteo de células CD34+/ CD45+ (mediante técnica de inmunofluorescencia en citómetro de flujo) y determinación de viabilidad celular con yoduro de propidio en este mismo equipo (Facscan, Becton Dickinson). Recibieron trasplante autólogo 5 pacientes y 2 trasplantes alogénicos. Los primeros con diagnósticos de: linfoma no hodgkiniano (3), enfermedad de Hodgkin (1), artritis reumatoidea (1); y los segundos afectados de leucemia mieloide crónica (1) y linfoma no hodgkiniano (1) ; todos ellos atendidos en el Servicio de Hematología de nuestro centro. La media del conteo de células CD34+ por cada leucoféresis para trasplante autólogo fue 2,4 x 106 Kg y en el alogénico 2,96 x 106 Kg . Los resultados evidencian que mediante el ajuste del volumen de los ciclos, la velocidad centrífuga, el volumen de rebosado y el volumen celular, se obtuvo un conteo de células precursoras hematopoyéticas en la colecta similar a lo reportado por otros autores, lo que garantiza que el producto transfundido cuente con la celularidad necesaria para repoblar la médula ósea, luego que el paciente sea tratado con altas dosis de terapia inmunosupresora y/o radiaciones.

DeCS: LEUCAFERESIS; TRASPLANTACION AUTOLOGA; TRASPLANTACION HOMOLOGA; ANTIGENOS CD34; CELULAS DE LA MEDULA OSEA/ trasplantacion; TRASPLANTACION DE CELULAS.

Las células progenitoras hematopoyéticas (CPH) son capaces de reconstruir de manera integral la hematopoyesis, se caracterizan además por su capacidad de autoduplicarse, por la expresión de los antígenos CD34, CD45RaO y tHY-1. La tinción con rodamine 123 es débilmente positiva, y no hay expresión de antígenos mieloides y linfoides T y B ni de antígenos HLA-DR. Representan aproximadamente del 1 al 2 % del total de células de la médula ósea y en condiciones normales la décima parte de este total circula en sangre periférica. 1

El trasplante de células progenitoras hematopoyéticas de sangre periférica (TCPH) es una variante del trasplante de progenitoras hematopoyéticas de médula ósea (TMO) que se ha desarrollado gracias a la disponibilidad de los factores de crecimiento hematopoyéticos; mediante su uso se ha logrado incrementar la concentración de estas células en sangre periférica hasta 25 veces y en esta fase, las células progenitoras (CP) son coleccionadas por una o múltiples leucoféresis de flujo continuo.2

Este proceder se ha desarrollado principalmente en el campo de la oncohematología para el tratamiento de hipernefromas, inmunodeficiencias congénitas, mieloma múltiple, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, linfoma no hodgkiniano, enfermedad de Hodgkin y artritis reumatoidea, 3-7 y son más frecuentes los trasplantes autólogos, en los que el paciente es al mismo tiempo el donante y el receptor de estas células, que son responsables del "injerto" postrasplante, aunque en los últimos años se han incrementado los trasplantes alogénicos, en los que el donante suele ser un familiar del paciente. 8

Para la obtención de las CP no es necesario trasladar al paciente a la unidad quirúrgica ni aplicar anestésico alguno; la recuperación hematológica se obtiene en un tiempo menor que el observado en el TMO, y por lo tanto, disminuye el empleo de componentes de la sangre, acortando la estancia hospitalaria, lo que conlleva a que sea menos costoso. 9 Por todo lo anterior, en nuestro hospital se introdujo esta técnica. Con este trabajo nos propusimos determinar el contenido de células CD 34 positivas obtenidas por leucoféresis y exponer los resultados de las colectas en los 7 primeros pacientes sometidos a TCPH.

Métodos

Se realizó un estudio descriptivo donde se evaluaron los resultados de las leucoféresis realizadas desde el mes de abril del 2001 (fecha de introducción del método), hasta abril del 2002, en el Banco de Sangre del Hospital "Hermanos Ameijeiras", las cuales se emplearon en 7 pacientes sometidos a TCPH (autólogos 5 y alogénicos 2) . Los primeros con diagnóstico de linfoma no hodgkiniano (3 casos), enfermedad de Hodgkin (1), artritis reumatoidea (1), y los segundos afectados de leucemia mieloide crónica (1 paciente ) y linfoma no hodgkiniano (1). Todos ellos fueron atendidos en el Servicio de Hematología de nuestro hospital.

