ARTÍCULO DE REVISIÓN

 

Características fenotípicas y funcionales de las células madre mesenquimales y endoteliales

Phenotypical and functional features of the mesenchymal and endothelial stem cells

DraC. Consuelo Macías-Abraham; Lic. Lázaro O. del Valle-Pérez; Prof. DrC. Porfirio Hernández-Ramírez; Prof. DrC. José M. Ballester-Santovenia

Instituto de Hematología e Inmunología. Ciudad de La Habana, Cuba.

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RESUMEN

Se presentan los conceptos actuales sobre las células madre provenientes de la médula ósea y la importancia de las células estromales en la Medicina Regenerativa. Se describen, en particular, las características fenotípicas de las células madre mesenquimales y endoteliales, así como las de diferentes tipos celulares relacionados, sus propiedades funcionales y la importancia dada al uso de estas células en diversas aplicaciones terapéuticas. Se refieren los resultados de su estudio en distintos estados patológicos, las variaciones por la acción de drogas y de los factores de crecimiento, y su potencialidad futura en el diagnóstico y tratamiento de diferentes enfermedades.

Palabras clave: células madre, células progenitoras, medicina regenerativa, células mesenquimales, células endoteliales.

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ABSTRACT

The current concepts on the stem cells from bone marrow and the significance of the stromal cells in Regenerative Medicine are showed. In particular, the phenotypical features of mesenchymal and endothelial stem cells are described, as well as the different related types of cells, its functional and the significance properties given to use of these cells in different therapeutic applications. The results of study in different pathologic states, the variations due to drugs action and of the growth factors are recounted as well as its future potential in diagnosis and treatment of different diseases.

Key words: Stem cells, progenitor cells, regenerative medicine, mesenchymal and endothelial cells.

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INTRODUCCIÓN

Una de las bases fundamentales de la Medicina Regenerativa es el trasplante celular autólogo a tejidos lesionados, de células mononucleares provenientes de la médula ósea. Su objetivo es la reparación o disminución del daño hístico a partir de los diferentes mecanismos de acción de estas células implantadas en el tejido u órgano dañado.¹

La célula madre hematopoyética (CMH) tiene la capacidad de reproducirse por sí misma, de diferenciarse a células maduras de la línea hematopoyética y, por su plasticidad, también a tejidos no hematopoyéticos como músculo, hígado, vasos, tejido nervioso y piel.¹

El estroma de la médula ósea está constituido por una población heterogénea de células que incluye células endoteliales, fibroblastos, adipositos y células osteogénicas, una subpoblación que ejerce efectos reguladores positivos y negativos sobre la proliferación y diferenciación de las células hematopoyéticas.^2,3 La población celular del estroma medular adherente contiene otras células no hematopoyéticas que son capaces de renovarse por sí mismas y diferenciarse en cartílago, músculo, tendón y grasa,^4-6 por lo que la médula ósea que no ha sido sometida a métodos de depleción o extracción de poblaciones celulares específicas contiene ambos tipos de precursores, estromales y hematopoyéticos, y constituye la fuente celular principal para la implantación de células madre en otros tejidos.

En esta novedosa terapéutica se utilizan diferentes tipos celulares, y dentro de los mecanismos involucrados en sus beneficios clínicos, se encuentran: la reparación tisular y el aumento de la angiogénesis, la vascularización o ambos efectos.⁷ En la presente revisión se refieren de manera general las características fenotípicas y las propiedades funcionales de las células madre mesenquimales (CMM) y las células progenitoras endoteliales (CPE) humanas por su importancia en el desarrollo de la Medicina Regenerativa y otras aplicaciones clínicas.

CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES

La médula ósea es la principal fuente de aislamiento de CMM, aunque se han aislado también del tejido adiposo, páncreas, hígado, músculo esquelético, dermis, membrana sinovial, hueso trabecular,^8-11 sangre del cordón umbilical,¹² tejido pulmonar,¹³ pulpa dental y ligamento periodontal.¹⁴ Aunque la médula ósea es la mejor fuente de obtención, solo 0,003 % de las células mononucleares de la médula ósea humana son CMM. Desde el año 2006, se conoce que existen algunos aspectos que dificultan su uso, como son: la limitada tasa de crecimiento, la capacidad de diferenciación de acuerdo con la edad del donante de la médula, y el riesgo en la toma de la muestra.^8,10 Los progenitores mesenquimales son un grupo de células madre adultas caracterizadas por Friedenstein,¹⁵ aisladas de la médula ósea como células adherentes de morfología fibroblastoide, capaces de diferenciarse hacia células de origen mesodérmico como osteocitos, condrocitos y adipositos.^15-18 Varios autores han asignado a este grupo celular diversos nombres como: células de estroma medular, unidades formadoras de colonias fibroblastoides, precursores estromales o células adultas progenitoras multipotentes o MAPCs (del inglés, multi-potent adult progenitor). La Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT, del inglés: International Society of Cellular Therapy) en el año 2006, propuso 3 criterios para definir las CMM: 1) deben ser adherentes en cultivo; 2) expresar los antígenos CD73, CD90 y CD105 en ausencia de antígenos hematopoyéticos como CD34 y CD45, marcadores de monocitos, macrófagos y linfocitos B; y 3) diferenciarse in vitro en osteoblastos, adipositos y condrocitos, bajo condiciones estándares de cultivo.^16,19-22 Además de lo propuesto por la ISCT se deben tener en cuenta 2 aspectos adicionales para clasificarlas como células madre: que las CMM realicen procesos de autorrenovación; durante la división celular solo una de las células hijas debe iniciar programas de diferenciación celular; y que sean capaces de desarrollar "plasticidad clonogénica" o diferenciación hacia tejidos de diferentes capas embrionarias como ectodermo y endodermo.^23,24

