Trabajos Originales

Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”

Rediseño y estandarización de un método inmunoenzimático para detectar anticuerpos anti-estreptoquinasa en muestras de suero humano

Lic. Lien López Matilla, Dr. Antonio González Griego, Dr. Jorge Arturo Santiesteban Torres y Dra. Alina Alerm González

Resumen

Se procedió a estandarizar un método inmunoenzimático, heterogéneo, cualitativo, tipo sandwich de doble antígeno para la detección de anticuerpos contra la estreptoquinasa en muestras puras de suero humano. Se ensayaron diferentes concentraciones del antígeno de recubrimiento y diluciones del conjugado, así como diferentes tiempos y temperaturas de incubación de las muestras. Se estableció el valor de corte del ensayo y su límite de detección y se comprobó si existían inespecificidades. Se determinó como concentración óptima de recubrimiento 0,1 µg/mL para una dilución del conjugado de 1:100 000. Las condiciones óptimas de incubación de las muestras fueron 30 min a temperatura de laboratorio y no se comprobaron interferencias de otros analitos con la técnica. Se establecieron como valores normales de la técnica las densidades ópticas que se encuentran entre 0,282 y 0,654.

DeCS: ESTREPTOCINASA/análisis; TEST DE ELISA/normas; STREPTOCOCCUS; INFECCIONES STREPTOCOCCICAS/diagnóstico; TEST SEROLOGICOS.

 

El género Streptococcus se encuentra ampliamente distribuido en la Naturaleza. Algunas de las especies forman parte de la flora normal de la garganta, piel e intestino pero causan enfermedad cuando colonizan los tejidos o la sangre, donde pueden causar síntomas manifiestos o evolucionar de forma inaparente o subclínica; se detectan por la presencia de anticuerpos (Ac) contra el microorganismo o por la existencia del microorganismo mismo.1 Las enfermedades estreptocócicas siguen constituyendo un problema de salud mundial, independientemente de las condiciones climáticas, ecológicas y culturales. Al finalizar el siglo xx, las infecciones por estreptococos del grupo A con secuelas supuradas y no supuradas y las infecciones del grupo B representan todavía causas de morbilidad y mortalidad.2

La aparición de fiebre reumática y las infecciones estreptocócicas graves como el síndrome de choque tóxico, las erisipelas y la fascitis necrosante, constituyen un reto para los medios de atención primaria y las autoridades de salud pública, tanto en los países industrializados como los que están en vías de desarrollo.3

Las sustancias extracelulares como toxinas y enzimas liberadas por los estreptococos son diversas, hecho que se relaciona con la gran variedad de enfermedades que causan en los animales y en el hombre. Estas sustancias son de gran interés, tanto por su papel en la patogenia de infecciones estreptocócicas como por el valor diagnóstico que tiene la demostración de Ac específicos contra algunas de ellas. Más de 20 productos extracelulares antigénicos son elaborados por los estreptococos, la estreptoquinasa (SK) es uno de los de mayor significación.4

La SK, producida por muchas cepas de estreptococos b hemolíticos, es una proteína inmunogénica que induce la formación de Ac específicos y es fisiológicamente una fibrinolisina, porque se une al pro-activador del plasminógeno y lo activa y transforma en plasmina; enzima proteolítica activa que digiere la fibrina y otras proteínas, disuelve trombos in situ y embólicos, por lo que interviene en el proceso infeccioso y evita la formación de coágulos de fibrina que de ordinario detienen la hemorragia y la diseminación de la infección.4

Ante la relación definitiva entre infección estreptocócica y fiebre reumática aguda, desde hace varios años se estableció la importancia de reconocer por medios inmunológicos la existencia de la infección usando métodos serológicos que definan la respuesta humoral contra distintos productos extracelulares de los estreptococos.3

En experimentos realizados por este grupo de investigación utilizando en la fase de recubrimiento heberkinasa, producto fabricado en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnogía (CIGB) y que contiene además de la proteína de interés para este estudio, la albúmina humana, en una cantidad que supera 25 veces la de estreptoquinasa, se fijó para las muestras la dilución de 1:100 en tampón fosfato salino. En esa experiencia, al comparar las densidades ópticas de las muestras puras y diluidas se observó que las muestras diluidas tenían mayor absorbancia que las puras y que al realizar diluciones dobles seriadas no se observaba linealidad. Es por ello que se decidió rediseñar y estandarizar el ensayo inmunoenzimático ligado a enzima (ELISA), para detectar Ac anti-SK empleando SK recombinante en forma de materia prima activa en la fase de recubrimiento y conjugado, y utilizar las muestras en forma pura para eliminar posibles interferencias del tampón de dilución.

