Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”

Desarrollo de un modelo de aterosclerosis inducida por inmunocomplejos de forma activa en ratones BALB/CBJ

Lic. Liudmila López Matilla, Lic. Lien López Matilla, Dr. Antonio González Griego, Dr. Víctor Manuel Rodríguez Sosa,* Dr. Leonel Falcón Vilaú, Dr. José A. Castillo Herrera, Dr. Adonis Montenegro Perdomo y Dra. Leysis McCoock Noa

Resumen

Se emplearon ratones isogénicos de la línea BALB/CBJ, de 6 semanas de edad y un régimen de agua y comida ad libitum. Estos se dividieron en 2 grupos, a uno de ellos se les realizó el esquema de inmunización de 0-1-4 semanas por vía intraperitoneal con la vacuna cubana anti hepatitis. El otro grupo fue el control y se inmunizó de la misma forma empleando el excipiente de la vacuna, sin el antígeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB). El grupo tratado inhaló diariamente durante 1 mes humo de cigarillo. Después de cuantificar los Ac anti-HBs y la ausencia de estos en los controles, se llevaron a cabo 7 inmunizaciones con un intervalo de 5 d entre ellas por la vena caudal, se utilizó como inmunógeno en el grupo tratado AgsHB recombinante con una dosis que duplicó la concentración de anti-HBs de cada animal. Al grupo control se le suministró solución salina con la misma metodología que en el grupo tratado. Se determinó la presencia de inmunocomplejos circulantes en plasma. Se practicó eutanasia y se comprobó la presencia de lesiones ateroscleróticas de forma macroscópica y microscópica. Con los resultados obtenidos se concluyó que se logró obtener un modelo de aterosclerosis en ratones isogénicos BALB/CBJ por formación de inmunocomplejos de manera activa.

Decs: ATEROSCLEROSIS/inmunología; RATONES CONSANGUINEOS BALBC; MODELOS ANIMALES DE ENFERMEDAD; ANTIGENOS DE SUPERFICIE DE LA HEPATIS b; COMPLEJO ANTIGENO-ANTICUERPO.

La aterosclerosis es el proceso más común subordinado a la morbilidad y mortalidad cardiovascular.1 La cardiopatía isquémica como consecuencia del proceso aterosclerótico, ocupa en Cuba un lugar importante, con tasas que la hacen alcanzar el primer lugar entre las causas de defunciones no violentas. Los grupos más afectados en orden decreciente son los de 65 años y más, de 64 a 45 y de 44 a 15 años. Su presentación en menores de 15 años es excepcional.2,3

La aterosclerosis es una enfermedad multifactorial que comienza en la infancia aunque no suele ser clínicamente evidente hasta que se alcanza una edad mediana. Afecta principalmente las arterias elásticas y musculares de tamaño grande y medio, y son la aorta y los sistemas coronario y cerebral los principales objetivos. Las anomalías morfológicas claves en la aterosclerosis consisten en engrosamientos focales de la íntima y acumulaciones lipídicas; que producen las características placas ateromatosas.4

La relación de las reacciones inmune celular y humoral con los estados del desarrollo aterosclerótico, fue olvidada por muchos años en la investigación de la aterosclerosis. Verdaderamente, el fenómeno inmunológico ha sido considerado de naturaleza secundaria en esta enfermedad.5

La tendencia actual es considerar que la aterosclerosis es una respuesta inflamatoria crónica de la pared vascular a diversos acontecimientos iniciadores, que pueden presentarse en etapas tempranas de la vida. Múltiples mecanismos patogénicos contribuyen a la formación y progresión de la placa incluidos la disfunción endotelial, la adhesión e infiltración de los monocitos, la proliferación de células musculares lisas, el depósito de matriz extracelular, la acumulación de lípidos y la trombosis.4

El compromiso del sistema inmune en la aterosclerosis ha sido muy estudiado en los últimos años.5,6 La posible relación de los inmunocomplejos (ICs) con la patogénesis de la aterosclerosis fue sugerida por primera vez hace 20 años atrás, basada en la detección de ICs solubles por técnicas de pesquisaje en pacientes con aterosclerosis.7 En humanos se ha comprobado que las lipoproteínas de baja densidad circulantes que contienen ICs, están presentes en la circulación de pacientes con enfermedades vasculares y en algunos sujetos saludables, teniendo un papel patogénico en el desarrollo de la aterosclerosis.8,9