La colección de células progenitoras hematopoyéticas (CPH) fue realizada mediante leucoféresis de flujo continuo, con el empleo de una máquina separadora de células FRESENIUS ASTEC 204, con el programa de monucleares y el set P1Y, el cual es un sistema cerrado con una cámara de separación de una sola etapa y que realiza las fases siguientes:

• Fase de separación: la sangre total anticoagulada con ACD-A es separada en plasma rico en plaquetas (PRP), eritrocitos y leucocitos, El PRP y los eritrocitos son devueltos continuamente al donante. Los leucocitos, y entre ellos las células progenitoras, se mantienen en la cámara de separación. Al final del ciclo el flujo sanguíneo disminuye y las células son concentradas.
• Fase de spillover o de rebosado: mediante un alto flujo de plasma los leucocitos son bombeados por la bomba de plasma hacia la salida de la cámara de separación.
• Fase de colección: inmediatamente después del spillover, la bomba de células comienza a impulsar las células fuera de la centrífuga hacia la bolsa colectora.
  

En las leucoféresis de gran volumen (procesamiento de más de 3 volemias o más de 15 L de sangre ), empleamos 10 U de heparina sódica por cada mililitro de ACD-A y directo en la bolsa colectora adicionamos 40 cc de esta dilución. La relación ACD/ST fue de 25/1. En las leucoféresis convencionales (procesamiento de menos de 3 volemias), no empleamos heparina, y la relación ACD/ST fue de 12/1.

La profilaxis de la hipocalcemia consistió en la administración el día antes de 1 g de carbonato de calcio por vía oral (8:00 a.m. y 8:00 p.m.) y luego 1g cada 1 hora mientras duró la colecta. En las leucoféresis de gran volumen además se administraron 2 ámpulas de gluconato de calcio al 10 % diluidas en 1 000 cc de solución salina al 0,9 % a través de una vena periférica .

Como factor estimulante de la hematopoyesis, para lograr la movilización de las CPH, empleamos factor estimulante de colonias granulocíticas (FSC-G) en dosis de 10 µg x Kg dividido en 2 subdosis; a los donantes para trasplante alogénico se les suministró desde 3 días antes de la colecta y hasta el día de la última leucoféresis; en el trasplante autólogo desde 4 días antes de la colecta y hasta el día de la última leucoféresis.

La colecta de CPH se transfundió de inmediato en el caso de los trasplantes alogénicos, y en los autólogos se conservó entre 4 y 8 ºC hasta un máximo de 69 horas, tiempo en el que el paciente es sometido a régimen condicionante.

A la totalidad de los donantes de células progenitoras hematopoyéticas se les realizó determinación de peso, talla, hematócrito, hemoglobina, conteo de leucocitos y plaquetas previamente a la colecta.

Al producto de la leucoféresis se le realizó conteo de leucocitos con diferencial, conteo de células CD34+/ CD45+ mediante técnica de inmunofluorescencia en citómetro de flujo y determinación de viabilidad celular con yoduro de propidio en este mismo equipo (Facscan, Becton Dickinson) en el momento de la colecta, y al ser transfundido se determinó nuevamente la viabilidad celular, pero mediante técnica del azul tripano al 1%.10

EL conteo de las CD 34+ por citometría de flujo se realizó según la recomendación internacional de la Sociedad para Hematoterapia e Ingeniería (ISHAGE), 11,12 tiñendo las células simultáneamente con FIT C conjugado con CD34+ (Clone 581 tipo III, Coulter-Immunotech, Marseille France Lot # 09) y PE CD45 reactivo especifico (Clone Immu 19.2, Coulter-Immunoteche Lot # 09). Antes del teñido, la muestra se trató con yoduro de propidio (50 µg/mL en buffer fosfato) para poder excluir las células no viables que son las que marca este reactivo. La proporción de células CD 34+ se estimó en yoduro de propidio negativo/CD45+ eventos tenues, y en todos los casos el porcentaje de las CD34+ es derivado del análisis de 50 000 eventos, por la escasa proporción en que se encuentran estas. El cálculo, la adquisición de eventos, las recomendaciones para el uso de los reactivos y la confección de los gates se siguió según Hematopoietic Stem Cells.13

