Instituto Superior de Ciencias Médicas “Carlos J. Finlay”. Camagüey

Consecuencias funcionales en riñones de ratas sometidos a isquemia

Dra. Elizabeth Vidor Guerra, Dra. Vivian García López, Dra. Miriela Betancourt Valladares, Lic. Olga Lidia Barrera López y Dr. Carlos del Risco Turiño

Resumen

Se realizó un estudio experimental en 35 ratas Wistar, desde diciembre de 2004 hasta julio de 2005, provocando isquemia temporal en el riñón por medio del pinzado atraumático de la arteria renal en 28 animales, los que fueron divididos en 4 subgrupos, comparados con un subgrupo de animales utilizados como control, a los que no se les provocó isquemia. Cada subgrupo estuvo constituido por 7 animales. Para la evaluación del estado funcional después de la isquemia, se midió la intensidad de filtrado glomerular, el flujo plasmático renal efectivo, y se calculó la fracción de filtración. Se corroboró la disminución progresiva de estas 3 variables en función del tiempo. En los subgrupos expuestos a 30 min, 45 min y 1 h mostraron disminución de manera significativa (p< 0,05) con respecto al primer subgrupo y al subgrupo control. La intensidad de filtración glomerular disminuyó aproximadamente 30 % después de los 30 min de isquemia. El flujo plasmático renal en este mismo tiempo disminuyó 17,6 %, caída que fue aumentando al transcurrir el tiempo. Se concluyó que la isquemia es un proceso clínicamente importante el cual produce una disminución de la función renal a medida que transcurren los períodos variables isquémicos.

Palabras clave: Filtrado glomerular, flujo plasmático renal efectivo, fracción de filtración.

 

En algunas cirugías como las neurotomías en riñón para el tratamiento de la litiasis renal, en las cirugías conservadoras de los tumores renales, o en transplantes, es necesaria la realización de isquemia renal temporal; se produce una lesión morfológica y funcional que depende del tiempo de isquemia, la cual se define como el cese del flujo sanguíneo al órgano.¹

Las causas de isquemia son muchas, y se pueden clasificar de una manera generalizada en: hipovolémicas (hemorragia, tercer espacio), trastornos cardíacos (infarto agudo de miocardio, taponamiento cardíaco, cardiopatías congestivas), vasodilatación periférica (bacteriemia), incremento de las resistencias vasculares (síndrome hepatorrenal), obstrucción vascular renal (embolismo, traumatismos, anemia falciforme), lesiones vasculares (aterosclerosis, hiperplasia, fibromuscular, nefroesclerosis).¹

Para comprender las lesiones que se producen como consecuencia de la isquemia renal es fundamental conocer su fisiopatología. La lesión hipóxica celular puede ser causada por pérdida del riego sanguíneo, agotamiento de la capacidad de la sangre de transportar oxígeno, o envenenamiento de las enzimas oxidativas intracelulares. De estos factores el más frecuente observado es la pérdida de la irrigación sanguínea al riñón por bloqueo arterial.²

