Artículos originales

Instituto de Hematología e Inmunología

Efecto de la hemina-arginina y el QF12 en la incorporación de 59 Fe en los eritrocitos de ratones

Ing. Teresa A. Fundora Sarraff,1 Dra. Norma Fernández Delgado,1 Dr. Porfirio Hernández Ramírez,1 Dra. Rosa María Lam,1 Dra. Elena Putinseva,1 Lic. Carlos Sánchez Baldaquín,2 Lic. Dagmar García Rivera,2 Dr. René Delgado Hernández,2 Dr. Armando Paneque Quevedo2 y Dr. Juan Castillo Hernández2

Resumen

Se estudió el efecto de 2 compuestos de hemina obtenidos en el Centro de Química Farmacéutica: la hemina-arginina y el QF12, en el porcentaje de incorporación de 59 Fe a los eritrocitos circulantes de ratones normales. Se observó diferencia estadísticamente significativa entre todos los grupos al segundo día (p = 0,022). En las pruebas a posteriori, se encontró que el porcentaje de incorporación de 59 Fe promedio del grupo que recibió el QF12 a 6 mg/kg fue significativamente mayor que el que se obtuvo con el placebo (p = 0,021) y significativamente mayor que los encontrados con la hemina-arginina a 3 mg/kg (p = 0,021) y con la hemina-arginina a 6 mg/kg (p = 0,016), al segundo día después de la inyección del 59 Fe. La obtención del QF12, primer compuesto hemínico cubano, y el éxito obtenido en su primer ensayo preclínico, permitieron realizar la solicitud de su patente.

Palabras clave: hemina, hemina-arginina, QF12, incorporación de 59 Fe a los hematíes, panhemopoyetina.

1Instituto de Hematología e Inmunología.
2Centro de Química Farmacéutica.

La hemina, cloruro de protoporfirina (IX) hierro (III), es el producto que se forma cuando el grupo prostético hemo de diversas hemoproteínas, tales como la hemoglobina, la mioglobina, los citocromos y una variedad de enzimas, es liberado de la cadena globular, y la quinta posición de coordinación de su átomo de hierro en estado de oxidación 3+, es ocupada por los aniones cloruro o hidroxilo, respectivamente.1 La hemina es un sólido de color pardo oscuro, soluble en disoluciones alcalinas, aminas y dimetilsulfóxido, parcialmente soluble en alcoholes e insoluble en agua y disolventes orgánicos. (Paneque A. Síntesis y caracterización de complejos de hemina. Tesis en opción al grado de Doctor en Ciencias Químicas. Centro de Química Farmacéutica y Centro Nacional de Investigaciones Científicas. Ciudad de La Habana; 2002).

En la década de los 90 del pasado siglo, el destacado hematólogo mexicano Dr. Luis Sánchez Medal , gran amigo de Cuba y de la hematología cubana, entregó a nuestro instituto el resumen de una revisión y de sus propias investigaciones acerca del efecto de la hemoglobina y la hematina en los seres vivos, y llamó la atención sobre el uso prometedor de la hemina como una panhemopoyetina, en diversos campos como la medicina, la agricultura y otros.2

El interés del Instituto de Hematología e Inmunología (IHI) en utilizar la hemina para tratar diferentes trastornos hematológicos y el del Centro de Química Farmacéutica (CQF) en desarrollar nuevos medicamentos, permitió la obtención en este centro de 2 compuestos de hemina, la hemina-arginina y el producto que se ha designado como QF12. A ambos se les realizó la caracterización estructural mediante espectroscopia IR, espectroscopia Mössbauer, difracción de rayos X, así como el análisis químico y la evaluación toxicológica correspondiente con resultados satisfactorios.3-6 Investigadores de ambos centros realizaron la evaluación preclínica de 2 compuestos de hemina en un diseño experimental en ratones.

El objetivo de este trabajo es presentar los resultados del estudio del efecto de esos complejos de hemina sobre el porcentaje de incorporación de 59 Fe a los glóbulos rojos circulantes de ratones normales.