Las CMM residentes de la medula ósea son designadas también como células estromales de la médula ósea, así como su progenie bien diferenciada localizada en los nichos perivasculares que tienen la capacidad de regenerar estroma medular, hueso, cartílago, tejido graso y músculo in vivo e in vitro.^16,20,25 Por lo tanto, las CMM también residen en la pared de los grandes y pequeños vasos de diferentes tejidos y órganos que incluyen cerebro, bazo, hígado, riñón, pulmón, músculo, timo y páncreas. Lo anterior explica que la médula ósea y las CMM derivadas de célula madre embrionaria, CMM residentes en la pared vascular, así como la CMM derivadas de célula madre embrionaria de tejido fetal, cordón umbilical, placenta, músculo y de adipositos, puedan constituir la fuente celular para terapias de diferentes estados patológicos como diabetes, osteoporosis, artrosis, desórdenes degenerativos musculares, y para la regeneración de las paredes de los órganos y vasos sanguíneos después del daño tisular.^25-28 Las CMM pueden también diferenciarse a células neuronales, pulmonares, islotes de células beta pancreáticas, células epiteliales corneales y cardiomiocitos ex vivo e in vivo, por lo que pueden usarse para el tratamiento de numerosos tejidos dañados y desórdenes degenerativos.²⁹

En la actualidad es de gran interés el estudio de las células estromales de la médula ósea, ya que estas poblaciones celulares cultivadas son capaces de autorrenovarse y de diferenciarse como lo hace la CMH, de ahí que muchos investigadores se refieran a las células estromales como a las CMM y utilicen la determinación de fibroblastos formadores de colonias como un método funcional para cuantificar las células progenitoras estromales.^30-32 Se ha referido que existe una fuerte correlación entre su potencial proliferativo y la edad, por lo que el envejecimiento celular se relaciona con la disminución de su actividad proliferativa.^30,31 La función anormal de las células estromales se ha descrito en diversas enfermedades, y el trasplante de células no procesadas de la médula ósea puede restaurar la función del microambiente celular.^32,33 Estas células precursoras del microambiente celular pueden ser lesionadas por la quimioterapia, las radiaciones y permanecen en muy baja concentración durante un tiempo después del trasplante.³⁴ Ellas inducen estímulos reguladores a otras células y probablemente esto explica el retardo en la recuperación funcional inmunológica posterior al trasplante.³⁵

CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS

Las células estromales muestran un potencial de diferenciación hacia diferentes líneas celulares; estas son: CMM, células progenitoras mesodérmicas y células inducibles de multilinaje adultas aisladas de médula ósea, conocidas como MIAMI (del inglés, marrow isolated adult multilineage inducible), las que han sido caracterizadas usando paneles de anticuerpos monoclonales³⁶ (tabla 1), aunque algunos autores consideran que estas células son similares. Recientemente se han descrito en la medula ósea y otros tejidos adultos, varias poblaciones de células madre no hematopoyéticas (tabla 2) que incluyen: CMM; células MAPCs, células MIAMI, células madre multipotentes adultas (MASCs; del inglés, multipotent adult stem cells), CPE, OmniCitos y células madre pequeñas parecidas a células embriónicas conocidas como VSELs (del inglés, very small embryonic like).³⁷ Todas las anteriores pueden corresponder a poblaciones similares o a poblaciones superpuestas de células madre, denominadas de manera diferente por varios investigadores en diversas condiciones experimentales de aislamiento y expansión en cultivos. Estas poblaciones son derivadas de la fracción adherente de la medula ósea y potencialmente podrían asociarse o internalizar VSELs por un proceso de emperipolesis. Esta interacción entre VSELs y las mencionadas células madre más indiferenciadas, requiere de mayor conocimiento experimental.³⁷