Sobre la base de lo planteado anteriormente y a solicitud del Centro de Investigaciones y Referencia de Aterosclerosis de la Habana este colectivo de trabajo se enfrascó en el estudio de la aterosclerosis desde el punto de vista inmunológico. Para lograr esto, es de gran importancia contar con modelos animales que faciliten la comprensión de algunos de estos fenómenos que ocurren en el proceso aterogénico. En la bibliografía consultada, no se encuentran reportes de modelos experimentales de aterosclerosis obtenidos induciendo un fenómeno inflamatorio a través de ICs; por lo que fue propósito de los autores en este trabajo obtener un modelo experimental activo de aterosclerosis inducido por IC en ratones BALB/CBJ.

Métodos

Procedencia y cuidado de los animales

Todos los animales que se emplearon en esta investigación procedían del bioterio del Departamento de Inmunología del Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas "Victoria de Girón". Todo el tiempo se mantuvieron atendidos por personal especializado y según las normas establecidas para este tipo de animales convencionales. El suministro de agua y comida fue ad libitum y se distribuyeron para los distintos tratamientos de forma aleatoria según el grupo de estudio. Se marcaron con ácido pícrico en diferentes sitios anatómicos para su identificación.

Modelo activo

Se emplearon 30 ratones isogénicos de la línea BALB/CBJ, machos de 6 semanas de edad y un peso entre 18 y 20 g. Estos se dividieron en 2 grupos de 15 animales cada uno. A uno de ellos, se les realizó el esquema de inmunización propuesto por González en 199510 de 0-1-4 semanas por vía intraperitoneal, que emplea una dosis de 2 mg de la vacuna cubana antihepatitis B Heberbiovac HB que contiene 20 mg de AgsHB; 0,5 mg de hidróxido de aluminio; 0,05 mg de tiomersal; 8 mg de cloruro de sodio; 1,12 mg de fosfato de sodio dibásico anhidro; 1,1 mg de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 1 mL de agua para inyección (Certificado de análisis para el producto final. Vacuna antihepatitis B recombinante Heberbiovac HB. Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología de la Habana 2000, Lote No. 805610. Ciudad de La Habana. Fecha de vencimiento: agosto de 2001). El otro grupo fue el control y se inmunizó de la misma forma empleando el excipiente de la vacuna, sin el AgsHB.

A los 20 d después de comenzar las inmunizaciones, el grupo tratado inhaló diariamente el humo de un cigarro Popular durante 15 min por espacio de un mes, para esto los animales eran colocados en cámaras especiales con un orificio de entrada y otro de salida de aire; el humo penetraba a través de una manguera conectada al orificio de entrada impulsado por una bomba peristáltica.

A la semana de concluido el esquema de inmunización, se realizó extracción de sangre por el plexo retrorbitario, esta se centrifugó durante 2 min a 1 750 g en centrífuga de capilares marca Teknika y con el plasma se realizó un ensayo inmunoenzimático ligado a enzima (ELISA), heterogéneo, tipo sandwich de doble Ag para la detección y cuantificación de Ac contra el AgsHB (anti-HBs), desarrollado y validado en el Laboratorio de Inmunología del Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”.11

Se llevaron a cabo 7 inmunizaciones con un intervalo de 5 d entre ellas por la vena caudal, se utilizó como inmunógeno en el grupo tratado AgsHB recombinante con una dosis que duplicó la concentración de anti-HBs de cada animal, diluido en solución salina para un volumen de inóculo de 0,05 mL. Al grupo control se le suministró solución salina usando la misma metodología que en el grupo tratado. Semanalmente se le realizaron extracciones de sangre por el seno orbicular, y al plasma obtenido se le determinó la concentración de anti-HBs mediante el ELISA para detectar y cuantificar estos.