Métodos

Diseño del método

Ensayo inmunoenzimático, heterogéneo, tipo sandwich de doble antígeno, conjugado en una de las fases con peroxidasa de rábano picante para la detección de Ac anti-SK.

Antígeno de recubrimiento

Se empleó estreptoquinasa recombinante con una concentración de 25,4 mg/mL, obtenida en el Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de Ciudad de La Habana (CIGB) a partir de la inserción en el genoma de Escherichia coli del gen que codifica para la estreptoquinasa en el Streptococcus equisimilis.

Conjugado

El conjugado se obtuvo según el método de conjugación descrito por Nakane y Kawaoi,5 utilizando peroxidasa de rábano picante (HRP, tipo VI, 268 U/mg sólido, RZ: 3,1, Sigma) y estreptoquinasa recombinante a partir de una concentración inicial de 420 mg/mL.

Control positivo

Mezcla de sueros de donantes voluntarios del Banco de Sangre del Municipio Marianao, Ciudad de La Habana.

Control negativo

Suero normal de carnero.

Fase sólida

Placas de 96 pocillos de cloruro de polivinilo, fondo plano y 280 mL de volumen (Titertek Flow Laboratories, Irvine, Scotland).

Sensibilización de la fase sólida y dilución del conjugado

Se ensayaron 4 concentraciones diferentes del antígeno de recubrimiento: 0,1 mg/mL, 2,5 mg/mL, 5 mg/mL y 10 mg/mL diluido en tampón carbonato-bicarbonato pH= 9,6; 0,05 M añadiendo 100 mL por pozo y se incubó 1 h a 37 °C. Posteriormente se añadieron los controles positivo y negativo puros y se incubaron 16 h a 22-25 °C (temperatura de laboratorio). Se evaluaron 4 diluciones diferentes del conjugado con cada una de las concentraciones del antígeno de recubrimiento muestreadas. Las diluciones del conjugado utilizadas fueron 1/12 500, 1/25 000, 1/50 000 y 1/100 000. Se empleó como diluente del conjugado tampón fosfato salino 0,1 M pH= 7,2 con leche descremada y tween 20 a 0,5 % cada uno. Se añadieron 100 mL por pocillo.

Entre cada paso del ensayo se efectuaron 3 lavados con tampón de lavado (tampón fosfato salino 0,1 M pH= 7,2 y tween 20 a 0,005 %). Se añadieron 200 ml por pozo con un tiempo de 30 s entre un lavado y otro, se empleó el lavador de placas de ELISA de la marca Organon Teknika.

Como último paso se añadió el sustrato de la enzima que consiste en H2O2 y como grupo cromógeno 1 mg/mL de o-fenilendiamina, se diluyó en el tampón de revelado (tampón fosfato-citrato 0,1 M pH= 5,5), se añadieron 100 mL por pocillo. Las placas se incubaron durante 30 min a temperatura de laboratorio y se dettuvo la reacción con 50 mL H2SO4 3 M. La lectura se realizó a 492 nm en lector de microplacas de la marca Organon Teknika y la densidad óptica (DO) obtenida resultó proporcional a la concentración de Ac en la muestra.

Condiciones termodinámicas y cinéticas

Tiempo y temperatura de incubación de las muestras: Para determinar el tiempo y la temperatura óptima de reacción de las muestras se ensayaron puras por duplicado durante 2 h, 1 h y 30 min a 37 °C, 4 °C y a temperatura de laboratorio en cada uno de los diferentes tiempos.

Dilución del control negativo

Se ensayó el suero puro, diluido 50 y 100 veces en tampón fosfato salino y cada dilución se probó 6 veces en una misma placa.

Límite de detección

Para evaluar el límite de detección el control negativo se evaluó en 10 ocasiones por duplicado. Se calculó la media y la desviación estándar (DE) de los valores de DO obtenidos y se estableció como valor límite la concentración que se corresponde con el valor de la media más 2 desviaciones estándar.

Estimación del valor de corte

Se evaluaron 300 muestras provenientes de donantes del Banco de Sangre del municipio Marianao, Ciudad de La Habana. Se calculó +DE y -DE. Se aceptaron como normales los valores de DO que estuvieran dentro de ese rango.

Determinación de inespecificidades

Se evaluó la posible interferencia de factor reumatoideo, albúmina, leche y suero hemolizado libre de Ac anti-SK con el ensayo. Para ello se recubrió una placa con suero de un paciente con alto título de Ac contra el factor reumatoideo diluido 50, 100, 1 000 y 10 000 veces; el mismo procedimiento se realizó con el suero hemolizado. En el caso de leche y albúmina se partió de una concentración de 10 mg/mL y a partir de esta se realizaron 3 diluciones doble seriadas que también se ensayaron como diluciones de recubrimiento.

