Instituto de Hematología e Inmunología

La citometría de flujo en el estudio de las plaquetas

Lic. Patricia Caunedo Almagro

Resumen

En la década de los 60 comenzó a desarrollarse la técnica de citometría de flujo, pero los primeros trabajos basados en esta técnica aplicados al estudio de las plaquetas, aparecieron a finales de la década de los 80 del siglo pasado. Los ensayos de citometría de flujo complementan e incluso pueden remplazar los estudios convencionales de función plaquetaria. Se describen las ventajas y limitaciones del método, así como los antígenos plaquetarios que más se han empleado como marcadores de activación plaquetaria. El valor diagnóstico del método ha sido bien establecido en el estudio de defectos genéticos, de los síndromes protrombóticos que involucran activación plaquetaria, trombopoyesis, terapia antitrombótica, estudios de trombocitopenias alo y autoinmunes, así como la activación plaquetaria en otras situaciones clínicas como el infarto agudo de miocardio y la angina inestable. La incorporación de la citometría de flujo al estudio de las plaquetas ha tenido una importante repercusión no solo en el diagnóstico, sino también en la fisiopatología de un grupo de enfermedades relacionadas con el comportamiento plaquetario.

Palabras clave: citometría de flujo, plaquetas.

Las plaquetas fueron inicialmente identificadas en 1881 1 y no fue hasta 1906 que se conoció que eran pequeños fragmentos de citoplasma que se derivan de los megacariocitos.2 A partir de la segunda mitad del siglo XX estas pequeñas células discoides anucleadas han sido objeto de estudio de numerosos investigadores.3,4 Las pruebas de laboratorio más simples que miden la función plaquetaria son el tiempo de sangramiento, la retracción del coágulo y la actividad procoagulante plaquetaria. Sin embargo, estos métodos son considerados pruebas de pesquisajes y no son capaces de diagnosticar por sí solos alguna enfermedad relacionada con estas células. Es por ello que se utilizan otros métodos más específicos para medir su función, entre los que se incluyen la determinación del factor plaquetario, 4 la beta tromboglobulina, los ensayos plasmáticos, en orina los metabolitos del tromboxano A2 y los estudios basados en la agregometría. Estos últimos se encuentran ampliamente extendidos en los laboratorios y han sido utilizados por más de 30 años para estudiar la función plaquetaria en condiciones normales y patológicas.5 Estos métodos presentan limitaciones y problemas metodológicos que en ocasiones hacen que el diagnóstico de las enfermedades relacionadas con disfunción plaquetaria sea contradictorio.

En la década de los 60 comenzó a desarrollarse la técnica de citometría de flujo, empleada en aquella época casi exclusivamente para el recuento y medida del tamaño y de las partículas en laboratorios de investigación básica. Los primeros trabajos basados en esta técnica aplicados al estudio de las plaquetas aparecieron a finales de la década de los 80 del siglo pasado 6 y la introducción por Shattil y colaboradores 7 de la citometría de flujo para su estudio en sangre total, fue un paso fundamental para su aplicación clínica. Los ensayos de citometría de flujo complementan, e incluso pueden remplazar los estudios convencionales de función plaquetaria.

El citómetro de flujo. Principio de funcionamiento

En este equipo coinciden tecnologías de vanguardia tales como la mecánica de fluidos, el láser, la óptica, la electrónica y la informática, que lo convierten en un equipo único tanto desde el punto de vista técnico como funcional.

A las células que serán examinadas se les acopla un fluorocromo generalmente a través de un anticuerpo monoclonal que reconoce una estructura específica en la célula. Posteriormente, las células son suspendidas en el centro de un flujo de líquido isotónico que es impulsado a gran velocidad por un orificio estrecho y deben pasar a través de una fuente luminosa (láser) de forma secuencial. El láser, al incidir con cada célula, se desvía y este cambio de dirección es registrado por detectores especiales. Por otra parte, el reactivo fluorescente al ser excitado, emite luz en una longitud de onda determinada (color) que es registrado por detectores colocados de forma perpendicular al rayo láser. Cada uno de los detectores del equipo ofrece una información que es convertida en impulsos eléctricos y posteriormente en códigos digitales que pueden ser visualizados a través de los programas de computación especializados.8 En la actualidad existen equipos con diferentes detectores de fluorescencia, con los cuales pueden determinarse diferentes características que coexistan en determinadas poblaciones celulares.
Conociendo la información que aporta cada unos de los detectores de señal luminosa y teniendo en cuenta las necesidades del operador, se pueden elaborar histogramas con información de 1, 2 o más parámetros diferentes.