Métodos

En los experimentos se utilizaron ratones hembras vírgenes de la línea NMRI adquiridos en el Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB, La Habana ). Se establecieron 5 grupos de 14 animales cada uno. Las inyecciones de los compuestos de hemina se realizaron por vía subcutánea, cada 4 días, hasta un total de 5 inyecciones. Se usaron 2 dosis: 3 mg/kg y 6 mg/kg de peso corporal, para una dosis total de 15 mg/kg y de 30 mg/kg de los compuestos. Al grupo I, utilizado como control, se le inyectó una sustancia placebo por la misma vía y periodicidad de las inyecciones de hemina que se utilizaron en los restantes grupos de ratones. A los ratones de los grupos II y III se les administró la hemina-arginina en cantidades de 3 mg/kg y 6 mg/kg, respectivamente. A los animales de los grupos IV y V se les inyectó el QF12 en cantidades similares a la de los grupos II y III. Todos los animales se identificaron según el grupo al que pertenecían y se mantuvieron durante toda la investigación bajo las mismas condiciones adecuadas de alimentación, suministro de agua, temperatura, humedad, iluminación e higiene.

Para estudiar el efecto de la hemina sobre el porcentaje de incorporación de 59 Fe a los hematíes, se utilizó el método clásico de Cotes y Baugham,7 modificado en el Laboratorio de Fisiología del IHI.8,9

En el día 19 del experimento se inyectaron 0,5 m Ci de 59 Fe (Ferric citrate 59 Fe, Amersham International) por vía intravenosa en la cola de todos los ratones, con posterioridad a las administraciones del placebo y de los compuestos de hemina en las cantidades señaladas anteriormente. Se prepararon patrones en balones aforados diluyendo la misma actividad de 59 Fe en agua hasta 250 mL y a cada uno de los patrones se les extrajeron 2 muestras de 0,5 mL. A los 2, 4 y 6 días posteriores a la administración del 59 Fe, 10 se sacrificaron entre 4 y 5 ratones de cada grupo, previa anestesia con éter, de acuerdo con las normas éticas establecidas para el control y manipulación de los animales de laboratorio. La sangre se extrajo con jeringuillas heparinizadas. Se depositaron 0,5 mL de la sangre extraída en viales de recuento, a los que se les añadió una pequeña porción de saponina para lisar los eritrocitos. El recuento de las muestras de los lisados de sangre total y de las muestras extraídas a los patrones se realizó en un contador automático de radiactividad (Compugamma 1282, LKB WALLAC).

El procedimiento que se siguió para calcular el porcentaje de incorporación de 59 Fe a los glóbulos rojos, fue el clásico propuesto por Huff y colaboradores, 11 con las modificaciones necesarias por tratarse de un experimento en el que la actividad inyectada era igual a la actividad del patrón. El volumen sanguíneo total de los ratones se obtuvo según el método descrito por Riches y colaboradores.10

El análisis estadístico se realizó mediante el paquete de programas estadísticos SPSS (versión 10). Para comparar el porcentaje de incorporación de 59 Fe a los eritrocitos de los ratones entre todos los grupos, a los 2, 4 y 6 días posteriores a la administración del 59 Fe se utilizó la prueba de Kruskall-Wallis. Para analizar las diferencias entre 2 grupos se realizaron las pruebas a posteriori para la prueba de Kruskall-Wallis. Se consideraron diferencias estadísticamente significativas aquellas con probabilidades inferiores a 0,05.

Resultados

En la tabla se muestran los valores promedio del porcentaje de incorporación de 59 Fe a los eritrocitos de los ratones en el grupo control y en los grupos a los que se les administró la hemina-arginina y el QF12 en las concentraciones de 3 mg/kg y 6 mg/kg de peso corporal. Al comparar el porcentaje de incorporación de 59 Fe a los eritrocitos de los ratones entre todos los grupos a los 2, 4, y 6 días posteriores a la administración del 59 Fe, se observó diferencia estadísticamente significativa al segundo día después de la inyección del radiofármaco (p = 0,022).

