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Introducción
El carcinoma papilar de tiroides (CPT) constituye la causa más frecuente de las enfermedades malignas de naturaleza endocrina. Predomina en el sexo femenino y se presenta entre la tercera y cuarta década de la vida con tasas de incidencia cada vez más altas. Son lesiones poco activas, con supervivencia a los diez años mayor del 95 %.1,2,3
A pesar de tener un buen pronóstico y alta supervivencia, se convierte en un problema de salud debido a su aumento exponencial, no solo por la exposición a los factores de riesgo, sino también a la mejora en el procedimiento de diagnóstico de los microcarcinomas.4,5
Puede dar lugar a dudas en el diagnóstico por su semejanza con otras variantes más agresivas6,7) y así llevar a cabo una cirugía amplia e invasiva, con sus numerosas complicaciones, en lugar de una más conservadora, en la que se pueda mantener la calidad de vida del paciente. Debe tenerse en cuenta la importancia de la conservación de las hormonas tiroideas para las diversas funciones biológicas y el metabolismo celular.8
A través de la morfometría podemos cuantificar una serie de parámetros celulares como área nuclear, volumen nuclear y factor de forma que confieren mayor precisión al estudio histopatológico y la densitometría óptica es una de las ramas. Existen trabajos que utilizan el análisis de la densidad óptica nuclear en el diagnóstico y pronóstico de las lesiones tumorales con resultados prometedores pero todavía son escasos.9,10,11
El conocimiento de la importancia que tienen los cambios cualitativos de la cromatina en enfermedades como el cáncer ha sido motivo de interés para que varios autores como Ferreira y otros12, Sabo y otros13 y Heidarian y otros14) hayan realizado estudios de los cambios de la cromatina de núcleos de células carcinomatosas a través de la aplicación de la densitometría óptica, con interesantes resultados en este campo.
Sin embargo, la morfometría y la densitometría óptica en enfermedades tumorales tiroideas, se limitan a investigaciones clínicas y no es muy usado en los diagnósticos histopatológicos, razón para trazar como objetivo del estudio la determinación de la densidad óptica nuclear en el carcinoma papilar de tiroides.
Al determinar la densidad óptica del núcleo de las células del carcinoma papilar de tiroides, podemos aportar una herramienta para el diagnóstico histopatológico y de esta forma contribuir con el beneficio de un tratamiento individualizado. Precisamente, para el tratamiento individualizado las características de la cromatina nuclear de las células tumorales1,12,13,15) tienen un gran valor; en particular, el diagnóstico del carcinoma papilar de tiroides se basa en sus características nucleares y, en menor escala, de las apreciaciones de su arquitectura papilar.1,14,16,17
Métodos
Se estudiaron una serie de pacientes portadores de carcinoma papilar de tiroides, el objeto de estudio fueron los indicadores morfométricos y el campo de la ciencia la morfometría de las lesiones malignas de la tiroides. Participaron todos los pacientes atendidos en el Hospital Provincial Universitario “Vladimir Ilich Lenin” de Holguín, con diagnóstico histológico de carcinoma papilar de tiroides. La investigación se desarrolló entre septiembre del 2015 y septiembre del 2017. En total, fueron 12 pacientes.
Se realizó la recolección de los bloques de parafina con las muestras de tejido tiroideo tumoral que cumplieran con los requisitos para su estudio histológico y morfométrico posterior.
Los cortes fueron consecutivos de 10 micrómetros de espesor y a diferentes niveles de profundidad, con un micrótomo vertical HistoLine ® modelo MR 3000 y luego teñidas con hematoxilina y eosina (H-E). Para lograr la uniformidad de la tinción se tuvo en cuenta el tiempo de exposición a la hematoxilina y la no diferenciación física (alcohol ácido) (Fig. 1).
Se capturaron las imágenes con una cámara de video digital Moticam ® de 3 megapíxel acoplada al microscopio trilocular Motic ® modelo BA-210 con la aplicación digital Motic ImagePlus 3.0 de la compañía China Motic S.A. y conectada a una computadora Dell, modelo Optiplex 7010, de la compañía Dell, mediante cable USB. Los aumentos objetivos empleados fueron de 40x y 100x.
El aumento total (At) de observación de las imágenes capturadas en la computadora se calculó por la fórmula:
(1)
Donde:
At: |
Aumento total. |
Ao: |
Aumento objetivo. |
ALR: |
Aumento del lente reductor. (0,5) |
LP: |
Largo de pantalla. (340 mm) |
SC: |
Sensor de la cámara digital. (8 mm) |
De esta manera, el aumento total con el que se trabajaron las imágenes histológicas fue de 850x con lente objetivo de 40x y 2125x con lente objetivo de 100x.
