Técnicas

Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón “

Propuesta de metodología analítica para la evaluación de conjugados inmunoenzimáticos

Dra. Tammy Fernández Romero, Dr. Antonio Mario González Griego, Dr. Félix Juan Fernández Acosta y Dra. Victoria Esther González Ramírez

Resumen

Se propuso un algoritmo analítico por etapas para la evaluación de conjugados inmunoenzimáticos. Estos deben ser evaluados en el sistema donde van a ser empleados. Esta forma de proceder tiene la limitación de que si se detectan deficiencias no es posible identificar si son producidas por alteraciones de la enzima o de la molécula conjugada a esta. La conservación de la actividad enzimática e inmunológica son requerimientos claves en la obtención de un buen conjugado. Este algoritmo se inicia con la evaluación enzimática seguida de la evaluación inmunológica y finalmente de la evaluación de la actividad específica del producto como conjugado. Esta metodología pudiera constituir además una forma de ahorro de tiempo y recursos, una vez que se establezcan valores de referencia para el trabajo. Se concluyó que el algoritmo analítico propuesto pudiera ser un procedimiento apropiado para la caracterización adecuada de conjugados inmunoenzimáticos.

Palabras clave: ELISA, evaluación de conjugados, actividad enzimática, actividad inmunológica.

 

El procedimiento ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay¨) es un inmunoensayo enzimático heterogéneo, que ha sido aplicado a la revelación y cuantificación de diversos tipos de sustancias presentes en líquidos orgánicos. En su funcionamiento adecuado, los reactivos biológicos desempeñan un papel importante. Entre estos se encuentra el conjugado, por lo que para su obtención es necesario utilizar el método más apropiado.^1,2

En los requerimientos para evaluar la calidad de un conjugado se encuentran la detectabilidad y la reactividad, que se relacionan con la conservación de la actividad enzimática e inmunológica, respectivamente, así como la estabilidad de la unión generada. La evaluación debe realizarse en el ELISA correspondiente,^3-8 el cual no permite diferenciar alteraciones de las moléculas conjugadas sino solo conocer si el conjugado funciona de manera adecuada o no.

En el mundo hoy día se realiza el ELISA Directo (ELISA d), previo al correspondiente, que ofrece una información rápida del funcionamiento de la parte inmunológica del reactivo.^1,2,6 La actividad de la enzima independiente de la inmunológica pudiera ser detectada también por un método rápido y sencillo.

El objetivo de este trabajo es proponer un algoritmo analítico por etapas para la evaluación de conjugados inmunoenzimáticos.

Métodos

Se proponen los métodos en el orden en que deben aplicarse. Para determinar la actividad enzimática sin interacción Ag-Ac (AE) y la actividad inmunológica (AI) por ELISA d, debe utilizarse el mismo soporte sólido que se emplea para el ELISA correspondiente. El más popular de estos es la placa de plástico de 96 pocillos, por lo que será el empleado en los procedimientos generales que se describen a continuación, para un método cuantitativo espectrofotométrico. Para otros métodos se pueden realizar adaptaciones.^9,10

1. Procedimiento general para la AE: añadir el conjugado de forma directa a la placa, en diluciones dobles seriadas, y un blanco de reactivos. Seguidamente adicionar la solución sustrato de la enzima (la misma empleada en el ELISA correspondiente). Después continuar de igual forma que se procede a partir de este paso en el ELISA correspondiente. Se debe realizar repetibilidad y reproducibilidad para evaluar la precisión.¹¹

2. Procedimiento general para la determinación de la AI por ELISA d:

a) Para un conjugado de Ag: recubrir la placa con un Ac específico e incubar. Seguidamente lavar la placa, añadir el conjugado en diluciones dobles seriadas y un blanco de reactivos e incubar como se procede en el ELISA correspondiente. Lavar la placa de nuevo, añadir la solución sustrato (la misma empleada en el ELISA correspondiente) y continuar como se procede a partir de este paso en el ELISA correspondiente.

b) Para un conjugado de Ac: recubrir la placa con un Ag específico e incubar. Seguidamente lavar la placa, añadir el conjugado en diluciones dobles seriadas y un blanco de reactivos e incubar como se procede en el ELISA correspondiente. A continuación lavar la placa, añadir la solución sustrato (la misma empleada en el ELISA correspondiente) y seguir como se procede a partir de este paso en el ELISA correspondiente.