 El sitio primario de ataque de la hipoxia es sobre la respiración aerobia y la fosforilación oxidativa de las células. Gallagher y otros (1956) propusieron la hipótesis de que la pérdida de cofactores de la respiración que participan en el ciclo de Krebs, desencadenan la lesión hipóxica. Aunque este problema no se ha dilucidado, es patente que bastan incluso 2 min de hipoxia para causar 70 % de pérdida de la respiración en mitocondrias obtenidas del cerebro; en cambio las mitocondrias del hígado, riñón y corazón sufrieron mínimas modificaciones en este tiempo. La pérdida de la fosforilación oxidativa se torna inmediatamente más lenta o detiene la generación de ATP; en estas circunstancias algunas células pueden volver a la glucólisis anaerobia, lo que en parte sostiene la concentración de ATP aunque no durante mucho tiempo. La falta de fuentes de energía altera muchos sistemas intracelulares, provoca trastornos de la conservación de las membranas celulares y se dificulta la actividad de las enzimas relacionadas, lo cual origina aumento de la permeabilidad de la membrana. Los balances intracelulares de iones y líquidos se alteran porque dependen de manera exquisita de un suministro ininterrumpido de energía, cuando esta experimenta agotamiento, la bomba de sodio se enlentece o deja de actuar, ingresando el sodio continuamente a la célula, no pudiendo ser bombeado al exterior de forma adecuada; de esta manera la célula sufre tumefacción. Hay agotamiento ulterior de las reservas de ATP por la mayor demanda para la expulsión de sodio, al propio tiempo escapa potasio de las células; el calcio ligado a la membrana también entra a las células dañadas, este difunde hacia las mitocondrias en forma ionizada, estado en el cual es un inhibidor de la fosforilación oxidativa. Estos movimientos de iones y líquidos causan edema no solo de las células sino de sus organitos; al mismo tiempo el aumento del índice de glucólisis anaerobia agota la reserva de glucógeno y motiva acidosis láctica intracelular, alterando adicionalmente la función de la célula y la integridad de su membrana, que al lesionarse causa la separación de los ribosomas del retículo endoplásmico y disociación de los polisomas, trastornándose la síntesis de proteínas. La disminución del pH o la modificación de la composición iónica del medio intracelular origina daño en los lisosomas, seguido de escape y activación de las hidrolasas ácidas. En células que poseen membranas lisosómicas intactas, pero que ya presentan lesión celular, se ha advertido aumento neto de la concentración extralisosómica de ribonucleasas ácidas, fosfatasas y betaglucuronidasas; estas enzimas participan en la digestión y eliminación de las células muertas (autólisis). El impacto de la lesión hipóxica se ha descrito desde su comienzo hasta la digestión celular, sin embargo, cabe preguntarse en qué momento de la isquemia las estructuras celulares llegaron al punto crítico de lesión. Se han realizado muchos empeños para valorar la duración precisa de la hipoxia necesaria para producir lesión celular irreversible. Como es lógico, varía según el animal de laboratorio utilizado, las células o tejidos particulares que se investigan y los parámetros utilizados para identificar la muerte celular.²

Las lesiones vasculares que con más frecuencia producen isquemia son:

·          Aterosclerosis de las grandes arterias renales con constricción progresiva de los vasos.
·          Hiperplasia fibromuscular de una de las grandes arterias o más.
·          Nefroesclerosis.

 

A menudo las lesiones ateroscleróticas e hiperplásicas de grandes arterias afectan más a un riñón que a otro, por lo que causa una reducción unilateral de la función renal, a lo que se denomina hipertensión de Goldblatt.³

La nefroesclerosis benigna, forma más frecuente de enfermedad renal, afecta al menos en alguna medida, aproximadamente a 70 % de las personas que mueren después de los 60 años,³ produciendo cierta insuficiencia renal aguda (IRA). Se encuentra cierto grado de IRA en pacientes hospitalizados, por lo general como una complicación de otras enfermedades o de la intervención quirúrgica que conlleva a una mortalidad de 50 a 60 %. Se desconoce la razón de esta alta mortalidad persistente, pero no hay duda de que las enfermedades relacionadas con IRA (ej. sepsis) y, ante todo el grado de hipercatabolismo, son factores importantes; la mortalidad es más alta en pacientes de edad avanzada y en aquellos con daño renal más grave o en quienes presentan trastornos subyacentes graves (ej. infección crónica). La IRA por isquemia es una enfermedad común con alto porcentaje de mortalidad de 50 %.^4-6

Con el objetivo de evaluar algunas modificaciones de la función renal en relación con la isquemia, que permita mostrar minuciosamente la caída paulatina de la intensidad de filtración glomerular, el flujo plasmático renal y la fracción de filtración en la medida que transcurren períodos variables de isquemia, se hizo esta investigación.