Ventajas y limitaciones de la citometría de flujo

La aplicación de la citometría de flujo en el estudio de las plaquetas ofrece grandes ventajas sobre otros métodos de análisis, porque es el único hasta el momento que puede medir la extensión de la activación de plaquetas individuales y detectar subpoblaciones de plaquetas.9

Las plaquetas pueden ser analizadas en su medio fisiológico incluyendo eritrocitos y leucocitos, los cuales afectan la activación plaquetaria.10,11 La manipulación mínima de las muestras evita interferencias por activación in vitro y reduce las posibles pérdidas de subpoblaciones de plaquetas.7,12 Por otra parte, es posible determinar el estado de activación de las plaquetas circulantes y las modificaciones específicas que ocurren en la superficie celular como consecuencia de este proceso. Además pueden ser detectados hasta el 1% del total de plaquetas en la muestra de sangre 13 y se necesitan pequeñas alícuotas de sangre (aproximadamente 2 µL) para evaluarlas.7

Sin embargo, la citometría de flujo tiene limitaciones. Se necesita un operador especializado, ya que la preparación de las muestras es complicada, aunque el desarrollo de sistemas automatizados y el empleo de programas de computación más sencillos, simplifican el ensayo. Por otra parte, estos equipos son caros, por lo que no se encuentran disponibles en la mayoría de los centros.

Este método solamente mide la función de las plaquetas que circulan, sin embargo, si las plaquetas activadas son eliminadas rápidamente o están adheridas a las paredes de los vasos sanguíneos o a los circuitos extracorporales, puede no existir evidencias de activación plaquetaria.14 Además, las muestras de sangre deben ser procesadas en un intervalo de 45 minutos después de la extracción para evitar una posible activación ex vivo.7

A continuación se resumen las ventajas y limitaciones del método:

Ventajas Limitaciones

• La activación plaquetaria puede ser estudiada en sangre total -Requiere la preparació especializada de un operador
  
• Mínima manipulación de las muestras -Las muestras deben ser procesadas después de la extracción en no más de 45 minutos
  
• Determinación de estado de activación y reactividad de plaquetas circulantes -Son equipos costosos
  
• Elevada sensibilidad para la detección de subpoblaciones de plaquetas -Su aplicación tiene limitaciones a determinadas situaciones clínicas
  
• Se requieren mínimas cantidades de muestras
  
• No se emplean sustancias radiactivas

 

Áreas de aplicación de la técnica

El área de aplicación de esta técnica en el análisis de plaquetas consiste en la caracterización de enfermedades relacionadas con anomalías celulares, el diagnóstico de enfermedades relacionadas con disfunción plaquetaria, el control de agentes terapéuticos dirigidos a las plaquetas, conteo celular y su volumen.15 Estas 4 vertientes están basadas en tipos de ensayos diferentes que se agrupan en reactividad plaquetaria,16-18 función hemostática,19-22 grado de maduración 23-25 y reacción de anticuerpos dirigidos contra plaquetas.26,27 En la tabla 1 aparece una breve descripción de la aplicación que tienen estos ensayos en el estudio de las plaquetas.

Tabla 1. Aplicación de la citometría de flujo en el estudio de las plaquetas

Tipo de ensayo	Función
Reactividad plaquetaria	· Análisis de señales de transducción
	· Estructura del citoesqueleto
	· Secreción y degranulación
	· Conformación de glicoproteínas
	· Estudio de fosfolípidos de membrana
	· Enlace de los factores de la coagulación
Función hemostática	· Estudio de las disfunciones plaquetarias hereditarias y adquiridas
	· Estudio de la actividad procoagulante
Grado de maduración	· Cuantificación del contenido de ARN (plaquetas reticuladas)
	· Determinación del volumen y conteo celular
Reacciones de anticuerpos dirigidos contra plaquetas	· Detección, cuantificación y caracterización de anticuerpos dirigidos contra las plaquetas

