Trabajo de Revisión

Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas "Victoria de Girón"

Enzimas generadoras de especies reactivas del oxígeno: mieloperoxidasa

Lic. Onel H. García Morales, Dra. Nayade Pereira Roche y Dra. Rosa M. Flores Sánchez

RESUMEN

La defensa del organismo está mediada por las células del llamado sistema retículo endotelial, de las cuales los polimorfonucleares neutrófilos constituyen la primera línea de defensa inespecífica. La mieloperoxidasa es la proteína más abundante en los neutrófilos y es la única peroxidasa que cataliza la conversión del peróxido de hidrógeno y cloruro a ácido hipocloroso. Este es un potente agente oxidante que contribuye al mecanismo de defensa contra los agentes infecciosos; sin embargo, puede ser capaz de actuar sobre las células del hospedero en caso de activación incontrolable o excesiva e inactivar factores humorales. Dado el amplio espectro de reactividad, el ácido hipocloroso es un mediador de daño hístico en numerosos procesos inflamatorios. Se presentan algunas características físico-químicas, el mecanismo de reacción, la biosíntesis y la relación de la enzima mieloperoxidasa con diferentes procesos patológicos.

Descriptores DeCS: PEROXIDASA/metabolismo; PEROXIDASA/química; NEUTROFILOS/enzimología; ESPECIES DE OXIGENO REACTIVO.

La mieloperoxidasa (MPO, peróxido de hidrógeno oxidorreductasa, EC 1.11.1.7.) es una enzima ampliamente distribuida en el organismo y sus fuentes fundamentales las constituyen los leucocitos (neutrófilos y monocitos) y los macrófagos a pesar de que ha sido aislada a partir de diferentes fluidos biológicos (saliva, líquido sinovial y semen, entre otros)^1-3 y también de diferentes tejidos (corazón, riñón, piel, hígado y placenta).^4-8 No obstante las fuentes más empleadas son los neutrófilos, donde la enzima se encuentra localizada a nivel lisosomal, en los gránulos azurófilos. Constituye del 2-5 % de las proteínas del neutrófilo,⁹ con una concentración en sangre humana normal de alrededor del 1 nM.¹⁰

Esta enzima fue aislada por primera vez por Agner en 1941, denominándola verdoperoxidasa.¹¹ Posteriormente en 1958, el propio Agner la purificó en forma cristalina y en 1977 Harrison tuvo igual resultado.¹²

CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS

La MPO es una glicoproteína tetramérica, constituida por 4 subunidades formando 2 homodímeros. Cada uno de ellos contiene una subunidad a (pesada) de aproximadamente 59 kDa y una subunidad ß (ligera) de aproximadamente 14 kDa. El peso molecular de la enzima se estima entre 130-150 kDa.¹³ Las subunidades pesadas se unen a través de un enlace bisulfuro simple y a cada una de ellas se le une covalentemente un grupo prostético hemo.^13,14 Estas subunidades son las únicas glicosiladas y contienen entre 2-4 % de carbohidratos.¹³

Se reporta que esta proteína es fuertemente catiónica con un punto isoeléctrico mayor de 10 y su pH óptimo es de 5.^5,11,13

El contenido de aminoácidos se caracteriza por presentar aproximadamente 1 150 residuos, que se corresponden con 573 aminoácidos cada homodímero. De ellos 466 forman la subunidad pesada y 107 la subunidad ligera.¹⁵

El patrón espectrofotométrico muestra un máximo de absorbancia a 430 nm, con otros picos a 375, 575, 620 y 690 nm.¹⁶ Se reporta una relación de absorbancia 430/280 nm entre 0,80 y 0,87 para una solución de esta enzima pura.^15,17,18

MECANISMO DE REACCIÓN

Los neutrófilos contienen 4 formas de MPO, las cuales se denominan compuesto I, compuesto II, compuesto III y MPO nativa o férrica, con una similitud en su composición aminoacídica y actividad, así como en sus propiedades ópticas. No obstante se han observado diferencias en relación con la intensidad de absorción a 430 nm y 620 nm.¹⁷ El sistema MPO-peróxido de hidrógeno (H₂O₂) - haluro ha sido un sistema bien estudiado (fig. 1).^19-21 La MPO reacciona con el H₂O₂ proveniente de las células fagocitarias activadas por contacto con partículas extrañas, formando un complejo enzima-sustrato con una fuerte capacidad oxidativa (reacción 1). Este complejo se combina con el haluro, generalmente cloruro, que se oxida para formar el ácido hipocloroso (HOCl) (reacción 2). El compuesto I puede ser reducido a compuesto II por un exceso de H₂O₂. Por ejemplo, concentraciones mayores a 20 m M lo transforma parcialmente y mayores de 200 m M completamente, o por la presencia de un agente reductor (AH₂ ) como por ejemplo el ditiotreitol, cisteína, glutatión y cisteamina (reacción 3). Este compuesto II, a pesar de ser bastante estable puede reducirse a MPO férrica en presencia de un agente reductor o el radical superóxido (O₂ ) (reacción 4) o también puede oxidarse a compuesto III bajo concentraciones elevadas de H₂O₂ (2-3 mM) (reacción 5). Por otra parte la MPO nativa puede ser oxidada por el O₂ a oximieloperoxidasa (compuesto III) (reacción 6). Fig. 1. Mecanismo de reacción de la mieloperoxidasa.