Tabla 1. Expresión de diferentes marcadores de membrana en poblaciones celulares del estroma medular

Marcador	Células madre mesenquimales	Células madre mesodérmicas	Células MIAMI
CD34	-	-	-
CD45	-	-	-
CD4	-	No descrito (nd)	nd
CD9	+	nd	nd
CD10	+	-	+
CD11a	-	nd	nd
CD13	+	+	nd
CD14	-	nd	nd
CD15	-	nd	nd
CD18	-	nd	nd
CD25	-	nd	nd
CD29	+	nd	+
CD31	-	-	nd
CD36	nd	-	-
CD38	nd	-	nd
CD44	+	+ (bajo)	+
CD49a	+	nd	nd
CD49b	+	+	nd
CD49c	+	nd	nd
CD49d	-	nd	nd
CD49e	+	nd	+
CD50	-	-	nd
CD51	+	nd	nd
CD54	+	nd	nd
CD56	nd	nd	-
CD58	+	nd	nd
CD61	+	nd	nd
CD62e	-	-	nd
CD62L	+	nd	nd
CD62p	-	nd	nd
CD63	nd	nd	+
CD71	+	nd	nd
CD73(SH3 y SH4)	+	nd	nd
CD81	nd	nd	+
CD90	+	+(bajo)	+
CD102	+	nd	nd
CD103	nd	nd	+
CD104	+	nd	nd
CD105 (SH2)	+	nd	nd
CD106	+	-	nd
CD109	nd	nd	-
CD113	nd	nd	nd
CD117	-	-	-
CD119	+	nd	nd
CD120a	+	nd	nd
CD120b	+	nd	nd
CD121	+	nd	nd
CD122	nd	nd	+
CD123	+	nd	nd
CD124	+	nd	nd
CD126	+	nd	nd
CD127	+	nd	nd
CD140a	+	nd	nd
CD164	nd	nd	+
CD166	+	nd	nd
HLA clase I	nd	-	-
HLA-DR	nd	-	-
LNGRF	nd	nd	nd
H1P12	nd	-	nd
Beta 2 microglobulina	nd	+(Bajo)	nd
KDR (RFCVE)	nd	+(Bajo)	+(Bajo)
Fit1	nd	+(Bajo)	+(Bajo)
Antígeno de superficie de fibroblasto	nd	-	nd

  HLA: antígenos leucocitarios lumanos ( del inglés, human leucocytes antigens); RFCVE: receptor para el factor de crecimiento vascular endotelial; +: positivo; -: negativo.

Tabla 2. Células madre en tejidos adultos humanos

Células madre	Fenotipo
Células madre mesenquimales (CMM)^a	CD133^+, CD34^+, c-kit (CD117)^+, VE-cadherin^+, VEGFR2^+, CD146^+, vWF^+, CD31^+
	Criterios de ISCT: CD105^+, CD73^+, CD90^+, CD45^-, CD34^-, CD14^-, CD11b^-, CD79a^-, CD19^-, HLA-DR^-
	Marcadores más indiferenciados: CXCR4, CD133, CD34 (?), p75LNGFR
Células progenitoras endoteliales (CPE)	CD133^+, CD34^+, c-kit (CD117)^+, VE-caderina^+, VEGFR2^+, CD146^+, FvW^+, CD31^+
Células progenitoras multipotentes adultas (MAPC)^a	SSEA-1^+, CD13^+, Flk-1^bajo, Thy-1^bajo , CD34^-, CD44^-, CD45^-, CD117(c-kit)^-, MHC I^-, MHC II^-
Células inducibles de multilinaje adultas aisladas de médula ósea  (MIAMI)^a	CD29^+, CD63^+, CD81^+, CD122^+, CD164^+, c-met^+, BMPR1B^+, NTRK3^+, CD34^-, CD36^-, CD45^-, CD117 (c-kit)^-, HLA-DR^-
Células madre multipotente adultas  (MASCs)^a	CD13^+, CD49b^+, CD90^+, CD73^+, CD44^+, CD29^+, CD49a^+, CD105^+, MHC I^+, HLA-DR^-, CD14^-, CD34^-, CD45^-, CD38^-, CD133^-, c-kit (CD117)^-
OmniCitos	CD34^+, CD133^+, CXCR4^+, c-Met^+, CD33^bajo, CD38^bajo, MHC-II^bajo
Células madre pequeñas parecidas a células embrionarias (del inglés, very small embryonic-like stem cells, VSEL)	CXCR4^+, AC133^+, CD34^+, SSEA-4^+, AP^+, c-Met^+, LIF-R^+, CD45^-, Lin^-, HLA-DR^-, MHC I^-, CD90^-, CD29^-, CD105^-

