Artículo original

Introducción del genotipaje molecular de los antigenos plaquetarios

Introduction of molecular genotypingof plateles antigens

0000-0003-0472-4404Yisenia Romero Díaz^{1  *}  , 0000-0002-1156-2143Gilberto Soler Noda¹  , 0000-0002-6209-0393Antonio Bencomo Hernández¹ 

¹Instituto de Hematología e Inmunología, La Habana, Cuba

RESUMEN

Introducción:

Los antígenos plaquetarios humanos (HPA) se expresan en 6 glucoproteínas plaquetarias diferentes. Se ha descrito que estos antígenos pueden estimular la producción de aloanticuerpos una vez expuestos a plaquetas humanas con diferentes HPA, lo que provoca complicaciones clínicas como la trombocitopenia neonatal aloinmune y la púrpura postransfusional.

Métodos:

Se realizó el estudio a 11 muestras de pacientes en espera de trasplante renal de genotipo de los antígenos HPA-1,2,3 a/b mediante PCR multiplex, mientras que para el estudio de genotipo de los antígenos HPA-5a/b se utilizó la técnica de PCR con secuencia específica de primer. Los productos de ADN amplificados fueron visualizados mediante electroforesis en gel de agarosa y electroforesis capilar.

Resultados:

El análisis de los fragmentos de ADN amplificados revelaron resultados similares por ambos métodos. Para los antígenos HPA-1,-2, el 63 % de las muestras fueron homocigóticas para el fenotipo (a) mientras que se observó heterocigocidad en todos los casos para el genotipo HPA-3. En el sistema HPA-5, el 54 % fueron homocigóticas para el fenotipo (a) y el 46 %, heterocigóticas. Para el genotipo del HPA-15, el 4 % fueron homocigóticas para el fenotipo (b) mientras que el 96 % resultaron ser heterocigóticas.

Conclusiones:

Estos resultados muestran similitudes para los genotipos HPA 1, 2,3 a/b, HPA 5a/b y HPA15 a/brespecto a lo planteado en la literatura.

Palabras-clave: antígeno; genotipo; fenotipo; HPA 1, 2,3 a/b; HPA 5a/b; HPA15 a/b

ABSTRACT

Introduction:

Human platelet antigens (HPA) are expressed in 6 different platelet glycoproteins. It has been described that these antigens can stimulate the production of alloantibodies once exposed to human platelets with different HPA, which causes clinical complications such as neonatal alloimmune thrombocytopenia and postransfusional purpura.

Methods:

The study was performed on 11 samples of patients awaiting kidney transplantation of genotype of the HPA-1,2,3 a/b antigens by multiplex PCR, while for the genotype study of the HPA-5a/b antigens was used the PCR technique with primer-specificsequence. The amplified DNA products were visualized by agarose gel electrophoresis and by capillary electrophoresis.

Results:

The analysis of DNA fragments amplified by agarose electrophoresis and capillary electrophoresis revealed similar results in both methods. For the HPA-1, -2 antigens, 63% of the samples were homozygous for phenotype (a) while heterozygosity was observed in all cases for the HPA-3 genotype. In the HPA-5 system, 54% were homozygous for the phenotype (a) and 46% were heterozygous. For the genotype of HPA-15, 4% were homozygous for phenotype (b) while 96% proved heterozygous.

Conclusions:

These results show similarities for the genotypes HPA 1, 2.3 a/b, HPA 5a/b and HPA15 a/bwith respect to report in literature.

Key words: antigen; genotype; fenotype; HPA 1, 2,3 a/b; HPA 5a/b; HPA15 a/b

INTRODUCCIÓN

Los antígenos plaquetarios humanos(HPA, por sus siglas en inglés) se expresan en 6 glucoproteínas(GP) plaquetarias diferentes. Se ha descrito que estos antígenos (Ag) pueden estimular la producción de aloanticuerpos en individuos que se exponen a plaquetas humanas incompatibles.Lo que provoca trombocitopenia neonatal aloinmune (TNAI), púrpura postransfusional (PPT) y refractariedad plaquetaria (RP). En algunos casos la RP ocurre por la respuesta inmunológica contra antígenos no exclusivos de estas células como antígenos ABO y HLA de clase I.^{1,2,3,4,5,6,7)} Hasta la fecha han sido reportados alrededor de 29antígenos HPA, 12 de los cuales se han agrupado en los sistemas bialélicosHPA-1;2;3;4;5y15; de los que se conoce la frecuencia alélica en diferentes poblaciones.³⁾ Sin embargo,su frecuencia es aún desconocidaen la población cubana.

La determinación delgenotipo HPApermite corroborar las especificidades de los anticuerpos anti-HPA del pacientey proveer a este de unidades de concentrado de plaquetas de donantes HPA compatibles.^{7,8,9,10,11,12,13,14}

Basado en lo antes expuesto el objetivo de este trabajofue introducir y normalizar la determinación del genotipo HPA por técnica de PCR-SSP y PCR-multiplex en una muestra de pacientes con enfermedad renal crónica en espera de trasplanterenaly, comparar la lectura de los genotipos amplificados en electroforesis en gel de agarosa y capilar.

MÉTODOS

Obtención de la muestra

A partir de una muestra de sangre total de 11 pacientes se procedió a la centrifugación para separar el plasma de los eritrocitos. Se tomó la capa intermedia de buffycoat para realizar la extracción del material genético en el equipo de extracción de ADN Qiacube, según las instrucciones del fabricante.