Además puede funcionar como genuina oxidasa (fig. 2), de tal forma que va a depender del oxígeno y no del H₂O₂ como cosustrato para la oxidación de compuestos.¹⁸

Fig. 2. Función oxidasa de la mieloperoxidasa.

En presencia de un agente reductor (RSH), la enzima se reduce a la forma ferro, que se oxida en presencia de O₂ para dar lugar al compuesto III que tiene capacidad oxidante.

El ácido hipocloroso (reacción 2) es un potente agente oxidante que si bien contribuye al mecanismo de defensa contra los agentes infecciosos, puede actuar sobre las células del hospedero lo que provocaría inactivación de a a-antiproteinasa, entrecruzamientos de proteínas y reacción con ácidos grasos insaturados para formar clorohidrinas, las cuales pueden desestabilizar las membranas celulares. De aquí que el HOCl es un candidato a causar mucho del daño mediado por neutrófilos en enfermedades inflamatorias.¹⁹ El HOCl puede reaccionar con otra molécula de H₂O₂ y dar lugar al oxígeno singlete (reacción 7) o reaccionar con aminas para formar las N-cloraminas que son altamente reactivas y presentan un largo tiempo de vida media (reacción 8).²²

HOCl + H₂O₂ ® HC1 + H₂O + O₂^* (reacción 7)

HOCl + R-NH₂ ® R-NHCl + H₂O (reacción 8)

INHIBIDORES

Se han reportado diferentes drogas como: la dapsone, benzocaína, primaquina y famotidina, las cuales inhiben a la MPO secuestrando a la enzima en forma de compuesto II;^23-25 por otro lado los antihipertensivos como la hidralacina, además de la indometacina y los salicilatos.^26,27 El cianuro y la azida de sodio también han sido reconocidos como inhibidores de la MPO, si bien no se conoce el mecanismo por el cual la inhiben.

BIOSÍNTESIS

La biosíntesis de la MPO es un proceso complejo que incluye la formación de una proenzima a partir de una pre-proenzima. La enzima activa se obtiene a partir de la maduración de la proenzima,²⁸ que tiene lugar en los lisosomas, en la fase promielocítica de la diferenciación del neutrófilo.²⁰

William y otros propusieron un modelo para explicar el proceso de biosíntesis de esta enzima (fig. 3).²⁸ El producto primario de la traducción del mRNA de la MPO es un péptido simple de 80 kDa que sufre ruptura cotraduccional del péptido señal y glicosilación en 5 sitios (residuos de Asparagina), resultando en una especie de 92 kDa, que es rápidamente fragmentada por glucosidasa I para generar la apoproteína de 89 kDa. Esta especie es localizada en el retículo endoplásmico y es extremadamente estable. Estos autores especulan que el próximo evento es la inserción del grupo hemo en la apopro-MPO, que ha indicado ser un evento del retículo endoplásmico (RE) según tinción específica para peroxidasas. Posteriormente la pro-MPO es fosforilada, más probable después de salir del RE porque los residuos fosfomanosil son generados en un compartimiento pos-RE, pre Golgi. La pro-MPO fosforilada tiene un tiempo de vida media muy corto y es proteolíticamente procesado a MPO madura en un compartimiento prelisosomal, liberándose el propéptido de la pro-MPO intracelular.

Fig. 3. Mecanismo propuesto para la biosíntesis de la mieloperoxidasa.

ACTIVIDAD Y ENFERMEDAD

El incremento de la actividad de la MPO se ha reportado en varios procesos patológicos y está asociada con un aumento del riesgo al estrés oxidativo, como en el caso de las enfermedades infecciosas (generales o locales), las enfermedades inflamatorias (artritis reumatoidea) y la isquemia/reperfusión.