  ^a: fenotipo de células adherente cultivadas y expandidas; AP: fosfatasa alcalina fetal (del inglés, fetal alkaline phosphatase); BMPR1B: receptor de la proteína morfogenética del hueso 1B (del inglés, bone morphogenetic protein receptor 1B); c-met: receptor para el factor de crecimiento del hepatocito; LIF-R: receptor para el factor inhibidor de la leucemia; NTRK3: receptor 3 neurotrópico tirosin-cinasa; SSEA-1⁺: antígeno 1 embrionario (del inglés, stage-specific embryonic antigen-1); SSEA-4⁺: antígeno 4 embrionario (del inglés, stage-specific embryonic antigen-4); FvW: factor von Willebrand.   

as MAPCs han sido aisladas de una fracción de células mononucleares de la médula ósea como una población de fibroblastos adherentes de células CD45^-GPA-A. Estas son células pluripotentes capaces de diferenciarse en células de las 3 capas germinales y contribuyen a la formación de todos los tejidos embrionarios cuando son inyectadas en el blastocito en desarrollo.³⁷ Sin embargo, existen en la actualidad algunas dudas sobre su existencia.

Las células MIAMI son una población adherente de médula ósea adulta, sus colonias cultivadas expresan marcadores característicos de las 3 capas de líneas germinales.³⁷ De manera similar, las MASCs han sido recientemente identificadas como una población de células adherentes de medula ósea capaces de diferenciarse en líneas mesodérmicas múltiples.³⁷ Ellas fueron clonadas de médula ósea adulta así como de otros tejidos que incluyen hígado y corazón y expresan los típicos marcadores de CMM.³⁷

El término OmniCitos se utiliza para referirse a una subpoblación de células madre CD34+ que constituye una pequeña fracción en sangre periférica, de características fenotípicas conocidas (tabla 2), y muy similares a otra subpoblación de células madre pequeñas (del inglés, small stem cells). Las CPE y las VSELs son células que se movilizan en respuesta al daño tisular ³⁷ y tienen una alta similitud antigénica, por lo que pueden potencialmente ser aisladas conjuntamente.

En general, las células estromales cultivadas, independientemente del método de cultivo empleado, no expresan las moléculas CD45 y CD34, pero podrían expresar CD105 (SH2) y CD73 (SH3 y SH4) (tabla 3). Sin embargo, el fenotipo exacto de la célula precursora estromal (mesenquimal) en la médula ósea humana previo al cultivo, aún está en discusión. El aislamiento y enriquecimiento de las células mesenquimales se basa en el empleo de algunas de sus características más comunes, como la adherencia celular, o la estrategia de separación celular usando mezclas de anticuerpos monoclonales que eliminan de la médula ósea, poblaciones celulares específicas.^38-40

    

    Tabla 3. Proteínas expresadas en células madre mesenquimales

Moléculas de adhesión
Superfamilia de las inmunoglobulinas ALCAM ICAM 1 ICAM 2 ICAM 3 LFA-3 NCAM HCAM VCAM Integrinas VLA-a1 VLA-a2 VLA-a3 VLA-a5 VLA-b b4- integrina Selectinas L-selectina	Marcador de membrana CD66 CD54 CD102 CD50 CD58 CD56 CD44 CD106   CD49a CD49b CD49c CD49e CD29 CD104  CD62L
Factores de crecimiento y receptores de citocinas
IL-1R IL-3R IL-4R IL-6R IL-7R Interferón a R Factor de necrosis tumoral a1-R Factor de necrosis tumoral a2-R Receptor de transferrina	CD 121 CD123 CD124 CD126 CD127 CDw127 CD102a CD102b CD71
Marcadores específicos
Tetraspan 5’nucleotidasa Thy-1 Endoglina MUC-18 BST-1	CD9 CD73 CD90 CD105 CD146 CD157
Marcadores de matriz extracelular
Colágeno tipo l, II, IV  y V Proteoglicanos Laminina Hialuronato

La molécula CD73 ó 5'ectonucleotidasa se considera un marcador de linaje para las CMM y se cree que esté relacionada con mecanismos de adhesión celular, ya que se ha encontrado co-expresada con moléculas tipo a2 integrinas, lo que ha caracterizado al CD73 como un mediador de adhesión celular en CMM.^41,42 Las CMM aisladas de la médula ósea, también expresan la molécula CD90 ó Thy-1, una proteína de la superfamilia de las inmunoglobulinas y cuyo principal ligando es el CD45;^43,44 se expresa entre el 10-40 % de las células CD34+ y en mayor proporción en el tejido conectivo. En células del estroma medular este antígeno es un marcador de precursores mesenquimales tempranos que pueden diferenciarse en osteoblastos. La molécula CD105, también conocida como endoglina, es una glicoproteína que forma parte del complejo del receptor del factor transformante de crecimiento-beta ó TGF-β, y se expresa en monocitos activados, macrófagos activados, precursores eritroides, fibroblastos, células foliculares dendríticas, melanocitos, células cardíacas, células vasculares de músculo liso y células endoteliales.⁴⁵ Esta molécula interviene en la regulación de distintos componentes de la matriz extracelular, como fibronectina y colágeno, razón por la cual se cree que está relacionada con procesos de angiogénesis y reparación vascular^45,46 y se sugiere que su expresión en CMM humanas es determinante en la generación de cardiomiocitos.⁴⁷