Tabla. Valores promedio del porcentaje de incorporación de 59 Fe a los eritrocitos de los ratones en los grupos estudiados

Días posteriores a la inyección del 59 Fe	Porcentaje de incorporación de 59 Fe a los eritrocitos de los ratones
	Grupo I (control)	Hemina - Arginina		QF12
		Grupo II	Grupo III	Grupo IV	Grupo V p
		3 mg/kg	6 mg/kg	3 mg/kg	6 mg/kg
	_ x DS	_ x DS	_ x DS	_ x DS	_ x DS
Segundo	65,0 ± 8,0	69,7 ± 11,6	66,9 ± 8,3	80,4 ± 12,9	95,6 ± 6,9 0,022
Cuarto	78,1 ± 16,8	84,4 ± 11,4	86,7 ± 3,1	82,9 ± 10,7	86,4 ± 5,7 0,91
Sexto	70,1 ± 4,7	77,3 ± 11,5	85,0 ± 6,2	83,4 ± 7,4	96,4 ± 6,4 0,054

En las pruebas a posteriori realizadas para evaluar entre cuáles grupos hubo diferencias, se encontró que el porcentaje de incorporación de 59 Fe promedio del grupo que recibió el QF12 a 6 mg/kg fue significativamente mayor que el que se obtuvo con el placebo (p = 0,021) y significativamente mayor que los encontrados con la administración de la hemina-arginina a 3 mg/kg (p = 0,021) y con la hemina-arginina a 6 mg/kg (p = 0,016), al segundo día después de la inyección del 59 Fe.

Discusión

El primer compuesto hemínico utilizado por el hombre para el tratamiento de diversas enfermedades fue la sangre. Sin embargo, su uso tiene muchos inconvenientes y por esa razón se prefiere utilizar sus constituyentes aislados.12

Desde hace aproximadamente 100 años, se tienen evidencias de que tanto la hemoglobina como otros compuestos relacionados con ella son capaces de estimular la eritropoyesis.2 Así se ha observado que la inyección de componentes eritrocitarios produce policitemia y también un incremento acentuado de eritrocitos inmaduros y leucocitos.2 Por otra parte, se ha podido demostrar que las inyecciones subcutáneas de hemoglobina incrementan el recuento de reticulocitos y favorecen la recuperación de animales de experimentación en los que se ha producido anemia mediante sangrías.13 También se ha podido apreciar que tras la administración de productos derivados de la hemólisis a ratas normales, mantenidas en ayuno y convertidas en policitémicas por transfusiones, aparecen en ellas, reticulocitosis, hiperplasia eritropoyética en la médula ósea y en el bazo, 14 así como un aumento en la captación del 59 Fe por la hemoglobina.15 Resultados similares se han obtenido con la administración de protoporfirina, clorofilina, bilirrubina y otros compuestos tetrapirrólicos.16,17

Se ha comprobado que la inyección de hemina a ratones normales y con anemia aplástica, produce un aumento de las células formadoras de colonias eritropoyéticas in vivo.18 También, que esta sustancia puede revertir la toxicidad ocasionada por la azidotimidina en las células de la médula ósea y cómo induce una aceleración de la formación de hemoglobina independiente de la acción de la eritropoyetina.19

El primer preparado de hemina conocido consiste en un concentrado de hemina soluble en agua en el cual alrededor del 40 % es hemina y el resto son constituyentes de la sangre de naturaleza desconocida. Este producto se utiliza como suplemento alimenticio y como medicamento antianémico.12

A partir de la década de los 50, se han utilizado infusiones de hemina en el tratamiento de la porfiria aguda. Se plantea que la administración de hemina a estos pacientes, generalmente restablece la actividad del ácido delta-aminolevulínico a los niveles normales y facilita la mejoría de los pacientes. Desde 1984 la hemina ha estado disponible en forma liofilizada para el tratamiento de las porfirias.20 Esta es efectiva fundamentalmente en el tratamiento de las porfirias hepáticas agudas y solo moderadamente efectiva en la porfiria eritropoyética congénita,21 en la que con la inhibición de la producción eritropoyética, se ha conseguido reducir las concentraciones de porfirinas en algunos enfermos. En las porfirias hepáticas agudas, la aplicación intravenosa de hemina se reconoce como el tratamiento más eficaz de un ataque agudo, mientras que en el manejo a largo plazo de la enfermedad también puede ser indicada al comienzo de un episodio de exacerbación recurrente o puede ser necesitada por el paciente, en ocasiones, semanalmente.22