De los 2 TCP alogénicos realizados, uno presentaba incompatibilidad menor (donante del grupo O y receptor A), por lo que fue necesario centrifugar la leucoféresis a 3 000 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4 ºC, para luego decantar el plasma sobrenadante y evitar posibles complicaciones hemolíticas; el otro presentaba incompatibilidad mayor (donante A y receptor O ), pero no fue necesario realizar plasmaféresis previa al receptor, ya que tenía un título bajo de isoaglutininas alfa (1/256) ni tampoco necesitó procesamiento adicional el producto de la leucoféresis (7 % de contaminación con eritrocitos en la primera colecta y 8 % en la segunda, lo que equivale a 11,5 mL y 12,9 mL de sangre incompatible, respectivamente).

El análisis estadístico fue descriptivo. Los resultados se expresan en valores medios y se presentan en forma de tablas.

Resultados

Las características generales de los donantes se muestran en la tabla 1.

Tabla 1. Características generales de los donantes de células progenitoras hematopoyéticas

Características	Resultados
Sexo
No. (%)                               M                                           F	4 (57,1) 3 (42,9)
Edad X (rango)                            Años	34 (25-55)
Peso X (rango)                             Kg	69,1 (50-97,5)
Talla X (rango)                             cm	168 (150-187)
Volemia X (rango)                             mL	4 890 (4 130-6 825)

Los parámetros hematológicos de los donantes de células progenitoras hematopoyéticas se caracterizaron por tener una media del conteo de leucocitos de 29,7 x 109 /L y la media del conteo de plaquetas fue de 282 x 109 /L (tabla 2 ).

Tabla 2. Parámetros hematológicos de los donantes de células progenitoras hematopoyéticas

Parámetros	Resultados
Hemoglobina g/L    X ( rango)	13,1(9,3-15,4)
Hematócrito (% )    X (rango)	39,2(28-43)
Conteo de leucocitos x 109/L  X (rango)	29,7(11,1-52,7)
Conteo de plaquetas x 109/L   X (rango)	282(187-500)

Las variables utilizadas en el proceso de colección de células progenitoras hematopoyéticas, mediante el empleo del programa mononucleares con el set P1Y, se muestran en la tabla 3, donde la media de la velocidad del flujo sanguíneo procesado (95 mL por minuto), la media del número de ciclos [49] y la media de las volemias procesadas [3,6] fueron mayores en las leucoféresis para TCPH autólogos. En este tipo de trasplante se utilizó menos cantidad de ACD-A por leucoféresis (X=913 mL) en relación con las leucoféresis para trasplante alogénicos (X=990 mL).

Tabla 3. Variables utilizadas en el proceso de colección de células progenitoras hematopoyéticas con el programa P1Y

Variables	Trasplante autólogo		Trasplante alogénico
	Media	Rango	Media	Rango
Total de leucoféresis	1,4	1-2	2	2
Volumen sanguíneo total (mL)	4 984	3 500-6 825	4 480	3 780-5180
Volemias procesadas	3,6	1,8-4,6	2,5	1,9-2,9
Número de ciclos	49	25-66	21	17-25
Volumen de ciclos (mL)	370	300-400	550	400-700
Volumen de rebosado (mL)	8,4	7-12	9,2	7-12
Volumen celular (mL)	10,7	9-11,6	14	11-17
Velocidad de flujo (mL x minuto)	95	60-100	60	60
Velocidad centrífuga (rpm)	1 933	1 250-2 200	1 625	1 600-1 700
Relación ACD/ST	25/1	25/1	12/1	12/1
Total de ACD empleado (mL)	913	525-1 400	990	897-1 130

La tabla 4 muestra las variables empleadas en la colección de CPH para trasplantes con incompatibilidad mayor (donante A positivo y receptor O positivo). El volumen de los ciclos (700 mL) es superior a la media de los ciclos para trasplantes autólogos y alogénicos (370 mL y 550 mL, respectivamente) que mostramos en la tabla 3. La velocidad centrífuga se programó en 1 600 rpm en la primera leucoféresis y 1 700 rpm para la segunda, lo que es superior a lo prefijado para un flujo de 60 mL por minuto. En ambas leucoféresis fue baja la contaminación con eritrocitos (7 % en la primera colecta y 8 % en la segunda, lo que equivale a 11,5 mL y 12,9 mL de sangre incompatible, respectivamente ).

