Trabajos de Revisión

Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas "Victoria de Girón"

El estrés oxidativo en la conservación de órganos

Dr. Félix Broche Valle, Dr. José García Piñeiro, Lic. Marisol Peña Sánchez y Dra. Ana Delgado Gutiérrez

RESUMEN

Se revisan los mecanismos moleculares del daño celular oxidativo de isquemia-reperfusión con referencias a estudios experimentales y clínicos que aportan evidencias de la participación de las especies reactivas del oxígeno en este proceso y del posible efecto protector de compuestos con actividad antioxidante en relación con la conservación de órganos y tejidos aislados para transplante o injerto.

Palabras clave: CONSERVACION DE TEJIDO; PRESERVACION DE ORGANOS; ESTRES OXIDATIVO; ESPECIES DE OXIGENO REACTIVO; REPERFUSION MIOCARDICA.

INTRODUCCION

En la actualidad con el desarrollo de las técnicas de implantación de injertos y transplantes de órganos se impone el perfeccionamiento y búsqueda de nuevas estrategias de conservación de órganos.

En este sentido se trabaja con relación al estrés oxidativo (EO)¹ que se expresa por una relación anormal entre especies de alto potencial oxidante, en particular las especies reactivas del oxígeno (ERO) y los sistemas que intervienen en su metabolismo a favor de las primeras con modificaciones en la relación estructura-función de los diferentes niveles de organización biológica.

El EO se identifica como mecanismo general de daño celular asociado a la fisiopatología de un número creciente de entidades con gran interés médico social.^2-5

En nuestros días se acepta la teoría del EO en condiciones de isquemia-reperfusión, compatible con los eventos metabólicos que transcurren al interrumpirse la perfusión de un órgano, conservarse en un medio aislado y reperfundirse al ser implantado en un organismo receptor, así como durante la parada cardiocirculatoria en las intervenciones para reparación quirúrgica de malformaciones cardiovasculares.

La oxidación radicálica de los lípidos de membrana^6,7 y transconformaciones en las proteínas se han señalado como las principales modificaciones en la relación estructura-función de las membranas celulares como expresión del daño celular oxidativo (DCO).⁷

PAPEL DE LAS ERO EN EL DAÑO CELULAR OXIDATIVO DE ISQUEMIA/REPERFUSION

El agotamiento de las reservas intracelulares de adenosín trifosfato (ATP) en un tejido hipóxico se asocia con incapacidad para mantener el balance iónico, modificaciones en la homeostasis del calcio, disfunción mitocondrial, liberación de enzimas hidrolíticas, activación de sistemas como la fosfolipasa A₂ y enzimas vinculadas al metabolismo del ácido araquidónico, entre otros eventos involucrados en el complejo mecanismo del daño celular por hipoperfusión.⁷

Adicionalmente aparecen modificaciones en la permeabilidad e integridad de la barrera endotelial, activación leucocitaria con cambios en la adhesividad intercelular, agregación plaquetaria y fenómenos de coagulación intravascular.^7,8

Aunque en la fase isquémica pueden generarse ERO en exceso o se alteran las barreras de defensa antioxidante, el EO no constituye la fuente principal de citotoxicidad en un tejido isquémico.^7,9

La reperfusión, que es un factor esencial en la recuperación del tejido,¹⁰ se acompaña paradójicamente de efec-tos de injuria celular que pueden focalizarse a nivel de:

- Generación de ERO.

- Acumulación de leucocitos y plaquetas con fenómenos de coagulación intravascular y edema intersticial.

- Respuesta inflamatoria aguda mediada por los neutrófilos y macrófagos tisulares.⁷

La enzima xantina oxidasa (XO) se considera una importante fuente endógena generadora de radical superóxido.⁷ Es una enzima aparentemente constitutiva que en la mayoría de los tejidos existe como xantina deshidrogenasa (XD) NAD⁺ dependiente que puede convertirse en la forma oxidasa por proteólisis parcial, entre otros factores.¹¹

No obstante, algunos trabajos aportan evidencias contradictorias con relación al significado biológico y fisiopatológico de la XO.¹¹

Numerosas investigaciones relacionadas con el metabolismo del ácido araquidónico han demostrado la liberación de ERO como subproductos de las reacciones catalizadas por las enzimas ciclooxigenasa, lipooxigenasa y prostaglandina hidroperoxidasa.¹⁰

La autooxidación de las catecolaminas se ha propuesto también como factor coadyuvante en el DCO por reperfusión.⁷

La generación de ERO en las mitocondrias ha sido reportada y estudiada con particular interés en los últimos años.