Se ensayó además una placa como confirmatorio donde se añadieron las muestras puras y los controles positivo y negativo; las muestras se analizaron por duplicado y a uno de los pocillos se le añadió junto al conjugado 50 ml de estreptoquinasa recombinante.

Evaluación estadística

Se realizó siguiendo algunos indicadores establecidos por el Comité Europeo de Estándares de Laboratorios Clínicos para la evaluación de ensayos inmunoenzimáticos cualitativos.6 Se tuvo en cuenta el valor de la constante de discriminación (K), este parámetro se define como la relación entre la media de las DO de los controles positivo y negativo y se empleó para evaluar la influencia de diferentes condiciones o variables.

Resultados

En la tabla 1 se presentan los valores de K de las diferentes concentraciones de recubrimiento y conjugado ensayadas.
Se escogió como concentración de recubrimiento 0,1 mg/mL y dilución de conjugado 1: 100 000.

Tabla 1. Valores de K con la utilización de las diferentes combinaciones de concentración de recubrimiento y conjugado

Concentración de recubrimiento (mg/mL)
		10	5	2,5	0,1
Dilución	1: 12 500	28,2	26,4	25,6	24
del	1: 25 000	23,6	23,3	20,8	19,4
conjugado	1: 50 000	17,2	16,1	14,6	13,7
	1:100 000	12,5	10,8	9,5	8,5

En la tabla 2 se muestran las DO de las muestras para cada una de las temperaturas y tiempos de incubación ensayados.

Tabla 2. Valores de DO de las muestras al emplear diferentes combinaciones de temperatura y tiempo de incubación para las muestras

DO muestras corregidas
Parámetros	Muestra 1	Muestra 2	Muestra 3	Muestra 4
2 h a 37 °C	1, 726	1, 657	1, 337	1, 601
2 h a 22-25 °C	1, 619	1, 514	1, 213	1, 100
2 h a 4 °C	1, 450	1, 350	1, 110	1, 003
1 h a 37 °C	1, 399	1, 400	1, 263	1, 381
1 h a 22-25 °C	1, 120	1, 190	0, 896	0, 921
1 h a 4 °C	0, 944	0, 963	0, 747	0, 892
½ h a 37 °C	1, 061	1, 130	1, 054	1, 191
½ h a 22-25 °C	0, 662	0, 619	0, 423	0, 605
½ h a 4 °C	0, 519	0, 445	0, 338	0, 518

Dilución del control negativo

El control negativo no mostró diferencias en la señal de DO entre las diferentes diluciones ensayadas.

Límite de detección

Se obtuvo como límite de detección el valor de 0,082.

Estimación del valor de corte

El valor de la de los valores de DO de los donantes muestreados fue 0,468 con una DE de 0,186, por lo que con el cálculo de la +DE y -DE, se aceptan como valores normales los que se encuentren entre 0,282 y 0,654. Los resultados se expresan en la cantidad de DE que el valor de la muestra corregida (DO muestra- control negativo) fuera del rango normal supera o disminuye la media.

Inespecificidades

No se encontró interferencia del factor reumatoideo, albúmina, leche y suero hemolizado con el ensayo, porque no se observó señal en DO por encima del límite de detección del ensayo.
En el caso del confirmatorio en los pocillos donde se añadió junto al conjugado la estreptoquinasa recombinante, se observó el consumo de Ac anti-SK por la caída de la señal de DO de hasta 6 veces la DO inicial.

Discusión

A la hora de seleccionar las condiciones óptimas del recubrimiento y conjugado se escogió la combinación de estas concentraciones que mostrara una K aceptable (por encima de 5) y que los valores de DO de los controles positivos se encontraran entre 0,2 y 0,8 (intervalo donde se cumple la Ley de Lamber-Beer para estos analitos), pues por las experiencias adquiridas por el Departamento y lo reportado por otros autores,6-9 la mayoría de los humanos tienen altos niveles de Ac anti-SK por causa de la puesta en contacto con estreptococos b-hemolíticos.

La combinación escogida permite mantener una buena sensibilidad en el ensayo con un ahorro de reactivos, pues como puede observarse en la tabla 1, fueron la menor concentración de recubrimiento y la mayor dilución de conjugado las que se seleccionaron como ideales para el trabajo.

Como se observa en la tabla 2, las combinaciones de temperatura y tiempo de incubación de las muestras donde estas se encuentran en rango de lectura son 30 min a temperatura de laboratorio y 30 min a 4 °C, esto se explica porque al disminuir la temperatura disminuye la movilidad de las moléculas, los choques entre estas y por lo tanto la probabilidad de unión entre antígeno y Ac; hecho que se acentúa al disminuir el tiempo de contacto entre estas moléculas.