Detección de inmunocomplejos circulantes

Una semana después de concluidas las inmunizaciones se realizó extracción de sangre de la forma descrita con anterioridad. Se utilizó la técnica para detectar IC circulantes inespecíficos por el micrométodo de precipitación con polietilenglicol (PEG) 6000. Para ello se diluyeron 3 veces las muestras en tampón borato 0,1 M pH = 8,4. En una placa de 96 pocillos de cloruro de polivinilo (Titertek Flow Laboratories) se añadieron 200 mL de tampón borato en un pocillo y 200 mL de tampón PEG (10 g de PEG en 240 mL de tampón borato 0,1 M), se añadieron las muestras en los pocillos de forma que la dilución final fuera 1/180. Se incubó 1 h a temperatura de laboratorio y se realizó la lectura a 492 nm en lector Organon Teknika.

Como control positivo se utilizó suero de un paciente con artritis reumatoidea y como control negativo suero humano normal. A la DO del pocillo con PEG se le restó la DO del que contenía tampón borato y si el resultado excedió el valor de 0,05 (valor límite de la técnica) la muestra se consideró positiva.

Procesamiento de la muestra

Se practicó eutanasia por inhalación de éter etílico y se les extrajo la aorta desde el cayado aórtico hasta la ilíaca común, con ayuda de un estereoscopio marca XTD-01 con un aumento de 10X. Las aortas fueron abiertas en sentido longitudinal, fijadas en cartulina y se conservaron en formol 10 %, hasta el momento en que se pasó a determinar la presencia o ausencia de lesiones macroscópicas con la ayuda del estereoscopio.

Posteriormente, las aortas se incluyeron en parafina y se colorearon por la técnica de hematosilina-eosina. Para la observación de los cortes se utilizó un microscopio óptico Carl Zeisss con un aumento de 40X.

Resultados

Modelo activo

En el grupo tratado se observó en todos sus integrantes lesiones macroscópicas del tipo placa fibrosa. En el caso de los controles estas lesiones no fueron encontradas.

En el análisis microscópico se observó en el grupo tratado presencia de células espumosas y un escaso infiltrado de linfocitos.

En el grupo control se vio presencia de algunas células espumosas focales (fig. A y B).

Fig. Tinción con hematosilina-eosina. A. Grupo tratado. B. Grupo control. La flecha indica las células espumosas.

Detección de inmunocomplejos circulantes

No se observó en ningún animal de los 2 grupos la presencia de ICs circulantes.

Discusión

En cuanto a la vía de inmunización de los animales para la formación de ICs, se escogió la endovenosa, para crear la mayor cantidad posible de estos en los vasos sanguíneos. La dosis de inoculación empleada fue el doble de la concentración de Acs en el suero del animal, con el objetivo de lograr la zona de exceso de Ag en el momento de la inoculación, donde todo el Ac existente precipita en forma de ICs y queda Ag en el suero.

El caudal de conocimientos que se tiene hasta el momento sobre la aterosclerosis, habla de un fenómeno que está influenciado por diversos factores más que por uno solo. Es por ello que se trabajó con más de un factor de riesgo, por lo que además de la reacción de hipersensibilidad tipo III, se estresó a los animales del grupo experimental por inhalación de humo de cigarro y está demostrado que el uso de cigarrillos se asocia con enfermedades causadas por la aterosclerosis.12

En los grupos de animales tratados se observaron en las aortas placas fibrosas, no así en los grupos controles. El hecho de que no se observen lesiones macroscópicas ocasionadas por la acción de los ICs en los grupos controles, no hace afirmar que no existan eventos ateroscleróticos en esta arteria; por ello fue que se realizaron cortes microscópicos del tejido porque la estría grasa no se observa si no es a través de estas técnicas.

En los animales tratados, los ICs formados cuando se depositan en la lámina elástica interna de los vasos sanguíneos fijan complemento. El principal factor inflamatorio derivado de la cascada del complemento es C5a que es quimiotáctico para neutrófilos de la circulación y tejidos circundantes. Los neutrófilos liberan enzimas lisosómicas y generan oxidantes tóxicos en el proceso de fagocitosis del IC, lo que causa la lesión del endotelio arterial. Como respuesta a este daño tisular las células endoteliales aumentan su volumen y proliferan, se incrementa la permeabilidad para los constituyentes plasmáticos, tiene lugar la adhesión de monocitos y plaquetas, así como la liberación de factores de crecimiento incluido el factor de crecimiento derivado de plaquetas, los cuales conducen a la migración y proliferación de las CML.13 Estas células producen grandes cantidades de colágeno y proteoglucanos, que contribuyen a la evolución de la placa ateromatosa.4