Las células fagocíticas como parte de su mecanismo bactericida inespecífico, tras la activación del complejo NADPH oxidasa (flavoproteína + citocromo b₂₄₅) en presencia de múltiples estímulos liberan radical superóxido y H₂O₂, este último actúa como intermediario en la formación de ácido hipocloroso catalizada por la enzima lisosomal mieloperoxidasa.^7,12 La citotoxicidad del H₂O₂ y el ácido hipocloroso se ha verificado en células de diferentes tejidos y órganos.¹²

DAÑO MIOCARDICO DE ISQUEMIA-REPERFUSION

En el corazón de mamífero sometido a un breve período de isquemia global se reconoce un primer nivel de injuria caracterizado por las arritmias de reperfusión; con un período de isquemia entre 5 y 15 minutos puede instaurarse un déficit prolongado de la contractilidad ("stunning" miocárdico) como segundo nivel, en el que la mayor parte de las células afectadas deben conservarse aún viables; y finalmente, un tercer nivel en el que las células quedarán dañadas irreversiblemente.⁷

La liberación de enzimas intracelulares, incremento en la entrada de calcio a las células, cambios en la morfofisiología mitocondrial, reducción persistente de la contractilidad y eventual necrosis miocárdica son las principales modificaciones detectables al reperfundir el músculo cardíaco tras un período de isquemia relativa entre 40 y 60 minutos.

En la isquemia miocárdica se genera radical superóxido a partir de moléculas "residuales" de oxígeno en las mitocondrias, en tanto la organización estructural y funcional de estos organelos se modifica por la acción directa de las propias ERO y la acumulación de calcio, limitándose mucho más la fosforilación oxidativa.¹³

Paralelamente, se incrementa la concentración intracelular de xantina e hipoxantina (sustratos de la XO) por degradación del ATP y se promueve la conversión de la enzima XD en su forma XO.^7,9

La pérdida de la homeostasis intracelular del calcio por alteración de los sistemas que regulan el transporte del ion¹³ se convierte en un mecanismo de injuria celular con daño mitocondrial progresivo y activación de la enzima fosfolipasa A₂ con liberación de lisofosfolípidos¹⁴ cuyo potente efecto quimiotáctico in vivo es reconocido.

La defensa antioxidante mitocondrial dependiente de la enzima superóxido dismutasa (Mn-SOD) se deprime proporcionalmente con la intensidad y duración de la isquemia.¹³

La acumulación y oxidación posterior de las catecolaminas (enzimática o autocatalizada) se reconoce también como fuente de ERO en los eventos de isquemia-reperfusión miocárdica.⁷

Las células fagocíticas liberan radical superóxido y otras moléculas citotóxicas como parte de la respuesta inflamatoria aguda en los focos de necrosis hística.⁵

A través de un complejo mecanismo que parece involucrar a varias moléculas de "señalización", los leucocitos activados alcanzan el intersticio donde las ERO y enzimas hidrolíticas como elastasa, colagenasa, catepsinas e hialuronidasa conforman una importante fuente extracelular de daño miocárdico.¹⁵ La oxidación y otras modificaciones en la estructura de las proteínas pudieran constituir "marcadores" para la proteólisis en condiciones de EO.¹⁶

La participación leucocitaria en el DCO de isquemia-reperfusión en el miocardio puede asociarse también a la liberación concertada de varias citoquinas como interleukina 1 (IL-1) y factor de necrosis tumoral (TNF).¹⁷

Las interleukinas son capaces de inducir la activación de la isoenzima óxido nítrico (NO) sintetasa (no dependiente del calcio) a nivel de neutrófilos y macrófagos, evento asociado al proceso inflamatorio en varios órganos y en el que se le atribuye al aumento en la producción de NO (molécula radicálica con efecto citotóxico directo en altas concentraciones) un papel central en las alteraciones de la homeostasis local.¹⁸