Además de los antígenos referidos anteriormente, otros autores proponen moléculas como STRO-1, CD44 y CD166 para la tipificación de células mesenquimales. En 1991 se identificó a STRO-1 (por Simmons and Torok-Storb, de ahí sus siglas) como un antígeno específico para CMM aisladas de médula ósea.⁴⁸ CD44 es una molécula de adhesión que actúa mediante la interacción con el ácido hialurónico, osteopontina, colágeno, anquirina, fibronectina y metaloproteinasas y participa en los procesos de adhesión, migración y proliferación de las CMM.⁴⁹ Además de STRO-1 y CD44, se sugiere que la molécula CD166 o ALCAM (del inglés, activated leukocyte cell adhesion molecule) interviene en la hematopoyesis, involucra a las CMM y participa en el mantenimiento del estado indiferenciado de CMH y CMM.^20,50 Si la población es de origen medular, este marcador es determinante en su identificación, lo que podría explicar en parte los resultados contradictorios que se encuentran publicados con respecto a la expresión de esta y otras proteínas en CMM.^18,51

CARACTERÍSTICAS FUNCIONALES

Las CMM son una población celular con alto potencial autorrenovador que median mecanismos potentes para evitar el rechazo alogénico. Múltiples estudios han demostrado que evitan el alorreconocimiento, interfieren con las células dendríticas y la función de las células T e inducen un microambiente inmunosupresor local por la secreción de citocinas.⁵² El efecto inmunorregulador de las CMM humanas se incrementa cuando las células están expuestas a un medioambiente inflamatorio caracterizado por un aumento local de interferón (IFN) gamma.⁵³

La demostración in vitro de que las células mesenquimales no expresan los antígenos del Sistema Principal de Histocompatibilidad de clase II y que suprimen la reacción de proliferación en el cultivo mixto de linfocitos, ha sugerido que estas células podrían suprimir las reacciones inmunes inducidas y constituyen un potencial terapéutico en la enfermedad de injerto contra huésped.⁵⁴

Se ha demostrado que las CMM humanas liberan citocinas inmunosupresoras, como el factor de crecimiento del hepatocito, la interleucina 10 y el TGF-β1, en concentraciones que suprimen la alorrespuesta in vitro. También expresan las ciclooxigenasas 1 y 2 y producen prostaglandina E2 constitutivamente. Estudios de bloqueo con indometacina confirman que las prostaglandinas contribuyen a la alosupresión mediada por estas células.^54-56 El IFN-gamma (citocina proinflamatoria) no es capaz de revertir la supresión que inducen las CMM sobre la proliferación linfocitaria por estimulación alogénica, pero sí es capaz de regular o revertir sus efectos sobre los factores de crecimiento del hepatocito y TGF-β1. Estudios de cocultivo o cultivo entre células alogénicas in vitro, tanto en modelos animales como humanos, en presencia de CMM, demuestran que los factores solubles derivados de estas últimas modulan la respuesta inmune y sugieren que esto genera un microambiente inmunosupresor capaz de modular la alorrespuesta aún en presencia de IFN-gamma.^52-54

Tres mecanismos fundamentales contribuyen al efecto supresor sobre la reacción alogénica; 1) son hipoinmunogénicas, pues no expresan antígenos de clase II y otras moléculas coestimulatorias; 2) previenen la respuesta de las células T indirectamente a través de la modulación de las células dendríticas y actúan directamente inhibiendo la función de las células NK (inhibiendo la proliferación y producción de IFN) y las células T CD4+ (induciendo un fenotipo regulador); 3) inducen un microambiente supresor local a través de la producción de prostaglandinas e interleucina-10, así como por la expresión de indoleamina-2,3-dioxigenasa, que depleta de triptófano el medio local.^52-54 Esta acción inmunorreguladora es comparable con la referida en la tolerancia materno-fetal y muy similar a la descrita en los mecanismos de las células tumorales para evadir a la respuesta inmunológica.⁵⁴