Los efectos beneficiosos de compuestos de hemina–arginina se han señalado en el tratamiento de los síndromes mielodisplásicos23 y también la posibilidad de tratar con este compuesto a pacientes con ß talasemia.24,25 Se ha comunicado que la hemina incrementa la hemoglobina F en cultivos de células provenientes de pacientes con anemia drepanocítica, ß talasemia y de donantes normales.26 Cuando se ha añadido a los cultivos junto con la droga citotóxica hidroxiurea, se ha obtenido un efecto sinérgico, con una citotoxicidad considerablemente menor que cuando se añade la hidroxiurea sola. Estos resultados podrían ser potencialmente beneficiosos y aumentan la posibilidad de introducir tratamientos combinados con la hemina y otras drogas que ahora se utilizan para tratar los pacientes con drepanocitosis y ß talasemia.26 En ratones se ha comprobado que la hemina tiene mejores resultados sobre la anemia hemorrágica que el gluconato ferroso y no presenta los efectos adversos de este último.27

La obtención en Cuba del compuesto de hemina, QF12 y los resultados satisfactorios de su evaluación preclínica, donde se pudo comprobar el aumento significativo de la incorporación de 59 Fe a los eritrocitos de ratones, abren nuevas perspectivas en el campo de la investigación y de la terapéutica.

La mayoría de los productos y procedimientos terapéuticos que se utilizan en el tratamiento del cáncer y del SIDA tienen numerosos efectos adversos, entre los cuales la anemia y la mielosupresión son los más frecuentes. Uno de los fármacos comúnmente indicados para aliviar la fatiga y la anemia en el cáncer es la eritropoyetina (EPO). Sin embargo, comunicaciones muy recientes indican que la EPO podría acortar la supervivencia de los pacientes con cáncer y estimular el crecimiento del tumor maligno.28 La EPO estimula la producción de glóbulos rojos, cuando se une con sus receptores en estas células, pero ya existen evidencias acumuladas de que algunas células no hematopoyéticas también presentan receptores para la EPO. De hecho se sugiere que muchos tipos de células cancerosas utilizan el sistema de la EPO para crecer y promover la angiogénesis.29 De ahí la necesidad de la búsqueda de medicamentos más seguros, sin esos efectos indeseados, que puedan revertir el daño medular producido por las radiaciones y la quimioterapia.

La obtención en el CQF del QF12 por vía sintética, primer compuesto hemínico cubano, y el éxito obtenido en su primer ensayo preclínico, permitieron realizar la solicitud de su patente. 30 Los resultados alcanzados justifican la ampliación de las investigaciones con este producto y sobre todo para la evaluación de su capacidad de panhemopoyetina y sus posibles beneficios terapéuticos, bien como único tratamiento o combinado con factores hematopoyéticos específicos.

Summary

Effect of hemin-arginine and QF12 on the incorporation of 59 Fe in mice erythrocytes

The effect of 2 hemin compounds (hemin-arginine and QF12 ) obtained at the Center of Pharmaceutical Chemistry on the percentage of incorporation of 59 Fe in the circulating erythrocytes of normal mice was studied. A statistically significant difference was observed between the 2 groups on the second day (p = 0.022). In the a posteriori tests it was found that the average percentage of incorporation of 59 Fe of the group that received QF12 at 6 mg/kg was markedly higher than the one obtained with placebo (p = 0.021), and remarkably higher than the found with hemin-arginine at 3 mg/kg (p = 0.021), and with hemin-arginine at 6 mg/kg (p = 0.016) on the second day after the injection of 59 Fe. The obtention of QF12, the first Cuban heminic compound, and the success attained in its first preclinical test, allowed to request its patent.

Key words: Hemin, hemin-arginine, QF12, incorporation of 59 Fe in the red corpuscles, panhemopoietine.

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Recibido: 10 de enero de 2005. Apronado: 2 de febrero de 2006.
Ing. Teresa A. Fundora Sarraff . Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, Ciudad de La Habana, CP 10800, Cuba. Telf (537) 6438268, 6438695, 6434214. Fax [phone]. e-mail: [e-mail]