La reoxigenación tisular de inicio se asocia al incremento en la formación de radical superóxido por la lenta recuperación de precursores para la síntesis de ATP y de la organización estructural y funcional de las mitocondrias, incluyendo los niveles adecuados de Mn-SOD. Asimismo, la XO en presencia de oxígeno genera ácido úrico y anión superóxido a partir de sus sustratos acumulados durante la fase isquémica.⁷

La respuesta antioxidante miocárdica incluye a los antioxidantes directos como las vitaminas C y E, carotenos, coenzima Q, así como la familia de enzimas SODs, enzimas glutation-dependientes y catalasa (CAT).^19,20

Las evidencias en torno a los mecanismos reguladores de la expresión de las enzimas antioxidantes son aún insuficientes, no obstante, se ha reportado la expresión diferencial de algunas de estas enzimas¹⁹ y en particular, la inducción independiente de la Mn-SOD por el TNF²⁰ y otras citoquinas.

Durante la isquemia-reperfusión miocárdica se ha reportado disminución en la concentración intracelular de glutatión reducido.²¹

Estudios in vivo e in vitro han verificado la participación de las ERO en el proceso de aterogénesis y el efecto protector de varios antioxidantes respecto a la evolución de sus manifestaciones anatomoclínicas,²² aspectos que deben considerarse a propósito de la conservación del órgano aislado.

ESTUDIOS EXPERIMENTALES Y CLINICOS SOBRE DAÑO CELULAR OXIDATIVO MIOCARDICO

Los mecanismos del DCO se evalúan a través de indicadores morfofisiológicos y bioquímicos. Igualmente se ensayan los efectos de diversos compuestos vinculados al bloqueo de estos mecanismos sobre la viabilidad celular.

Se ha demostrado que el bloque cardiopulmonar aislado en condiciones de hiperoxia es más vulnerable a la acción de la elastasa leucocitaria, fenómeno inhibido al tratarse previamente a los animales con tungsteno (inhibidor de XO).²³

Con el uso de alopurinol (inhibidor competitivo de la XO) en modelos experimentales de isquemia-reperfusión, se ha reportado la disminución en la frecuencia de aparición y severidad de los trastornos del ritmo y la contractilidad miocárdica, así como reducción en el área de infarto con preparaciones de corazón aislado e in vivo.⁷

La deferoxamina (agente quelante de iones férricos) se ha utilizado como tratamiento único o suplemento de las soluciones cardiopléjicas o de reperfusión, y se ha reportado mejor recuperación de los parámetros contráctiles y de la síntesis de ATP.¹⁰

El tratamiento previo con vitamina E redujo significativamente la actividad extracelular de la enzima lactato deshidrogenasa (LDH), con recuperación más rápida de la contractilidad miocárdica y otros parámetros hemodinámicos al reperfundir corazones de rata aislados en isquemia normotérmica.

La incubación de cardiomiocitos de ratón en presencia de ubiquinol incrementó la síntesis de ATP.²⁴ Disminuciones en la concentración plasmática de productos de lipoperoxidación (PLP), enzimas intracelulares y derivados del ácido araquidónico, así como reducción en la incidencia de arritmias ventriculares y otras alteraciones de la función cardíaca²⁵ también se han reportado con la utilización de ubiquinol en modelos de DCO miocárdico experimentalmente inducidos.

En determinadas condiciones el ascorbato y el ubiquinol pueden actuar como sustratos en la generación de ERO, principalmente radical superóxido.

Las enzimas antioxidantes se vienen utilizando con frecuencia creciente y se observan tendencias favorables en su efecto cardioprotector.

En corazón aislado de conejo se obtuvo mejor recuperación de la función contráctil y la síntesis de ATP, al reperfundir el órgano con soluciones isotónicas enriquecidas con SOD tras una isquemia global de 30 minutos.¹⁰

Con el uso de SOD se logró reducir significativamente la incidencia de arritmias y otros cambios en la electrofisiología ventricular al reperfundir el corazón de rata y fibras de Purkinje aisladas de corazones de perro tras períodos previos de isquemia.²⁶

Tamura y Chi señalaron la aplicación de tratamientos prolongados con SOD como condición para obtener efectos citoprotectores en la reperfusión miocárdica tras períodos variables de isquemia global.