Además de las propiedades regenerativas de las CMM, estas también afectan el funcionamiento del sistema inmune. Estudios realizados demuestran que las CMM pueden inhibir la proliferación de linfocitos inducida por aloantígenos,⁵⁵ mitógenos como fitohemaglutinina y concavalina A,⁵⁶ y anticuerpos anti CD3 y CD28.⁵⁷ Durante la maduración de las células dendríticas, las CMM pueden inhibir la expresión de moléculas involucradas en la presentación de antígenos como CD1a, CD40, CD80, CD86 y HLA-DR⁵⁸ y en co-cultivo con células mononucleares de sangre periférica, incrementan la proporción de subpoblaciones de linfocitos T con fenotipo de células reguladoras como CD4+/CD25alto, CD4+/CTLA-4+, CD4+/CD25+/CTLA-4+.⁵⁹

El hecho de que las CMM son hipoinmunogénicas permite que sean utilizadas como matriz para la expansión de poblaciones enriquecidas de células CD34+, ya que no es necesaria la compatibilidad con el donante ni el hospedero. Lo anterior sugiere que las células hematopoyéticas expandidas sobre una matriz de células mesenquimales podrían retener las propiedades biológicas de las células más primitivas y no llegar a una diferenciación terminal, como se ha descrito hasta el momento para procederes ex vivo.⁶⁰ En niños con osteogénesis imperfecta se han realizado trasplantes con células mesenquimales cultivadas y marcadas genéticamente. Los resultados beneficiosos obtenidos durante un año declinaron en el tiempo, probablemente por una diferenciación terminal.⁶¹

Existen hallazgos que confirman que la población celular no adherente procedente de cultivos de médula ósea es una fuente complementaria de CMM, y que ellas pueden ser colectadas de manera simple y poco costosa, lo que incrementa su número y permite reducir los tiempos de cultivo para su disponibilidad y aplicaciones clínicas.⁶²

Las CMM tienen la capacidad de diferenciarse a células de diferentes tejidos, de regenerar tejidos deteriorados o lesionados^17,63-65 y de modular reacciones inmunes en colagenopatías, la esclerosis múltiple y el trasplante de médula ósea.²¹ Una de sus principales aplicaciones clínicas consiste en la reparación de hueso, demostrada in vivo en ratones y en perros con defectos cráneo-faciales y defectos de huesos largos mediante la administración directa de CMM, con matrices como hidroxiapatita/fosfato tricálcico que han mostrado resultados satisfactorios.^66,67

El conocimiento más profundo de la biología de poblaciones celulares específicas podría ser el fundamento de futuras terapias en muchas áreas más allá de la hematología y la oncología.

CÉLULAS PROGENITORAS ENDOTELIALES HUMANAS

El desarrollo del vaso sanguíneo es un proceso regulado que involucra proliferación, migración y remodelación de células endoteliales (CE) de vasos preexistentes (angiogénesis) o producto de la diferenciación de CPE o angioblastos procedentes de precursores mesodérmicos (vasculogénesis).⁶⁸ Conocimientos precedentes sugerían que las CPE solo estaban presentes durante el desarrollo embrionario y en la actualidad existen evidencias suficientes que demuestran su persistencia en la vida adulta, lo que ha generado interés en su uso para la neovascularización de tejidos isquémicos o dañados y su uso clínico en individuos con factores de riesgo para enfermedades asociadas con un compromiso de la vascularización.⁶⁸

CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y LINAJE DE LAS CPE

Los estudios de purificación y caracterización de las CPE procedentes de médula ósea o de sangre periférica no han sido exitosos por la ausencia de marcadores fenotípicos específicos o distintivos entre estas células y las CE derivadas de la pared vascular y de subpoblaciones de células hematopoyéticas (tabla 4).

 Tabla 4. Expresión de marcadores de membrana en diferentes tipos celulares de interés
en la Medicina Regenerativa

Marcador	Células endoteliales	Células progenitoras endoteliales	Células hematopoyéticas	Otras células
CD34	+	+	Subpoblaciones de células madre	Algunas células en tejido nervioso adulto y fetal
CD45	-		-	No descrito (ND)
CD14	+ sinusoide hepático	-	Monocitos, macrófagos y neutrófilos
CD31(PECAM-1)	+	+	Plaquetas, monocitos, células NK, neutrófilos y subpoblaciones de células T	ND
CD36	+ (microvascular)		Plaquetas, monocitos maduros, macrófagos y progenitores eritroides
CD105 (Endoglin)	activadas		Monocitos activados, macrófagos tisulares, células pre-B en médula fetal y precursores eritroides en médula ósea fetal y adulta	Células estromales de ciertos tejidos incluyendo médula ósea
CD106 (VCAM-1)	activadas		Células dendríticas foliculares, ciertos macrófagos tisulares  células interdigitantes	Células mesenquimales
CD133	-	+	Subpoblaciones de células madre
CD144 (VE-Caderina)	+	+
CD146 (Muc 18, S-ENDO)	+		Subpoblaciones de células T activadas ¿ ?
Receptor del FCVE2 (KDR)	+	+	Subpoblaciones de células progenitoras	Melanoma y músculo liso
FvW	+		Plaquetas
BS-1	+		Células mieloides
UEA-1	+		Células mieloides
LDL acetilado	+	+	Células mieloides
Tie-2/Tek	+	+	Progenitoras ¿ ?