Métodos

Se realizó un estudio experimental donde se utilizó como muestra un grupo de 35 ratas Wistar, machos, supuestamente sanas, provenientes del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), con un peso de 180 (± 5) g. Este grupo de animales fue dividido en 4 subgrupos de 7 ratas cada uno. Al subgrupo que no fue sometido a isquemia se le denominó control (C), y al resto de los subgrupos se les nombró experimentales (E), los cuales fueron sometidos al mismo grado de isquemia, interrumpiendo el flujo sanguíneo que llega a ambos riñones a través de la arteria renal utilizando un dispositivo de cierre. La diferencia entre los 3 subgrupos consistió en el tiempo de duración de la isquemia. El subgrupo experimental E-I fue sometido a 30 min de isquemia, el subgrupo E-II a 45 min, el E-III a 1 h. Inmediatamente después de transcurrido el tiempo de isquemia, a cada animal se le realizó el aclaramiento plasmático de ácido paramino-hipúrico (PAH) e inulina (I) para medir flujo plasmático renal (FPR) efectivo y la intensidad de filtración glomerular (IFG) respectivamente, por el método multicompartimental, considerando normales los valores del FPR efectivo entre 1,50 y 1,70 mL/min/100 g de peso, y de la IFG entre 0,40 y 0,50 mL/min/100g  de peso, cifras establecidas en estudios precedentes.¹⁵ La inulina se utiliza para medir IFG porque es una sustancia que no se filtra, no se secreta ni se reabsorbe, por lo que su aclaramiento será igual al IFG (Ai = Ui x V / Pi); el PAH es una sustancia que se filtra y se secreta pero no se reabsorbe, por lo que su tasa de aclaramiento será igual al FPR (A PAH = U PAH x V / P PAH). Con los resultados de IFG y FPR se calculó la fracción de filtración (FF). El comportamiento de la IFG, el FPR y la FF permitieron evaluar las variaciones funcionales en la medida que transcurrió el tiempo de isquemia. Los resultados obtenidos en cada subgrupo experimental fueron comparados con el control.

Proceder quirúrgico para provocar la isquemia renal

El modelo de isquemia utilizado fue la interrupción del flujo sanguíneo que llega al riñón a través de la arteria renal con un dispositivo de cierre (Clamp) teniendo en cuenta el tiempo previsto para cada grupo experimental; pasado este tiempo y retirados los dispositivos, se inició de inmediato el aclaramiento.

Proceder para la medición de aclaramientos plasmáticos

Se obtuvieron 10 muestras de sangre donde el PAH y la I fueron determinados en filtrados liberados de proteína por sulfato de cadmio, utilizando para el PAH la técnica fotocolorimétrica de Bratton y Marshall, modificada por Homer W. Smith y para la inulina el método directo de resorcinol sin tratamiento alcalino.^7,8 Con las

concentraciones plasmáticas de PAH e inulina se calcularon los aclaramientos, mediante el análisis de descomposición multicompartimental de las curvas de desaparición respectivas de dichas sustancias en el plasma.⁹ Los resultados fueron expresados en mililitros por minuto por 100 g de peso corporal de la rata (mL/min/100 g).

Análisis estadístico

Para resumir la información de las variables se utilizaron medidas de resumen y dispersión como la media y la desviación estándar. Se realizó ANOVA de una vía de efecto fijo para estudiar el cambio de las variables en el tiempo y la trayectoria entre los grupos. Se utilizó para el análisis el paquete estadístico SPSS para Windows. La significación estadística resultó p< 0,05.

Resultados

Los resultados obtenidos en los animales del subgrupo control (C), correspondientes a las ratas que no se les provocó isquemia, manifestaron en las variables flujo plasmático renal efectivo (FPR), intensidad de filtración glomerular (IFG) y fracción de filtración (FF), valores que corresponden a cifras normales establecidas en estudios experimentales anteriores (tabla 1), de manera que pueden ser comparados los resultados de los animales de los subgrupos experimentales con los del subgrupo control.