Nuevos antioxidantes sintéticos se han ensayado con resultados favorables en modelos similares a los descritos.

ISQUEMIA-REPERFUSION EN OTROS TEJIDOS

La actividad de XO se ha señalado como la principal fuente endógena generadora de ERO en la mucosa del intestino delgado isquémico.⁷

La acumulación de neutrófilos activados en el curso de la isquemia intestinal ha disminuido significativamente con el uso de SOD+alopurinol.⁷

A partir del H₂O₂ y en presencia de iones férricos, en el intestino isquémico se genera radical hidroxilo, que actuaría como mediador de la liberación de histamina en la submucosa produciendo dilatación arteriolar como fenómeno compensatorio local. El bloqueo de esta respuesta se ha propuesto como virtual mecanismo antioxidante asociado a la inhibición de la enzima XO a partir de la reoxigenación progresiva del tejido durante la reperfusión.²⁷

La intensidad de la respuesta inflamatoria aguda y la severidad de las alteraciones morfológicas de los neumocitos asociadas a la reperfusión pulmonar posisquémica se han reducido con tungsteno y SOD.⁷

Merry postuló la relación entre el DCO y los procesos inflamatorios osteoarticulares a partir de una fuente de daño primario.²⁸

Evidencias adicionales sobre el significado fisiopatológico de los eventos metabólicos asociados al EO en condiciones de isquemia-reperfusión en otros órganos también se reportan en la literatura.⁷

Sin embargo se impone incrementar el tamaño muestral y orientar los diseños experimentales hacia la búsqueda de alternativas que resuelvan con sentido lógico los aspectos que aún constituyen incógnitas o son objeto de interpretaciones controversiales.

En este sentido, debe prestársele especial interés a la definición de indicadores de viabilidad celular generales y específicos para determinados órganos o tejidos,¹⁵ así como sus posibles correlaciones con los indicadores directos o indirectos del metabolismo oxidativo.

ESTRATEGIAS DE CONSERVACION DE ORGANOS

La cardiopreservación hipotérmica con soluciones cristaloides parece un método extendido en los programas de transplante cardíaco, no obstante se le atribuyen también efectos paradójicos. A las condiciones de hipotermia también se le asocian efectos de injuria celular.²⁹

En algunas estrategias de conservación ya se emplean combinaciones de antioxidantes³⁰ como suplemento de las soluciones convencionales de perfusión.

CONSIDERACIONES FINALES

Es evidente que la conservación de un sistema biológico (aislado o en el organismo íntegro) no puede limitarse al aporte de elementos nutritivos y otras condiciones convencionales.

Los mecanismos de regulación sistémicos que operan en el mantenimiento de la homeostasis y las fuentes de daño celular cuyos efectos se refuerzan con los procedimientos de extracción y almacenamiento de los órganos no pueden ignorarse, tratándose en particular de órganos y tejidos completamente diferenciados. Pero estos aspectos precisan de un enfoque multidisciplinario, problema cuya significación en términos del mejoramiento de la calidad de vida debe atraer la atención de la comunidad científica internacional aún a pesar de la diversidad de intereses y factores éticos o sociales que se asocian a las ciencias biomédicas en el mundo contemporáneo.

SUMMARY

A revisal is carried out on the molecular mechanism of the ischemia-reperfusion oxidative cellular damage, with references to experimental and clinical studies that furnish evidence of the involvement of the reactive oxygen species in this process, and of the protective effect of compounds with antioxidant activity related with the organ and isolated tissues preservation for transplantation or grafting.

Key words: TISSUE PRESERVATION; ORGAN PRESERVATION; OXIDATIVE STRESS; REACTIVE OXYGEN SPECIES; MYOCARDIAL REPERFUSION.

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Recibido: 26 de diciembre de 1995. Aprobado: 3 enero de 1996.

Dr. Félix Broche Valle. Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas "Victoria de Girón" Avenida 146 esquina 31, municipio Playa, CP 11600, La Habana, Cuba.