Para la realización de las mediciones se empleó la aplicación ImageJ v.1.49p del National Institutes of Health, EE. UU., 2015.
El indicador morfométrico nuclear estudiado fue la densidad óptica nuclear, la cual analiza cuantitativamente la densidad de la cromatina nuclear al existir relación directa entre los niveles de gris de la imagen digital y la condensación de la cromatina.12,13
Se fijaron y anotaron las condiciones de iluminación del microscopio y sus condiciones ópticas (objetivos, filtros, condensadores). Se tuvo en cuenta la configuración de la cámara (ganancia, desplazamiento y apertura) y la configuración del software de captura, además de utilizar idénticas condiciones en sucesivas sesiones de captura de imágenes. Se conservó un patrón de comparación en imagen digital de la preparación objeto de estudio.
La densitometría se realizó escogiendo aleatoriamente los núcleos de las células del tejido tumoral en 36 campos. Para cumplir el principio esencial de la morfometría, la aleatoriedad de las mediciones, se utilizó la opción grid del submenú plugins de la aplicación ImageJ, la que permite superponer sobre la imagen digital un conjunto de herramientas, como un cuadriculado o una malla de cruces y luego medir solo aquellos núcleos sobre los que coinciden las cruces de la malla. El área entre los puntos fue de 50 micrómetros cuadrados. Con esta selección aleatoria las mediciones se realizaron a un total de 965 núcleos.
Se tuvo en cuenta escoger aquellos núcleos que no tuvieran superposición de otras estructuras, por ejemplo, otros núcleos y que en las imágenes capturadas la mayor parte de los contornos estuviera nítida.
Con auxilio del software ImageJ, y el sistema Motic Digital Image v.2.0, cada imagen digital fue transformada en imagen de 8 bit con diferentes tonos de gris de 0 a 255 (Fig. 2).
Se realizó un aislamiento de los núcleos escogidos para el análisis independiente de la densidad óptica y se homogeneizaron a través de la opción threshold de la misma aplicación (Figs. 3 y 4), para lograr una lectura uniforme de la densidad óptica en todo el núcleo celular, teniendo en cuenta que la condensación de la cromatina no describe un patrón homogéneo en el núcleo en interfase.
Se realizó la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk, con vistas a determinar que los datos obtenidos provienen de una población que cumple los parámetros de la distribución normal. Se determinaron estadígrafos descriptivos como media, desviación estándar, coeficiente de variación e intervalo de confianza para una p ≤ 0,05. El editor estadístico utilizado fue el MyStat v.12 del 2015, de la compañía SyStat.
Se tuvo en cuenta los principios éticos para la investigación médica con datos provenientes de seres humanos recogidos en la Declaración de Helsinki y la guía de Organización Mundial de la Salud para los Comité de Ética de las Investigaciones, establecida por el Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas (Council for International Organizations Medical Sciences - CIOMS) en el 2002.
Resultados
La tabla resume el comportamiento de la densidad óptica de los núcleos escogidos al azar en 36 campos. Este indicador cuantifica la absorción de la luz por los núcleos celulares. Los núcleos más heterocromáticos absorbieron más luz, por lo que fueron más oscuros y la densidad óptica fue mayor; mientras que los núcleos eucromáticos no absorbieron la luz y se dejaron atravesar por ella, por esta razón, la densidad óptica o absorbancia óptica fue menor en ellos. Se obtuvo como resultado un valor mínimo de 0,79 y máximo de 1,72 para una media de 1,14.
Discusión
Cada vez cobran mayor significado las características del núcleo de las células del tejido tumoral en el diagnóstico histopatológico del carcinoma papilar de tiroides. Se tuvieron en cuenta variaciones en el número, la forma, el tamaño y la coloración y se reconocieron que estos elementos son tan importantes que pueden hacer el diagnóstico aun en ausencia de estructura papilar.