En el caso del modelo activo además de todos estos eventos se le suma el estrés oxidativo que produce el cigarro al dañar los mecanismos del NO, el cual actúa reduciendo la expresión endotelial del VCAM-1 e inhibiendo la actividad del NFkB.14

Según el tipo de lesión que se observó macroscópicamente, se vio que se pueden disminuir la cantidad de inmunizaciones en los animales, por lo que es importante realizar este tipo de cinética con varios grupos de animales que se sometan a distintos números de inmunizaciones y comprobar cuándo se forma el primer tipo de lesión o estría grasa y cuándo se empieza a observar la placa ateromatosa.

Los resultados obtenidos a partir de los cortes histológicos muestran el desarrollo de estrías grasas en todos los grupos de animales, tanto en los tratados como en los controles. Esto se corresponde a lo planteado por otros autores, al afirmar que el proceso aterosclerótico está presente desde edades tempranas en todos los individuos, pero se hace clínicamente evidente en aquellos que entran en los grupos de riesgo.4 A pesar de observar las células espumosas, en los grupos controles no se observaron infiltrados linfocitarios que sí se vieron en los tratados.

Sería interesante además realizar este modelo pero con la utilización de varios inmunógenos públicos, porque en este caso se utilizó un Ag más selectivo. De esta forma se simularía lo que sucede de forma natural en la especie humana, la cual está expuesta en mayor o en menor grado a retos antigénicos y que según este estudio tienen una contribución bien importante en el desarrollo de la aterosclerosis.

No se encontró ningún animal positivo en la técnica de ICs circulantes y esto podría estar dado por el efecto de refuerzo que tuvo el AgsHB, al ocurrir la formación de ICs que fueron aclarados rápidamente de la circulación o se depositaron en los tejidos, y que se incrementaran los niveles de anti-HBs.

A partir de estos resultados se puede concluir que se logró un modelo de aterosclerosis en ratones BALB/CBJ por formación de ICs de manera activa. Se recomienda continuar realizando estudios en cuanto a la cinética de aparición de las lesiones macroscópicas, para su exitoso uso por el personal que investiga esta patología, además de utilizar más de un inmunógeno al mismo tiempo.

Summary

6-week-old BALB/CBJ isogenic mice were used in this study and an ad libitum regime of water and food was established. These mice were divided into 2 groups.One of them was applied the immunization scheme of 0-1-4 weeks with the Cuban anti-hepatitis vaccine by intraperitoneal route. The control group was immunized by the same way, using the excipient of the vaccine without the hepatitis B surface antigen (AgsHB). The treated group inhaled cigarrete smoke daily during a month. After quantifying the anti-hepatitis B antibodies and proving their absence in the controls, 7 immunizations were performed with an interval of 5 days between them by the caudal vein. Recombinant AgsHB was used as an immunogen in the treated group at a dose that dobled the concentration of anti-hepatitis-B antibodies of every animal. The control group was adminstered a saline solution with the same methodology than the treated group. It was determined the presence of circulating immunocomplexes in plasma. Euthanasia was practiced and the presence of atherosclerotic injuries was proved in a macroscopic and microscopic way. According to the results obtained, it was concluded that it was possible to obtain a model of atherosclerosis in BALB/CBJ isogenic mice by the formation of immunocomplexes in an active way.

Subject headings: ATHEROSCLEROSIS/immunology; MICE, INBRED BALBC; DISEASE MODELS, ANIMAL; HEPATITIS B SURFACE ANTIGENS; ANTIGEN-ANTIBODY COMPLEX.

Referencias bibliográficas

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Recibido: 20 de julio de 2001. Aprobado: 25 de enero de 2002.
Lic. Liudmila López Matilla. Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón”. Avenida 146 No. 3102 esquina a 31, reparto Cubanacán, municipio Playa, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 11600.

* En el artículo Desarrollo de un modelo de aterosclerosis inducida por inmunocomplejos de forma pasiva en ratones BALB/CBJ transgénicos al antígeno de superficie de la hepatitis B en Rev Cubana Invest Biomed 2002:21(1):46-53, por error este autor aparece como Víctor Manuel Sosa.