Marcadores de activación plaquetaria

La molécula de P-selectina es una proteína que se encuentra en la membrana de los gránulos a en las plaquetas en reposo. Cuando es desencadenado el complejo proceso de activación, los gránulos a liberan su contenido y su membrana se fusiona con la membrana celular; de esta forma, esta molécula llega a convertirse en una proteína que forma parte de la cara externa de la membrana celular. La cuantificación de P-selectina ha sustituido la determinación de beta tromboglobulina y se ha convertido en el indicador de activación plaquetaria más ampliamente difundido que se emplea por técnicas de citometría de flujo, y algunos autores lo utilizan exclusivamente para medir esta función a través del anticuerpo monoclonal antiCD62P.28

Sin embargo, en la actualidad otros autores han planteado que no existe un marcador confiable de activación plaquetaria. Además, se ha demostrado que la molécula de P-selectina se libera un tiempo después que ocurre la activación, por lo que este marcador no sería útil en todos los casos, especialmente como predictor de la sobrevida de estas células en los concentrados almacenados.29

Quizás por las razones anteriormente expuestas, otros investigadores prefieren una combinación de varios marcadores en dependencia del objetivo del estudio, e incluyen otros reactivos monoclonales dirigidos contra proteínas que se expresan en la membrana, tales como CD41, CD61. 30 Un novedoso anticuerpo monoclonal ha sido desarrollado por Shattil y colaboradores31 llamado PAC-1 que reconoce un epitopo del receptor GPIIb/IIIa cuando se encuentra en la conformación de alta afinidad por su ligando. Esto quiere decir que este reactivo permite identificar la población de plaquetas que es capaz de unirse al fibrinógeno a través de este receptor y producir la agregación plaquetaria. Es por ello que constituye un indicador en el seguimiento directo de la activación de la integrina aIIb/bIIIa y ha sido utilizado en el estudio de agentes terapéuticos cuya acción se dirige contra esta glicoproteína.32,33

Además se han empleado otros reactivos que se consideran marcadores de la función plaquetaria en estudios de alteraciones de la adhesión plaquetaria como antiCD42a, antiCD42b, antiCD42c, y antiCD42d,34,35 que están dirigidos contra distintas subunidades de la GPIb/IX/V. Con menor frecuencia aparecen estudios que utilizan antiCD6336 que está dirigido contra una proteína lisosomal de las plaquetas, GP 53.

Se han empleado también anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD3637 que es el receptor de la trombospondina y el colágeno, y antiCD51 30 que reacciona con la cadena a del receptor de vitronectina. En la tabla 2 aparecen relacionados los reactivos monoclonales (AcMo) con las glicoproteínas plaquetarias a las que están dirigidos y una breve descripción de su función.

Tabla 2. Antígenos plaquetarios cuantificables por citometría de flujo

Anticuerpo monoclonal	Estructuraantigénica	Función
CD62P	P selectina	Activación plaquetaria
CD41	GPIIb	Agregación
CD61	GPIIIa
PAC-1	GPIIb/IIIa de alta afinidad	Ambas estructuras conforman el receptor para el fibrinógeno
CD42a	GPIX	Adhesión
CD42b	GPIba
CD42c	GPIbb	Todas estas subunidades conforman el receptor del factor von Willebrand
CD42d	GPV
CD36	GPIV	Receptor para la trombospondina y el colágeno
CD63	GP53	Proteína lisosomal
CD51	RVNa	Cadena a del receptor de vitronectina

Se han utilizado otros marcadores en el estudio de la función hemostática de las plaquetas como la determinación de micropartículas (que son vesículas que se derivan de la membrana plasmática de estas células) que expresan glicoproteínas en su superficie como resultado del proceso de activación celular.38 El método de citometría de flujo es el más empleado para cuantificar el porcentaje de micropartículas y es considerado por algunos autores un método útil para la detección de actividad plaquetaria in vivo, aunque aún no se conoce exactamente su importancia clínica.39

La determinación de agregados de plaquetas y monocitos es considerada por algunos autores una medida más eficaz de activación plaquetaria que la detección de P-selectina.40 Para ello se han utilizado citómetros de última tecnología que ofrecen una resolución suficiente para discriminar agregados plaquetarios de células circulantes y de otros tipos celulares.41

Otro aspecto significativo dentro de los parámetros que miden la función hemostática son las técnicas relacionadas con la actividad procoagulante de las plaquetas. La mayoría de los investigadores coinciden en medir la molécula de anexina V- acoplada con un fluorocromo.18,42 Aunque en ocasiones se han utilizado también anticuerpos monoclonales dirigidos contra el factor V o el factor VIII de la coagulación.19,21
Estos parámetros se resumen a continuación:

• Determinación de micropartículas.
  