La literatura describe los núcleos de las células foliculares del carcinoma papilar de tiroides aumentados de tamaño con cromatina laxa que producen un aspecto óptico claro o vacío, que se denomina vidrio esmerilado o núcleos con ojo de la huérfana Annie.1,18)
Las alteraciones nucleares traducen cambios en procesos como la diferenciación, el ciclo celular y el estado del metabolismo durante diferentes estados fisiológicos de la célula. Ello, como es conocido, implica alteraciones genéticas que pueden consistir en una mutación puntual, translocación, delección y ganancia o pérdida de un cromosoma completo.19
La cromatina, al contener la información genética y aportar al núcleo la función de ser el centro de control de la célula, manifiesta cambios morfológicos apreciables que, a través de la densitometría óptica, son mensurables y posibilita su interpretación posterior.
La cromatina laxa es considerada por varios autores1,13,14,15) como un criterio para valorar la diferenciación de los tejidos, fundamentalmente en los tumores. La densitometría óptica nuclear, al cuantificar la cromatina de los núcleos celulares, pudiera representar una herramienta de mucho valor diagnóstico y pronóstico, ya que permite comparaciones entre las gradaciones tumorales y entre los diferentes tipos histológicos.20,21,22)
Sabo y otros,13) en su estudio morfométrico en pacientes portadores de esófago de Barret, concluyeron que la densidad óptica nuclear es una poderosa herramienta para predecir la progresión hacia el adenocarcinoma invasivo en pacientes portadores de esta enfermedad. Según los investigadores, en esta entidad los valores de la densidad óptica nuclear en los casos negativos para displasia son inferiores a los valores de los casos con alto grado de displasia.
Heidarian y otros,14 en el trabajo sobre el análisis morfométrico nuclear en biopsias aspiración con aguja fina de tiroides, concluyeron que la intensidad media de píxel fue el indicador con mayor valor predictivo entre los casos malignos y los benignos.
El resultado de la densidad óptica nuclear en el estudio es considerado por los autores como bajo, si se tiene en cuenta que los valores de la densidad óptica de la media de los núcleos celulares es de 1,14 y los valores de la densidad óptica van desde cero hasta 2,5. Lo anterior coincide con la literatura revisada, que caracteriza a los núcleos de las células del carcinoma papilar de tiroides con cromatina laxa.1,12,13,18)
Los resultados muestran un comportamiento semejante a trabajos como el de Ferreira y otros,12) en el que los resultados de la media de la densidad óptica nuclear en las lesiones malignas de tiroides, como el carcinoma folicular mínimamente invasor, son superiores a los resultados de la media de la densidad óptica nuclear de los nódulos adenomatosos. Ferreira y otros12 concluyeron que las variables densitométricas fueron útiles en la distinción entre lesiones benignas y malignas.
La gradación de los tumores viene determinada por el aspecto histológico y se basa en la idea de que existe una relación entre la conducta y la diferenciación celular, donde los menos diferenciados se comportan de un modo más agresivo.1
La diferenciación celular en el campo de la biología se describe como el proceso en el cual la célula sufre cambios morfológicos y bioquímicos para dedicarse a cumplir una o varias funciones, pero con respecto al cáncer este término describe en qué medida el aspecto del tumor se parece al tejido del que surge.
Las células cancerosas bien diferenciadas se parecen más a las células normales y tienden a crecer en tamaño y en menor medida a proliferar, lo cual demanda gran producción de proteínas estructurales y para la exportación, porque el tejido tumoral bien diferenciado trata de mantener la función original del tejido sano, en este caso, la producción de hormonas tiroideas.1,23,24
Si se tiene en cuenta que la cromatina laxa es la cromatina metabólicamente activa, despirilizada, que traduce una alta actividad de síntesis de proteínas al permitir la transcripción del ADN, el tejido tumoral del CPT utiliza su maquinaria de síntesis proteica para la diferenciación tumoral y, en menor medida, para la proliferación celular, comportamiento que se corresponde con tumores bien diferenciados, como lo es esta variante histológica.
Algunos autores plantean que la diferenciación celular muestra una relación inversa con la proliferación celular y la velocidad de crecimiento, consideradas como factores de mal pronóstico con invasión y destrucción de tejidos adyacentes, lo que aumenta el riesgo de metástasis a otras partes del cuerpo a través de la linfa o la sangre.1
Estos criterios pudieran ser considerados para establecer relaciones entre la densidad de cromatina y el grado de diferenciación y, por lo tanto, el pronóstico de la enfermedad basado en la proliferación y velocidad de crecimiento del tejido tumoral.
La densidad óptica nuclear puede ser empleada para contribuir en el diagnóstico del carcinoma papilar de tiroides y lograr un tratamiento cada vez más individualizado en los pacientes con este tipo de cáncer.