Tabla 1. Comportamiento de las variables relacionadas con la función renal en el grupo control

Grupo C	IFG	FPR	FF
R1	0,43	1,63	0,26
R2	0,44	1,64	0,27
R3	0,45	1,72	0,26
R4	0,46	1,68	0,27
R5	0,45	1,64	0,27
R6	0,43	1,61	0,27
R7	0,42	1,67	0,25

FPR (mL/min/100 g): Media= 1,65,  DE= 0,0369; IFG (mL/min/100 g): Media= 0,44,  DE= 0,0141; FF: Media= 0,26, DE= 0,0079.
Fuente: Datos experimentales

En el subgrupo E I se produce una disminución significativa (p< 0,05) de todas las variables en comparación con el subgrupo C (tabla 2), siendo más notable la diferencia para las funciones FPR efectivo e IFG. En la tabla 3 se presenta el comportamiento de las variables relacionadas con la función renal del subgrupo E II, se evidencia una caída significativa (p< 0,05) del IFG y FPR, en comparación con el subgrupo C, además la FF también disminuyó aunque no significativamente.

Tabla 2. Comportamiento de las variables relacionadas con la función renal en el grupo E-1I

Grupo EII	IFG	FPR	FF
R1	0,31	1,37	0,23
R2	0,30	1,36	0,22
R3	0,30	1,36	0,22
R4	0,31	1,35	0,23
R5	0,30	1,37	0,22
R6	0,31	1,37	0,23
R7	0,30	1,37	0,22

FPR (mL/min/100 g): Media 1,36, DE= 0,0079; IFG(mL/min/100 g): Media 0,30, DE= 0,053; FF: Media 0,22; DE= 0,0053.
Fuente: Datos experimentales

Tabla 3. Comportamiento de las variables relacionadas con la función renal en el grupo E-III

Grupo E III	IFG	FPR	FF
R1	0,25	1,22	0,20
R2	0,25	1,20	0,21
R3	0,28	1,17	0,24
R4	0,24	1,18	0,20
R5	0,26	1,19	0,22
R6	0,27	1,20	0,23
R7	0,26	1,20	0,22

FPR (mL/min/100 g): Media 1,19, DE= 0,0162; IFG (mL/min/100 g): Media 0,25, DE= 0,0135; FF: Media 0,21, DE= 0,0150.
Fuente: Datos experimentales.

Para 60 min de isquemia en el subgrupo EIII, el comportamiento de las variables de función es muy decreciente, existiendo diferencia significativa (p< 0,05) en comparación con el grupo C e incluso al resto de los grupos E, siendo el FPR la que más cayó como se indica en la tabla 4.

Tabla 4. Comportamiento de las variables relacionadas con la función renal en el grupo E-IV

Grupos E IV	IFG	FPR	FF
R1	0,23	1,08	0,21
R2	0,23	1,08	0,21
R3	0,22	1,10	0,20
R4	0,22	1,11	0,20
R5	0,22	1,09	0,20
R6	0,22	1,08	0,21
R7	0,22	1,09	0,20

FPR (mL/min/100 g): Media 1,09, DE= 0,0115; IFG (mL/min/100 g): Media 0,22, DE= 0,0049; FF : Media 0,20, DE= 0,0053.
Fuente: Datos experimentales

Las medias obtenidas para las variables FPR, IFG y FF que permitieron evaluar el estado funcional del riñón se representan en la tabla 5, evidenciándose la disminución progresiva de cada una de las variables estudiadas en la medida que se incrementó el tiempo de isquemia, aunque se debe destacar que la variable de mayor reducción porcentual fue el IFG, comenzando a decrecer desde el grupo E I.

Tabla 5. Comportamiento de las variables relacionadas con la función renal en los grupos estudiados

Grupos	IFG	%	FPR	%	FF	%
C	0,44	0	1,65	0	0,26	0
E I	0,30	32	1,36	17,6	0,22	13,9
E II	0,25	43	1,19	27,9	0,21	19,3
E III	0,22	50	1,09	34	0,20	23,1

FPR (mL/min/100 g); IFG(mL/min/100 g); p= 0,05.
Fuente: Datos experimentales.