Se debe realizar repetibilidad y reproducibilidad para evaluar la precisión.

3. Evaluación del conjugado en el ELISA correspondiente.

Resultados

Los criterios para trabajar con 99,9 % de confianza serían 3 desviaciones estándar y un coeficiente de variación de hasta 10 %. Los resultados de la AE y la AI corresponderían en cada caso con la actividad mostrada en la máxima dilución del conjugado (Dil), donde la media de las densidades ópticas se encuentra por encima del valor límite (DO_F). El valor límite sería calculado como la media de las densidades ópticas del blanco de reactivos más 3 desviaciones estándar.

La AE y la AI se pudieran expresar como un valor numérico según la fórmula:

A= (DO_F /DE) x Dil

DE: desviación estándar del blanco de reactivos.

Discusión

Como en la AE no media interacción Ag-Ac, la señal que se obtiene representa a toda la enzima presente y de esta forma se determina su funcionamiento, independientemente del de la parte inmunológica.¹¹ En el ELISA d propuesto la señal que se obtiene es solo la de la enzima conjugada y por lo tanto se mide de manera indirecta la AI del reactivo. En el ELISA para el cual se preparó el reactivo, se evaluaría en conclusión la actividad específica del producto como conjugado.

Esta forma de proceder permitiría establecer un rango de valores de referencia para el trabajo (tanto para estudios de estabilidad como para evaluar conjugados similares que se preparen con posterioridad). Esta metodología podría convertirse también en una forma de ahorro de recursos y de tiempo. En este sentido, si desde un inicio se detecta que la enzima o la parte inmunológica no funcionan de manera adecuada, no sería necesario proseguir la evaluación. El algoritmo analítico propuesto va de métodos más sencillos y con resultados más rápidos, a métodos más complejos y con resultados más demorados.

Se concluye que la evaluación de conjugados inmunoenzimáticos por determinación de la AE, seguida de la evaluación inmunológica por ELISA d y finalmente de la evaluación de la actividad específica en el ELISA en que se va a emplear, pudiera constituir un algoritmo analítico por etapas para la caracterización adecuada de estos productos.

Proposal of an analytical methodology for the evaluation of immunoenzymatic conjugates

Summary

An analytical stage algorithm was proposed for evaluating the immunoenzymatic conjugates. They should be evaluated in the system where they are going to be used. This procedure has the limitation that if some deficiencies are detected it is not possible to identify whether they are produced by alterations of the enzyme, or of the molecule conjugated to it. The conservation of the enzymatic and immunological activity are key requirements in the obtention of a good conjugate. The algorithm starts with the enzymatic evaluation followed by immunological appraisal and, finally, by the assessment of the specific activity of the product as a conjugate. This methodology may also be a way of saving time and resources, once the reference values for the work are established. It was concluded that the proposed analytical algorithm may be a suitable procedure for the adequate characterization of immunoenzymatic conjugates.

 Key words: ELISA, conjugate evaluation, enzymatic activity, immunological activity.

 

Referencias bibliográficas

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10. Merlín Linares JC, Villaescusa Blanco R, Gerreiro Hernández AM, González González JM, Arce Hernández AA. Preparación de un conjugado peroxidasa- anti IgG humana (cadena) en conejo. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2001;17(2):132-7.

11. Fernández Romero T, González Griego AM, Fernández Acosta FJ, González Ramírez VE. Propuesta de la actividad enzimática como procedimiento analítico rector en la evaluación de conjugados. Rev Cubana Invest Biomed 2006;25(3).

Recibido: 10 de noviembre de 2006. Aprobado: 9 de diciembre de 2006.
Dra. Tammy Fernández Romero. Instituto de Ciencias Básicas y Preclínicas “Victoria de Girón “. Ave. 146 No. 3102 esquina Ave. 31. Cubanacán, municipio Playa, Ciudad de La Habana.Teléf.: 208 48 77. Correo electrónico: [e-mail]