En estos casos se reporta un aumento significativo de la actividad de MPO, en proporción directa al número de neutrófilos infiltrados en el tejido, por lo que se puede utilizar su actividad como índice de migración leucocitaria y por lo tanto de estrés oxidativo.^7,29-35

Enfermedades del sistema respiratorio

En la fibrosis quística, la actividad MPO está aumentada proporcionalmente al grado de obstrucción de las vías respiratorias que presentan estos pacientes. La enzima por la vía de inactivación de la a -1 antiproteasa contribuye a incrementar la actividad de la elastasa de los neutrófilos sobre la elastina pulmonar, la cual desempeña una importante función en la fisiopatología de la enfermedad.^36,37

Con respecto al daño pulmonar en pacientes fumadores se reporta que en fumadores inveterados hay un incremento de ácidos grasos saturados libres que afectan el metabolismo oxidativo de los polimorfonucleares. Se produce un aumento de la actividad MPO y la producción de HOCl, con lo que se amplifica el daño oxidativo mediado por esta enzima en los pulmones.³⁸

Enfermedades del sistema circulatorio

La MPO es capaz de generar especies reactivas que dañan lípidos y proteínas,^39,40 y parece contribuir a la aterogénesis a través de las reacciones oxidativas que ésta cataliza. El sistema MPO-H₂O₂ al tener como sustrato la L-tirosina produce el radical tirosilo, que es capaz de estimular la peroxidación lipídica. Esta peroxidación es vital para la transformación de las LDL en partículas aterogénicas.³⁹

Enfermedades del sistema digestivo

Estudios en pacientes con cirrosis hepática y hepatitis crónica muestran niveles aumentados de MPO. Cuando se acompañan de esplenomegalia este ascenso es mayor. El incremento es siempre más evidente en la primera entidad. Lo anterior sugiere la función de la MPO en la fisiopatología del hiperesplenismo relacionado con estas enfermedades.⁴¹

Enfermedades del sistema hemolinfopoyético

La MPO se utiliza como índice de diferenciación entre las leucemias linfoblásticas y mieloblásticas, por el aumento de la enzima en estas últimas.⁴²

En los pacientes sicklémicos se reportan aumentos significativos de MPO, con una correlación inversa a la concentración de hemoglobina, lo que sugiere que los polimorfonucleares y el sistema de complemento participan en los mecanismos fisiopatológicos de la enfermedad.⁴³

Se ha encontrado que el sistema MPO-H₂O₂ -Cl es capaz de inactivar las células infectadas por el HIV tipo 1.⁴⁴ En este mecanismo se utiliza el H₂O₂ elaborado por las propias células infectadas sin necesidad de H₂O₂ exógeno. En estudios in vitro se demostró que la actividad antiviral se logra a concentraciones bajas de MPO, concentraciones mayores resultan citotóxicas.

Otras enfermedades

La función de la MPO en la patogénesis de la catarata se demostró al evaluar el efecto de la MPO sobre el cristalino de animales viejos, en los cuales se produjo opacidad del lente.⁴⁵

Los niveles de lipoperóxidos (LPO) y MPO en el vítreo de pacientes vitrectomizados con retinopatía diabética proliferativa se encuentran aumentados, lo cual sugiere que la producción de especies reactivas del oxígeno (ERO) y los mecanismos inflamatorios participan en la patogénesis de la enfermedad.⁴⁶ Estos niveles se encuentran elevados en la retina de pacientes con melanoma coroidal, lo que evidencia su relación con la retinopatía asociada al tumor.⁴⁷

En los pacientes con trisomía 21 se encuentran bajos niveles de superóxido y una actividad reducida de MPO, por lo que se produce un desbalance en la producción de ERO en los neutrófilos de esos niños y hace que aumente el daño oxidativo en estos pacientes.⁴⁸

SUMMARY

Organism´s defence is mediated by cells of the so-called reticuloendothelial system, of which, nautrophils polymorphonuclear, are the first line of nonspecific defense. Myeloperoxidase is the more abundant protein in neutrophils, and is the sole peroxidase catalising hydrogen peroxide and chloride donversion to hypochlorous acid. This es a powerful oxidative agent leading to defense mechanism against infectious agents; however, is able to act on host cells in case of uncontrollable or excessive activation, and in the humoral factors inactivation. In view of the ample spectrum of reactivity, hypochlorous acid is a mediator of tissue damage in many inflammatory process. Authors present some physico-chemical features, mechanism of action, biosynthesis, and relation of myeloperoxidase with different pathologic process.

Subject headings: PEROXIDASE/ metabolism; PEROXIDASE/ chemistry; NEUTROPHIS/ ensymology; REACTIVE OXIGEN SPECIES.

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Recibido: 26 de junio de 1997. Aprobado: 30 de octubre de 1997.

Lic. Onel H. García Morales. Instituto Superior de Ciencias Básicas y Preclínicas "Victoria de Girón". Ave 146 y 31 No. 3102, Playa, La Habana 16, CP 11600, Cuba.