Discusión

El riñón es un órgano dependiente del metabolismo aerobio, y la falta de oxígeno produce un descenso de ATP celular el cual desencadena una cascada de eventos que lleva a disfunción y muerte.¹

Cuando se produce un daño isquémico, la célula aumenta su concentración de calcio citosólico por la liberación desde el retículo endoplásmico y al paso a través de la membrana celular, lo que supone un marcador de daño tisular irreversible. Además en las situaciones de isquemia, la activación de las fosfolipasas y proteasas altera la composición de las membranas y da lugar a la liberación de las enzimas lisosomales.¹ También se produce una redistribución de las bombas transportadoras que migran desde los dominios basales a los apicales, perdiéndose la polaridad celular y alterándose las proteínas transmembranas, esto se traduce en la pérdida de adhesión de las células a la membrana basal, que al liberarse obstruyen la luz de los túbulos y disminuyen el filtrado glomerular. Esta secuencia de eventos explican los resultados obtenidos en este estudio en los cuales se constata disminución del IFG, FPR y FF, en correspondencia con el tiempo de isquemia al que fueron sometidos los diferentes grupos de animales. Los cambios moleculares y bioquímicos antes señalados, son los responsables de las alteraciones renales descritas por otros investigadores en estudios similares.^1,10

Vagt y Farber informaron que 25 min parece ser el tiempo crítico necesario para la lesión hipóxica irreversible de muchas de las células tubulares renales de las ratas al pinzar el pedículo renal. Los cambios mitocondriales y de la membrana plasmática suelen ser los primeros datos manifiestos de daño celular; a los 30 min comienzan cambios más notables en las mitocondrias, retículo sarcoplásmico y ribosomas; después de la primera hora la desorganización intracelular progresa con rapidez siempre creciente. La tumefacción de las mitocondrias y del retículo avanza de manera que pueden observarse soluciones de continuidad e incluso roturas de membranas limitantes. El aparato de síntesis de proteínas en su totalidad se desagrega y los ribosomas que pueden identificarse se advierten esparcidos al azar en el gel citoplasmático.^2,11,12

Estudios morfométricos realizados en el departamento de cirugía experimental de la Universidad de Valladolid plantean que tras 1 h de isquemia los investigadores encontraron tubulorrexis y obstrucción de la luz junto con necrosis tubular. Estos estudios estuvieron dirigidos principalmente a cambios estructurales sin realizar análisis minuciosos de los cambios funcionales. Los resultados del presente trabajo, que sí se dirigieron al estudio de los cambios funcionales, mostraron una caída significativa (p< 0,05) de la IFG de aproximadamente 30 % después de los 30 min de isquemia respecto al grupo control, lo que de ningún modo puede hacernos predecir que el daño estructural subyacente haya llegado al punto crítico necesario para la lesión hipóxica irreversible. Evolucionar estos animales después de la isquemia implica un daño sobreañadido: el ocasionado por la reperfusión; lo que introduce nuevos mecanismos de lesión sobre el fenómeno isquémico (lesión por reperfusión),^12,13 de manera que es difícil inferir, inmediatamente después de la isquemia y aún cuando la investigación abarque estudios moleculares, morfológicos y funcionales; lo que ocurrirá realmente con la función renal después de un tiempo prolongado tras el pinzamiento del pedículo renal.

