ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

Influencia del NaCl en indicadores bioquímicos evaluados en callos de Stylosanthes guianensis CIAT-184

 

Influences of the NaCl in biochemical indicators evaluated in callus of Stylosanthes guianensis CIAT-184

 

 

Leticia Fuentes^I, Y. Pérez^I, Amalia Domínguez^I, A.R. Mesa^II y S. González^III

^ICentro de Estudios Biotecnológicos-Universidad de Matanzas "Camilo Cienfuegos". CP 44740

^IIEEPF "Indio Hatuey", Matanzas, Cuba

^III Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Cuba

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RESUMEN

La acumulación de determinados metabolitos y los cambios en la actividad de enzimas antioxidantes, como la catalasa y la peroxidasa, pueden relacionarse con las potencialidades de una planta para contrarrestar el efecto nocivo de la salinidad en los diferentes procesos fisiológicos y morfológicos. En el presente trabajo se determinaron los contenidos de proteínas y carbohidratos totales, así como la actividad de enzimas catalasas y peroxidasas, en callos obtenidos a partir de tres explantes de Stylosanthes guianensis CIAT-184, cultivados en medio MS suplementado con 1 mg/L de 2,4-D, 2 mg/L de 6 BAP y diferentes concentraciones de NaCl (0, 25, 50, 75 y 100 mM). La actividad catalasa fue mayor en las hojas verdaderas que en el resto de los explantes, aunque en los tres casos aumentó hasta 50 mM de NaCl para luego decrecer progresivamente. Por su parte, los hipocótilos mostraron la mayor actividad peroxidasa, con incrementos sostenidos hasta los 100 mM de la sal; mientras que en los otros explantes la actividad decreció a partir de 75 mM. No se detectaron cambios sustanciales en la concentración de proteínas totales; mientras que en los carbohidratos hubo un incremento considerable para las mayores concentraciones de cloruro de sodio, lo cual pudiera tener relación con la acumulación de osmolitos protectores.

Palabras clave: Callo, carbohidratos, enzima, salinidad, Stylosanthes guianensis

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ABSTRACT

The accumulation of certain metabolites and the changes in the activity of antioxidant enzymes, such as catalases and peroxidases, can be related to the plant possibilities for counteracting the negative effects of salinity on physiological and morphological processes. In this work, the levels of total proteins and carbohydrates, and the enzymatic activities of catalases and peroxidases were determined in calluses obtained from three explants of Stylosanthes guianensis CIAT-184, cultured in MS medium supplied with 1 mg/L of 2,4-D, 2 mg/L de 6 BAP and different concentrations of NaCl (0, 25, 50, 75 and 100 mM). Although the activity of catalases increased until 50 mM in the three explants and diminished after that, the highest values were detected in true leaves. On the other hand, the hypocotyls showed the highest activity of peroxidases with progressive increments until 100 mM of the evaluated salt, while the rest of explants showed a decrease in the enzymatic activities from 75 mM. No appreciable changes were detected in total proteins, while in the carbohydrates there was considerable increase for the highest values of sodium chloride, which could be related to the accumulation of protecting osmolytes.

Key words: Callus, carbohydrates, enzyme, salinity, Stylosanthes guianensis

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INTRODUCCIÓN

La respuesta fisiológica de las plantas al estrés salino es multigénica, ya que se afectan varios procesos vinculados a los mecanismos de tolerancia, tales como la producción de compuestos osmóticamente activos, la producción de especies reactivas al oxígeno, los mecanismos de defensa antioxidante, el transporte iónico y la compartimentación de iones perjudiciales en las vacuolas (Sairam y Tyagi, 2004).

La tolerancia de diferentes especies a estreses ambientales se correlaciona con un eficiente sistema antioxidante, que comprende un grupo de enzimas detoxificadoras, como las superóxido dismutasas, las catalasas y peroxidasas (Gueta-Dahan, Yaniv, Zilinskas y Ben-Hayyin, 1997; Sreenivasulu, Grimm, Wobus y Weschke, 2000), y antioxidantes no enzimáticos como polisacá-ridos, poliaminas y aminoácidos, entre otros.