 

+: positivo;  - : negativo;  FCVE2: factor de crecimiento vascular endotelial tipo 2; FvW: factor von Willebrand.

 El término CPE ha sido utilizado para describir diferentes poblaciones celulares como las CPE primarias y la progenie de CPE cultivadas; y aunque las características que definen la maduración de estas células no han sido definidas, se considera que la pérdida del marcador de membrana CD133 distingue la CPE de la CE madura.^68-70 Esto se ha observado en células que expresan los antígenos CD133, el receptor para el factor de crecimiento vascular endotelial (RFCVE) 2 y la molécula CD34 (células CD34+/CD133+/FCVE2+), que pueden diferenciarse en células de linaje endotelial in vitro y contribuyen a la neovascularización en modelos animales de isquemia.^71-75 Sin embargo, la CMH podría coexpresar también estos antígenos, por lo que algunos investigadores denominan a estas células como hemangioblastos. La más primitiva CMH se caracteriza por un fenotipo específico: CD34^- o CD34⁺/CD38^-/low/Thy-1⁺ /CD90+/Kit^-lo/Lin^-/CD133 ⁺/receptor para FCEV2 (CD34+/CD133+/RFCVE2+) bipotencial del cual derivan ambos tipos celulares, células endoteliales y hematopoyéticas.⁷⁶ Pelosi y otros han demostrado que las células CD34+/RFCVE2+ procedentes de la médula ósea y del cordón umbilical son capaces de formar colonias mixtas hematopoyéticas-endoteliales in vitro que podrían representar hemangioblastos⁷⁷ (figura).

Se considera que las células de médula ósea con un marcador de linaje negativo CD117⁺(c-kit+), podrían inducir neovascularización del miocardio isquémico y mejoramiento de la función cardíaca en el modelo de infarto de miocardio en el ratón, lo que sugiere que las CPE están contenidas en esta población.⁷⁸ También se ha demostrado que las células MAPCs pueden formar células capaces de diferenciarse en células que expresan marcadores de endotelio maduro CD31+/CD36+/factor von Willebrand+.⁷⁹ Estas células favorecen la angiogénesis tumoral y participan en preservar el estado de salud en el individuo sano. Se ha demostrado que las CPE se derivan de células de médula ósea cultivadas con una elevada capacidad proliferativa.⁷⁹

AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CPE

La mayoría de los estudios in vitro no han logrado definir un método de condiciones de cultivo estandarizado para aislar y cultivar las CPE.⁸⁰ El método más frecuente consiste en el cultivo de células en plástico; tanto la fracción adherente como la no adherente contienen CPE, las células CD133+ o CD34+ son seleccionadas y cultivadas. Otros factores muestran gran variabilidad, como los factores de crecimiento utilizados: FCEV, factor de crecimiento de fibronectina-b y extracto de cerebro bovino, así como los sustratos de crecimiento, como la fibronectina, el colágeno tipo 1 y la gelatina, y el tiempo de cultivo.⁸⁰

CPE Y ENFERMEDAD

Las CPE circulantes pueden participar en la formación de nuevos vasos, por lo que son utilizadas en el tratamiento de diversos trastornos vasculares por su capacidad migratoria en la circulación y su capacidad de diferenciarse a nuevas células endoteliales que contribuyen a la angiogénesis y a la reparación del endotelio en tejidos y órganos distantes.⁸¹ Por lo tanto, esto sugiere que la inducción in vivo de la movilización de CPE derivada de la médula ósea hacia la circulación periférica, o la activación de CPE residentes en la pared vascular o tejidos dañados, puede representar una promisoria estrategia para promover la reparación vascular de áreas lesionadas.