Para este método se decidió emplear la temperatura de laboratorio que mostró una K de 7,5; pues como se ve en la tabla, al ir disminuyendo la temperatura y el tiempo de incubación disminuye también la absorbancia de las muestras y no se quería correr el riesgo de que muestras con bajo título de Ac, al ser ensayadas a 4 °C, mostraran una DO por debajo del valor de corte y fueran informadas como negativas y constituir así un falso negativo; además, ahorra el empleo de equipos de refrigeración para esta temperatura. En cuanto al tiempo, se vio que 30 min era suficiente para que se llegara al equilibrio de la reacción antígeno-Ac por lo que para economizar y aumentar la factibilidad de este inmunoensayo se decidió fijar 30 min como tiempo de incubación de las muestras. En este aspecto, se conocía de un inmunoensayo de tipo indirecto para detectar Ac anti-SK del isotipo IgG,7 donde el tiempo de incubación de las muestras era 2 h y dado el alto título de Ac de los individuos, el tiempo de incubación del sustrato se redujo a 5 min para poder realizar la lectura de la DO de las muestras.

Uno de los problemas que se tenía con este inmunoensayo era escoger el control negativo, pues como ya se mencionó, siempre se ha encontrado este tipo de Ac en todas las muestras de suero humano que se han procesado. En el ELISA, para detectar Ac anti-SK, que se realizaba en el Departamento con fines investigativos se utilizaba suero fetal de ternera, pero por las limitaciones que hay actualmente con este reactivo biológico, los autores de este trabajo se vieron en la necesidad de sustituir el control negativo. Según lo reportado por este grupo en investigaciones anteriores,4 en el suero de carnero no se encontró Ac anti-SK, por lo que se decidió emplear como control negativo este tipo de suero del cual se tenía amplia disponibilidad, previa detección de este tipo de Ac.

Como no se observaron diferencias entre las distintas diluciones del control negativo ensayadas y el puro, se escogió como dilución de trabajo la de 1:100 porque permite el ahorro de suero.

En este estudio se observó, en la mayor parte de las muestras ensayadas, la presencia de Ac anti-SK, lo que coincide con otros autores, como ya se mencionó. El valor de DO observado muestra la gran variación en el nivel de estos Ac entre los diferentes individuos, dado por el grado de exposición a los estreptococos. Por este elevado valor de DE se decidió escoger como valores normales los que estaban entre la +DE y no +2DE como se recomienda,10 pues el límite inferior quedaría por debajo del nivel de corte del ensayo.

El valor límite tanto inferior como superior es de gran importancia a la hora de emitir un criterio clínico, como consecuencia de infecciones por estreptococos.3,7 Los pacientes que se encuentren por debajo del límite inferior pueden padecer de algún tipo de inmunodeficiencia y los que estén por encima del límite superior pueden estar infectados en ese momento con estreptococos b-hemolíticos o tener algún fenómeno autoinmune como secuela de la infección por estos.3

Al realizar las pruebas de interferencia se pudo observar la elevada especificidad que tiene el ensayo, a pesar de los altos niveles de Ac que se observan en muchas muestras.

Se puede concluir a partir de estos resultados que se logró rediseñar y establecer nuevos parámetros para este ELISA. La concentración de recubrimiento ideal fue de 0,1 mg/mL y dilución del conjugado 1:100 000, incubación de las muestras puras durante 30 min a temperatura de laboratorio.

El ensayo inmunoenzimático reportado aquí, es muy simple y rápido de realizar en cualquier laboratorio equipado con las técnicas estándar de ELISA. Todos los reactivos se encuentran disponibles y las condiciones del ensayo no son muy críticas. Con el empleo de este método se cuenta en los laboratorios con una prueba complementaria más para el diagnóstico de infecciones por estreptococos.

Summary

A sandwich, heterogenous, qualitative, doble antigen immunoenzimatic method was standardized to detect anti-streptokinase antibodies in pure samples of human serum. Different concentrations of the recovering antigen and conjugate dilutions, as well as various times and temperatures of incubation of the samples were assayed. The cut-off value of the assay and its detection limit were established and it was proved if there were some unspecificities. 0.1 mg/mL was determined as an optimal recovering concentration for a conjugate dilution of 1:100 000. The optimum conditions of incubation of the samples were 30 min at lab temperature and there were no interferences of other analytes with the technique.The optical densities between 0.282 and 0.654 were established as normal values of the technique.

Subject headings: STREPTOKINASE/analysis; ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY; STREPTOCOCCUS; STREPTOCOCCAL INFECTIONS/diagnosis; SEROLOGIC TESTS.

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Recibido: 5 de diciembre de 2001. Aprobado: 18 de enero de 2002.
Lic. Lien López Matilla. Departamento de Inmunología. Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”. Avenida 146 No. 3102 esquina a 31, reparto Cubanacán, municipio Playa, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 11600. Correo electrónico: [e-mail]