Tabla 4. Variables utilizadas en la colección de células progenitoras hematopoyéticas del trasplante alogénico con incompatibilidad mayor (programa P1Y)

Variables	Primera leucoféresis	Segunda leucoféresis
Volemias procesadas	2,8	2,9
Número de ciclos	10	17
Volumen de ciclos (mL)	700	700
Volumen de rebosado	12	11
Volumen celular	11	11
Velocidad centrífuga (rpm)	1 600	1 700
Velocidad de flujo (mL x minuto)	60	60
Relación ACD/ST	12/1	12/1
Total de ACD empleado (mL)	1 130	1 009
Volumen del producto (mL)	164	161
Conteo de leucocitos (109/L)	102,6	184,5
Células CD 34+ (%)	1,02	No realizado
CD 34+ X 106 Kg	1,79	No realizado
Viabilidad celular ( % )	97	99
Hematócrito (%)	7	8

Las características del producto de las leucoféresis se muestra en la tabla 5. La media del volumen obtenido fue superior en las colectas para trasplante autólogo (521 mL); en ambos tipos de trasplantes, la media del conteo de células CD 34 positivas por Kg de peso de cada leucoféresis, es suficiente para garantizar la repoblación de la médula ósea (2,4 x 106 Kg para el autólogo y 2,99 x 106 Kg para el alogénico ). La media de la viabilidad celular en el momento de la colecta fue del 98,8 y 97,8 %, y en el momento de la transfusión fue inferior en los trasplantes autólogos (94,4 %), pero igualmente aceptable.

Tabla 5. Características del producto de leucoféresis

Características	Trasplante autólogo		Trasplante alogénico
	Media	Rango	Media	Rango
Volumen del producto (mL)	521	285-769	285	161-415
Conteo de leucocitos (x109/L)	54,5	24,7-121,6	99,2	96,4-102
Células mononucleares (%)	29,6	15-68	52,1	48-56,2
Células CD 34+ (%)	4,9	2,04-8,9	1,4	1,02-1,69
CD 34+ X 106 Kg	2,4	1,05-5,28	2,96	1,79-4,13
Viabilidad celular al colectar (%)	98,8	98-99	97,8	96,5-99
Viabilidad celular al transfundir (%)	94,4	87-98	97,8	96,5-99

Discusión

La importancia de la introducción de la técnica de colección y procesamiento de CP se debe a las ventajas médicas y económicas que tiene, ya que se acorta notablemente la recuperación hematológica en relación con el trasplante de médula ósea convencional, es menor el uso de concentrados de glóbulos y plaquetas, la mortalidad es menor del 10 % y el costo es significativamente menor. 9

A los donantes de CPH se les administró FSC-G previo a la colección, lo que posibilitó la movilización de células CD 34 positivas hacia la sangre periférica, 2 así como la leucocitosis detectada (media del conteo de leucocitos de 29,7 x 109 /L) y que mostramos en la tabla 2.

En el proceso de colección de CPH, fue posible lograr un mayor flujo sanguíneo en los trasplantes autólogos (X=95 mL x minuto), lo cual está en relación con el acceso venoso, que en estos casos fue mediante catéter venoso central de doble luz, aunque cuando el diámetro de una de las vías fue superior a la medida 14, confrontamos dificultades para lograr esta velocidad de flujo. En los trasplantes alogénicos empleamos 2 accesos venosos periféricos, por lo que la velocidad del flujo sanguíneo fue menor (60 mL x minuto).

En los TCPH autólogos se procesaron mayor número de volemias (X=3,6), pero la cantidad de ACD-A empleada fue menor que en los trasplantes alogénicos (X=913 y X=990, repectivamente), lo cual fue posible debido a que en las leucoféresis de gran volumen (las que procesan más de 3 volemias o más de 15 L de sangre), utilizamos una combinación de ACD-A con heparina sódica, que permitió que la relación ACD/sangre total se fijara en 25/1.