Se ha observado que la inyección de células humanas aisladas del tipo de la subpoblación CD34^-/CD133⁺/RFCEV2⁺ /CD14^- en ratones desnudos con daño carotídeo, se asentaron a nivel del endotelio de la arteria carotídea. Las CPE generaron CE maduras que se incorporaron a la pared endotelial, lo que permitió una reducción del tamaño de la lesión.⁸²

No existen cifras bien definidas de las CPE en los individuos sanos. Diferentes estudios han descrito la influencia de condiciones patológicas del uso de determinadas drogas y de factores de crecimiento sobre el número de CPE in vivo. Por ejemplo, el número de CPE circulantes se ha reportado como disminuido en pacientes con riesgo de enfermedad coronaria^83,84 y en correlación negativa con el puntaje de riesgo cardiovascular, pero no se ha definido su valor pronóstico. Los niveles de CPE CD34+ KDR+ (KDR/flk-1 es el receptor que media la mayoría de los efectos angiogénicos y proliferativos del FCEV) están relacionados con la aparición de eventos y muerte de causa cardiovascular, y podrían ayudar a identificar a los pacientes con alto riesgo.⁸⁵ Sin embargo, existe una limitada capacidad de las CPE infundidas en pacientes con lesiones cardiovasculares en la formación vascular, lo que ha provocado una redefinición del potencial biológico de estas células, y actualmente el origen, el potencial proliferativo y la capacidad de diferenciación de las células endoteliales capaces de formar colonias (unidades formadoras de colonias) procedentes de la médula ósea, es controvertido, y se ha definido como un nuevo grupo celular a las células endoteliales formadoras de colonias procedentes de sangre periférica que tienen la capacidad de formar vasos con elevada capacidad proliferativa y que constituyen una posibilidad terapéutica para la revascularización. Las CPE circulantes derivadas de la médula ósea RFCVE2+ no generan células endoteliales vasculares, no contribuyen a la angiogénesis y no favorecen el crecimiento tumoral.^86,87

Las CPE de pacientes con diabetes mellitus tipo 2 se caracterizan por capacidad proliferativa disminuida, adhesión disminuida y capacidad reducida de formar vasos capilares in vitro. Los mecanismos responsables de estos hallazgos no se conocen, pero se atribuyen a una movilización disminuida de las CPE procedentes de la médula ósea, un incremento de su consumo o derivación hacia los sitios dañados o lesionados y una vida media reducida de las CPE.⁸⁸

En contraste, la isquemia límbica (del septum cardíaco),⁸⁹ el trauma vascular⁹⁰ y el infarto agudo del miocardio⁹¹ están asociados con un incremento rápido de CPE en la circulación. El tratamiento con diferentes inhibidores del 3-hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A o estatinas^92,93 y factores de crecimiento, incluida la eritropoyetina,⁹⁴ el FCVE ⁹⁵ y el factor estimulante de colonias granulopoyéticas y monocíticas (FSC-GM),⁹⁶ también incrementa el número de CPE in vivo. Las evidencias preliminares sugieren que ellos podrían actuar movilizando las CPE de la médula ósea y mejorando la supervivencia de las CPE por activación de la vía de la proteína cinasa 3/Akt (tabla 5).

 

Se ha observado que las CE circulantes en reposo y activadas se encontraban aumentadas en el cáncer de mama y en pacientes con linfoma.⁷¹ Aún más importante es que varios pacientes con linfoma que llevaron tratamiento con quimioterapia y estaban en completa remisión, tuvieron números de células endoteliales similares a los de individuos sanos. Esto podría indicar que la cuantificación de CPE podría ser usada como un marcador para evaluar la respuesta al tratamiento en enfermedades específicas. También en enfermos con anemia drepanocítica, endotoxinemia e infecciones por ricketsias, se ha observado un incremento de las CPE ⁹⁶ (tabla 4).

En este campo de la investigación ya se observan avances significativos en la estandarización de procesos de aislamiento, caracterización fenotípica y cultivo de CPE, que podrían constituir la base de terapéuticas futuras. También la cuantificación de las diferentes poblaciones de CE pudiera ser un elemento de utilidad en el diagnóstico y el manejo de la prevención de diferentes enfermedades.

El aislamiento, la expansión en cultivo, la caracterización fenotípica, y las propiedades funcionales de las CMM, CPE y CE maduras, puede variar en dependencia de la interacción directa con otras células o de la liberación de factores solubles específicos de cada microambiente. En la actualidad, es de gran interés profundizar en el estudio de estos tipos celulares en el contexto de localizaciones anatómicas particulares; y la generalización de su uso terapéutico debe considerar las variaciones observadas según la fuente de obtención, el grado de diferenciación, el número de células utilizadas y el microambiente donde se desean utilizar.

El avance en la identificación de la actividad biológica de cada una de estas poblaciones y subpoblaciones in vivo y los mecanismos moleculares responsables de cada una de sus funciones, permitirá el uso de la Medicina Regenerativa, no solo como una alternativa terapéutica para mejorar la evolución y pronóstico, sino como una solución a largo plazo para una amplia variedad de enfermedades.

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Recibido: 15 de junio del 2010.
Aprobado: 2 de julio del 2010.

DraC. Consuelo Macías-Abraham. Instituto de Hematología e Inmunología. Apartado 8070, CP 10800. Ciudad de La Habana, Cuba. Tel [phone], 8268. Fax [phone]. E-mail: [e-mail]