Reacción de amplificación

Una vez realizada la extracción del material genético, se procedió la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) con los cebadores diseñados para el estudio de genotipo HPA1,2,3 a/b y HPA5a/b.^7,8 El estudio molecular correspondiente al genotipo HPA15 a/b se realizó con los cebadores correspondientes para el estudio de este genotipo; con una ligera modificación de la temperatura de alineamiento del segundo ciclo del programa a 58^oC.

El análisis de los productos amplificados se realizó mediante electroforesis en gel de agarosa y electroforesis capilar.

En todo momento se respetaron los principios básicos de la investigación biomédica en seres humanos.⁹

RESULTADOS

El análisis de los fragmentos de ADN amplificados, mediante electroforesis de agarosa y electroforesis capilar, reveló resultados similares en ambos métodos para todos los genotipos HPA investigados.

Para los antígenos HPA-1,-2, el 63 % de las muestras fueron homocigóticas para elfenotipo (a) mientras que se observó heterocigocidad en todos los casos para el genotipo HPA-3 (Fig. 1).

Línea 1:patrón de peso molecular, línea 2-11 productos de amplificación del genotipo HPA1,2,3a/b, línea 12 H₂O.

Fig. 1 Amplificación del genotipo HPA1,2,3 a/b en electroforesis en gel de agarosa al 2%. (A)y en electroforesis capilar (B).  

En el sistema HPA-5, el 54 % fueron homocigóticas para el fenotipo (a) y el 46 %, heterocigóticas (Fig. 2).

Línea 1: patrón de peso molecular, línea 2-11 productos deAmplificación del genotipo HPA5 a/b, línea 12 H₂O

Fig. 2 Amplificación del genotipo HPA5 a/b en electroforesis en gel de agarosa al 2% (A) y en electroforesis capilar (B) 

Para el genotipo del HPA-15, el 4 % fue homocigótica para el fenotipo (b) mientras que el 96 % resultó ser heterocigótica (Fig. 3).

Línea 1: patrón de peso molecular, línea 2-11 productos de amplificación del genotipo HPA15 a/b, línea 12 H₂O.

Fig. 3 Amplificación del genotipo HPA15 a/b en electroforesis en gel de agarosa al 2%(A) y electroforesis capilar (B) 

DISCUSIÓN

Las GP plaquetarias expresan múltiples estructuras polimórficas determinadas genéticamente, comolos antígenos HPA que pueden inducir alosensibilización por embarazos y reacciones postransfusionales.^3-6,10

Aunque la investigaciónse realizó con vistas a introducir y normalizar el protocolo de estudio del genotipaje HPA, tiene como limitación que sus resultados no son representativos de los pacientes estudiados, ni para inferir frecuencias poblacionales. No obstante, los resultados en este estudio para los fenotipos HPA1, 2,3 (a/b)son similares a los reportados en una muestra de población asiática, en la que observó mayor prevalencia del fenotipo HPA1a y HPA2a.¹¹⁾ Estudios recientes han demostrado que diversos procesos de aloinmunización se encuentran fuertemente asociados a la presencia del fenotipo HPA 1b,^12-14) por lo que el mayor riesgo de aloinmunización y de desarrollar de RP lo pueden presentar aquellos pacientes homocigóticos para el genotipo a. Sin embargo,en estudios realizados en una población caucásica se detectó heterocigocidad para estos genotipos,¹⁵ resultado similar al del presente estudio para el fenotipo HPA3 a/b.No obstante, el número de casos estudiados es demasiado pequeño y por tanto no es significativo de la población cubana.

En el caso del fenotipo HPA5 a/blos resultados fueron similares a lo reportado en la literatura,¹⁶⁾ por lo que se espera que estos pacientes presenten una mayor probabilidad de aloinmunización al enfrentarse a plaquetas que presenten el fenotipo b; mientras que para aquellos pacientes que resultaron heterocigotos el evento de aloinmunización no es posible,pues muchos autores han reportadoque estos eventos están mayormente asociados al fenotipo a del sistema HPA 5.¹⁷

El genotipo HPA-15 mostró un predominio de heterocigocidad, similar a lo reportado por otros autores,^18,19 por lo que se espera un menor riesgo de aloinmunizaciónpara este sistema.

El análisis de los productos amplificados mediante electroforesis capilar permitió una mejor visualización, precisión, resolución y disminución en el tiempo de análisis con respecto a lo observado en electroforesis convencional.

Sin embargo, la frecuencia de estos fenotipos en la población cubana no se conoce, por lo que realizar una comparación entre estos resultados y lo planteado en la literatura resulta complejo.Por tanto, la normalización de la técnica permitirá realizar posterioresinvestigaciones para determinar la frecuencia de los genotipos HPA en la población cubana.

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Recibido: 31 de Octubre de 2018; Aprobado: 04 de Junio de 2019

^*Lic. Yisenia Romero Díaz ([e-mail])

No se declara ningún conflicto

Yisenia Romero Díaz: realizó contribuciones sustanciales a la concepción y diseño del trabajo, la obtención, análisis e interpretación de datos, la redacción y la corrección del manuscrito y aprobó la última versión presentada.

Gilberto Soler Noda: participó en la concepción y diseño del trabajo, el análisis e interpretación de datos, la redacción, corrección del manuscrito y probación la versión final presentada.

Antonio Bencomo Hernández: participó en la concepción y el diseño del trabajo, el análisis e interpretación de datos, la redacción y la corrección del manuscrito. Aprobó la versión final presentada.