• Formación de agregados plaquetarios.
  
• Actividad procoagulante.

Valor diagnóstico del método

La citometría de flujo como método diagnóstico tiene una amplia aplicación en las disfunciones plaquetarias primarias o secundarias, debido a su gran especificidad y sensibilidad.

Este valor diagnóstico ha sido bien establecido en los defectos genéticos, síndromes protrombóticos que involucran activación plaquetaria, trombopoyesis, terapia antitrombótica, estudios de trombocitopenias alo y autoinmunes y activación plaquetaria en otras situaciones clínicas.

Estudio de defectos genéticos

Desde el punto de vista clínico, las enfermedades genéticas han sido estudiadas y caracterizadas desde hace mucho tiempo, y pudiera pensarse que en este campo queda poco por conocer. Sin embargo, sorpresivamente hemos encontrado estudios que siguen investigando sobre estas enfermedades utilizando la citometría de flujo.

La trombastenia de Glanzmann y el síndrome de Bernard Soulier, se deben a una expresión reducida del receptor GPIIb/IIIa que impide total o parcialmente la agregación plaquetaria y de la GPIb/IX/V que disminuye o incluso anula la adhesión de las plaquetas respectivamente, aunque existen variantes raras en las que la glicoproteína está expresada en densidad normal, pero son disfuncionales, como la disminución o ausencia del enlace del ligando al receptor, en las cuales resulta de gran utilidad el estudio mediante AcMo por citometría de flujo. 43

Además, con esta tecnología se pueden diagnosticar otras enfermedades hereditarias menos frecuentes como la enfermedad del pool de almacenamiento, que se caracteriza por la ausencia de gránulos en el interior de la plaqueta, 44 así como diferenciar las variantes de la enfermedad, mediante el análisis de CD63, que es una proteína integral de la membrana lisosomal, la cual permite discrminar entre el defecto en la formación de los gránulos plaquetarios y aquellas variantes que presentan los gránulos, pero están vacíos.15

Síndromes protrombóticos que involucran activación plaquetaria

Actualmente puede observarse una tendencia en los estudios de trombosis a desarrollar los aspectos relacionados con la interacción entre células. La interacción plaqueta-leucocito ha sido planteada como un posible mecanismo que indica un estadio pretrombótico, e incluso como marcador de una trombosis.32 La citometría de flujo constituye una herramienta eficaz, pues se miden marcadores específicos de estas células, también llamadas moléculas de adhesión como CD102 45 y CD62P.46

Otro parámetro que se mide es el porcentaje de micropartículas como indicador de complicaciones trombóticas, ya que estas vesículas derivadas de la membrana plasmática de las plaquetas tienen actividad procoagulante. Este parámetro también ha sido utilizado en el estudio y seguimiento de los pacientes con trombocitopenia inducida por heparina.47

Trombopoyesis

En este campo, la citometría de flujo es útil por la determinación del porcentaje de plaquetas reticuladas que son definidas como plaquetas con un alto contenido de ARN, también llamadas plaquetas jóvenes. Los valores normales de referencia reportados son de 1-20 % del total de plaquetas.15
De forma discreta han ido apareciendo en la literatura estudios del porcentaje de plaquetas reticuladas en diferentes situaciones clínicas, como ha sido el seguimiento de pacientes después de un trasplante de médula ósea. 24

Terapia antitrombótica

Los agentes antitrombóticos son empleados en una gran variedad de situaciones clínicas como las enfermedades cardiovasculares y angioplastias; la citometría de flujo ha demostrado ser un método eficaz en el seguimiento de pacientes con este tipo de terapia. Algunos autores han reportado que el uso de agentes antiplaquetarios reducen la incidencia de eventos cardiovasculares isquémicos.40 Otros estudios han encontrado marcadores bioquímicos de activación plaquetaria elevados durante los episodios de isquemia cardíaca aguda, lo cual pudiera ayudar a identificar pacientes que puedan ser beneficiados con una terapia antiplaquetaria adicional.48 El efecto de los fármacos ticlopidina y clopidrogel pueden ser evaluados mediante la citometría de flujo empleando la P selectina como marcador de activación plaquetaria.33