Las variables que permitieron lograr que la colección para TCPH con incompatibilidad mayor tuviera una baja contaminación con eritrocitos, fueron el aumento del volumen de los ciclos a 700 mL, el ajuste del volumen de rebosado a 12 mL y el incremento de la velocidad de centrifugación 100 ó 200 rpm sobre el valor predeterminado (1 600 rpm en la primera y 1 700 rpm en la segunda). El incremento del volumen de los ciclos conllevó a que fuera menor el volumen del producto de leucoféresis. 14

En el caso con incompatibilidad mayor, no fue necesario eliminar contaminación con eritrocitos mediante el uso de hidroxietil almidón al 6 %, porque el contenido de estas células fue bajo, tampoco se realizó plasmaféresis previa al receptor, porque el título de isoaglutininas alfa fue de 1: 256, lo que hace innecesario este proceder. 15

La media del volumen del producto de leucoféresis fue mayor en el TCPH autólogo (521 mL), ya que se procesó mayor número de volemias (X=3,6). El contenido de células CD34 positivas x106/ Kg ( X=2,4 en el autólogo y X=2,99 en el alogénico) en una sola leucoféresis, aportó valores superiores al mínimo necesario para repoblar la médula ósea, que según los miembros del Comité Británico para la Estandarización en Hematología, es de 2 x106/ Kg, 16 aunque Drager y colaboradores plantean cifras mínimas de 0,2 x 106/ Kg, cuando la conservación es de 4 a 8 ºC por un tiempo no mayor de 72 horas. 17 No obstante, la media del número de leucoféresis realizadas para el TCPH autólogo fue de 1,4 y en el alogénico fue de 2.

La media de la viabilidad celular en el momento de la transfusión fue ligeramente inferior en el TCPH autólogo (94,4 %), ya que fue necesario su conservación entre 4 y 8 ºC por un tiempo máximo de 69 horas, lo cual no ocurre con el alogénico, en que se transfunde de inmediato, pero consideramos adecuada esta viabilidad, lo cual coincide con lo planteado por Ruíz Argüelles y colaboradores. 18

Los resultados presentados en nuestro trabajo indican que la técnica empleada es segura y permite obtener productos de leucoféresis con adecuada composición de progenitores hematopoyéticos que garanticen la repoblación de la médula ósea y tengan una baja contaminación eritrocitaria, esto último de gran importancia en los casos con incompatibilidad mayor.

Summary

A descriptive study of all the collections of hematopoietic progenitor cells obtained by leukophoresis at the Blood Bank of "Hermanos Ameijeiras" Hospital from April, 2001, to April, 2002, was conducted. A continual flow equipment (FRESENIUS ASTEC 204) was used and the mononuclear program with the P1Y set was applied. Weight, height, haematocrit, haemoglobin, leukocyte and platelet count of the donors were determined before the collection. In the product of the leukophoresis, the leukocyte count with differential, the CD34+/CD45+ cells count (by immunofluorescence technique in flow cytometer) and the determination of cellular viability with propidium iodide in this equipment (Facscan, Becton Dickinson), were analyzed. 5 patients recieved autologous transplantations and 2 allogeneic transplantations. The first were diagnosed non-Hodgkin lymphoma (3), Hodgkin disease (1), and rheumatoid arthritis (1); whereas the others were affected by chronic myeloid leukemia (1) and non-Hodgkin lymphoma. All of them were attended at the Hematology Service of our center. The mean of the CD34+ cell count per each leukophoresis for autologous transplantation was 2.4 x 106 Kg, whereas in the allogeneic it was 21.96 x 106 Kg. The results show that by the adjustment of the cycle volume, the centrifugal speed, the overflowing volume and the cellular volume, it was possible to obtain a count of haematopoietic precursor cells in the collection similar to the reported by other authors, guaranteeing that the transfused product has the necessary cellularity to repopulate the bone marrow after the patient is treated with high doses of immunosuppressor therapy and/or radiations.

Subject headings: LEUKAPHERESIS; TRANSPLANTATION, AUTOLOGOUS; TRANSPLANTATION, HOMOLOGOUS; CD34 ANTIGENS; BONE MARROW CELLS/ transplantation; STEM CELL TRANSPLANTATION.

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Recibido: 10 de agosto del 2003. Aprobado: 15 de agosto del 2003.
Dr. Jesús Diego de la Campa. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras". Servicio de Banco de Sangre y Transfusiones. San Lázaro # 701, Centro Habana. Ciudad de La Habana, Cuba. Tel [phone]. e- mail: [e-mail]

1 Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras". Ciudad de La Habana, Cuba.
2 Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Ciudad de La Habana, Cuba.
3 Centro de Protección e Higiene de las Radiaciones. Ciudad de La Habana, Cuba.