Los cambios moleculares y morfológicos descritos son imprescindibles para comprender las lesiones que se producen por consecuencia de la isquemia renal, pues permiten entender su fisiopatología, porque provocan alteraciones hemodinámicas que dan lugar a una reducción del flujo sanguíneo renal, el cual se traduce en una disminución de la presión intraglomerular lo que unido a la reducción del coeficiente de filtración glomerular, constituye la causa de la disminución del IFG. Esto se acompaña de una lesión tubular y un flujo retrógrado que en la clínica se comporta como insuficiencia renal aguda por necrosis tubular.¹⁴ La necrosis tubular aguda (NTA) isquémica se caracteriza por una necrosis tubular focal en puntos múltiples de la nefrona con grandes áreas respetadas entre estas y acompañada a menudo por rotura de la membrana basal y oclusión de las luces tubulares por cilindros.^15,16 Transcurridos los períodos isquémicos de 30 min, 45 min y 1 h, superado ya el llamado tiempo crítico para la aparición de lesiones hipóxicas irreversibles al nivel renal; se observó una caída significativa del FPR y del IFG.¹⁶ La FF en los subgrupos sometidos a 30 min, 45 min y 1 h, disminuyó notablemente. El análisis del comportamiento de la FF muestra que el descenso del filtrado en estos últimos fue mucho mayor que el del FPR; esto se explica por el mayor daño al nivel glomerular ocasionado por la isquemia en comparación con el daño tubular, lo cual se corresponde con investigaciones clínicas referidas a enfermedades renales de naturaleza isquémica,¹⁷ como son las ateroscleróticas y la nefrosclerosis que afecta a las arterias interlobulillares más pequeñas y a las arteriolas aferentes del riñón. La lesión parece comenzar con la salida del plasma a través de la íntima de estos vasos para formar depósitos fibrinoides en la capa media, y va seguido de engrosamiento progresivo de la pared vascular que acaba comprimiendo, y en algunos casos, ocluyendo la luz. Como estas arterias de poco calibre no disponen de una circulación colateral apreciable, la oclusión de una o más de estas conduce a la destrucción de un número comparable de nefronas. Por tanto gran parte del tejido renal acaba siendo sustituido por tejido fibroso. Cuando los glomérulos se esclerosan se denomina glomerulosclerosis. Esta pérdida de glomérulos y de función renal global se refleja en una disminución del flujo sanguíneo al riñón, del coeficiente de filtración glomerular y por lo tanto una disminución del aporte de oxígeno.¹⁷

Algunas de las investigaciones antes mencionadas y otras realizadas por otros investigadores han descrito la caída de la función renal en función del tiempo de isquemia, sin embargo se han basado para ello en el estudio de los valores de la creatinina en el plasma o en la medición del aclaramiento de la creatinina endógena, los que si bien desde el punto de vista clínico constituyen armas de gran valor diagnóstico, evolutivo y pronóstico; desde el punto de vista investigativo experimental no son los métodos más indicados para estudiar con exactitud el estado funcional renal.^17,18

Al término del estudio se encontró que el flujo plasmático renal efectivo, la intensidad de filtración glomerular y la fracción de filtración mostraron una caída significativa (p< 0,05), transcurridos 30 min, 45 min y 1 h.

Después del análisis precedente cabría preguntarse, ¿si se realizaran estudios morfométricos de tejido renal extraído de los animales utilizados en este estudio se corresponderían los cambios histológicos con el estado funcional medido? ¿se relacionarán los resultados del estudio histológico con los encontrados por otros investigadores en períodos iguales de isquemia? Corresponde en lo adelante trabajar para dar respuesta a estas interrogantes.

Functional consequences in rat kidneys subjected to ischemia

Summary

An experimental study was conducted in 35 Wistar rats from December 2004 to July 2005  Transient ischemia was provoked  in the kidney by a nontraumatic clamping of the renal artery in 28 animals, which were divided into 4 subgroups compared with a subgroup of animals used as control among which ischemia was not induced. To evaluate the functional state after ischemia, the intensity of the glomerular filtrate and the effective renal plasmatic flow were measured and the filtration fraction was calculated. The progressive reduction of these 3 variables was corroborated according to time. The subgroups exposed to 30 min, 45 min and 1 h showed a significant decrease (p< 0.05) compared with the first subgroup and the control subgroup. The intenstiy of glomerular filtration diminished approximately 30 % after 30 min with ischemia.  The plasmatic renal flow in this same time lowered 17.6 %, a drop that increased in the course of time. It was concluded that ischemia is a clinically important process that produces a reduction of the renal function as the variable ischemic periods go by.

Key words: Glomerular filtration, effective renal plasmatic flow, filtration fraction.

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Recibido: 13 de septiembre de 2006. Aprobado: 11 de octubre de 2006.
Dr. Carlos del Risco Turiño. Avenida de los Mártires No. 211. La Vigía. Camagüey 2. Teléf. 282593. CP 70200. Correo electrónico: [e-mail]