Existen otros compuestos cuya acción está dirigida contra la integrina GPIIb/IIIa, de forma tal que bloquean su enlace al fibrinógeno e impiden la formación de agregados plaquetarios. Entre ellos se encuentra el abciximab y el fragmento quimérico c7E3Fab, cuyos efectos pueden evaluarse por este método.49

Estudio de las trombocitopenias aloinmunes y autoinmunes

Los anticuerpos antiplaquetarios constituyen el principal mecanismo para la eliminación acelerada de las plaquetas en diversas enfermedades como son la púrpura trombocitopénica idiopática, trombocitopenia aloinmune neonatal, púrpura postransfusional, refractariedad a la transfusión de plaquetas y la trombocitopenia inducida por drogas.5 En cada una de estas enfermedades, los anticuerpos están dirigidos contra proteínas diversas que están presentes en la superficie de estas células. Se han descrito varios estudios que emplean la citometría de flujo para determinar la presencia de estos anticuerpos.26,50 Con este método se pueden evaluar y cuantificar las inmunoglobulinas unidas con las plaquetas con una alta sensibilidad para la detección de pequeños cambios en la densidad de antígenos de la superficie celular que se produce durante la activación.

Estudios de activación plaquetaria en otras situaciones clínicas

Los estudios de citometría de flujo en sangre total han demostrado la existencia de plaquetas activadas circulantes en la angina inestable y en el infarto agudo del miocardio.51 También se ha demostrado que existe un aumento de la reactividad plaquetaria en pacientes con enfermedad coronaria estable 52 y en la angioplastia coronaria, incluso, se ha reportado que el análisis de los marcadores de activación plaquetaria por citometría de flujo antes de la angioplastia puede ayudar a predecir si existe un incremento en el riesgo de eventos isquémicos después de este proceder. 53

Recientemente fue publicado por Nakamura y colaboradores 54 el empleo del porcentaje de plaquetas reticuladas para evaluar la cinética plaquetaria en diferentes categorías clínicas de isquemias cerebrales, y se observó que el porcentaje de plaquetas reticuladas fue significativamente mayor en las isquemias cardioembólicas que en individuos sanos.

Sin embargo, en un estudio comparativo en pacientes con insuficiencia cardíaca se encontró que el grado de activación de las plaquetas no tenía relación con la presencia de isquemia en los pacientes estudiados y no se observó relación con la severidad clínica de la enfermedad.55

Se puede concluir que la incorporación de la citometría de flujo al estudio de las plaquetas ha permitido la profundización en el conocimiento de estas células y en particular de su función, lo que ha tenido una importante repercusión no solo en el diagnóstico, sino también en la fisiopatología de un grupo de enfermedades relacionadas con el comportamiento plaquetario.

Summary

During the 60’s the flow cytometry technique began to be developed, but the first papers based on this technique applied to the study of platelets appeared at the end of the 80’s in the last century. The flow cytometry assays complement and even can replace the conventional studies of platelet function. The advantages and limitations of the method ,as well as the platelet antigens that have been the most used as markers of platelet activation, are described. The diagnostic value of the method has been well established in the study of genetic defects, of the prothrombotic syndromes involving platelet activation, thrombopoiesis, antithrombotic therapy, studies of alo- and autoimmune thrombocytopenias, as well as the platelet activation in other clinical situations, such as acute myocardial infarction and unsteady angina. The incorporation of flow cytometry to the study of platelets has had an important repercussion not only on the diagnosis, but also on the physiopathology of a group of diseases related to platelet behavior.

Key words: flow cytometry, platelets.

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Recibido: 10 de enero de 2004. Aprobado: 12 de febrero de 2004.
Lic. Patricia Caunedo Almagro. Instituto de Hematología e inmunología. Apartado 8070, CP 10800, Ciudad de La Habana, Cuba. Tel [phone], 544214. Fax [phone]. e-mail [e-mail]