El origen común de las especies vegetales a partir de ancestrales que habitaron el medio marino, sugiere la posibilidad de obtener plantas más tolerantes a la salinidad mediante el cultivo reiterado en estas condiciones, dada la posibilidad de existencia de genes de tolerancia en todas las plantas (Zhu, 2001). Los trabajos de mejora genética por los métodos convencionales, poco aplicables al género Stylosanthes (el cual agrupa la tercera parte de las leguminosas destinadas a la ganadería), conllevan la utilización combinada de métodos biotecnológicos y selectivos (Consoli, Vieira, Lopes de Souza y Garcia, 1996; Quecini, Oliveira, Alves y Vieira, 2002). Este género es reconocido como un modelo de regeneración in vitro, con diferencias en la respuesta a las condiciones de cultivo a nivel de especies, entre cultivares e incluso entre explantes de un mismo cultivar.

El presente trabajo tuvo como objetivo evaluar la actividad enzimática de catalasas y peroxidasas, así como los contenidos de proteínas y carbohidratos totales de diferentes explantes de Stylosanthes guianenesis CIAT-184, sometidos a medios inductores de callos organogénicos en condiciones de estrés salino.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para la inducción de la organogénesis, las plántulas de un mes de germinadas en sustrato inerte humedecido con agua destilada estéril, se seccionaron en fragmentos de 10 mm de sus hipocótilos (Hi), hojas cotiledonales (Hc) y hojas verdaderas (Hv). Estos se colocaron en frascos de cristal con 30 mL de medio MS (Murashige y Skoog, 1962), suplementado con 7 g/L de agar, 15 g/L de sacarosa, 2,4-D (1,0 mg/L), 6 BAP (2 mg/L), vitaminas MS y varias concentraciones de NaCl (0 mM, 25 mM, 50 mM, 75 mM y 100 mM).

Se utilizaron seis frascos con seis explantes (dos de cada tipo) para cada una de las cinco variantes de medios de cultivo, en un diseño completamente aleatorizado, con tres réplicas de cada tratamiento.

A los 21 días de sembrados los explantes se realizó la determinación de las actividades enzimáticas catalasa y peroxidasa en los callos, los cuales se lavaron con agua destilada estéril para eliminar los restos de agar y se secaron sobre papel de filtro estéril. Después se homoge-nizaron en frío, en un mortero de porcelana con una solución tampón de fosfato de sodio (50 mM, pH 7,0) y luego se centrifugaron a 10 000 rpm. Inmediatamente se extrajo el sobrenadante para la medición de la actividad enzimática.

La actividad catalasa se determinó a través de la velocidad de descomposición del H₂O₂ a 240 nm en una solución tampón de fosfato de potasio (20 mm, pH 7,0), que contenía 3% (v/v) de H₂O₂; el volumen final del ensayo fue de 3 mL. La actividad peroxidasa se midió por el método guaiacol peroxidasa a 25ºC (Chance y Machley, 1955). La actividad enzimática se realizó en un volumen final de 3 mL, que contenía: 2,80 mL de solución tampón de fosfato de sodio (0,1 M, pH 7,0); 0,05 mL de solución guaiacol (0,018 M) y 0,05 mL de solución de H₂O₂ previamente ajustada a una absorbancia entre 0,40-0,41; se utilizó como blanco agua destilada. La lectura se hizo a 436 nm en un espectofotómetro (Ultrospect 2000); se tomaron tres réplicas por cada tratamiento.

La concentración de proteínas se estimó por el método de Lowry (Lowry, Rosebrough, Farr y Randall, 1951) a partir del sobrenadante tomado de las muestras homogenizadas.

Los carbohidratos totales se determinaron en el sobrenadante de las muestras homogenizadas por el método del fenol-sulfúrico, utilizando glucosa como solución estándar (Dubois, Gilles, Hamilton, Rebers y Smith, 1956).

En todos los casos se tomaron muestras de diez callos y tres lecturas de densidad óptica (DO). Los datos se procesaron según el paquete Statgraphic Plus 4 sobre Windows y se determinó el ajuste a una distribución normal mediante la prueba de bondad de ajuste Kolmogorov-Smirnov y la homogeneidad de varianza mediante las pruebas de Bartlett (Sigarroa, 1985). En los casos en que los datos cumplieron los requisitos exigidos se procesaron mediante ANOVA de clasificación simple o multifactorial, y por la prueba de rangos múltiples de Duncan, según correspondiera. Los datos que no cumplieron con estas premisas se compararon mediante la prueba de Kruskal-Wallis (Kruskal y Wallis, 1952) y la prueba de rangos múltiples de Student-Newman-Keuls (SNK).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

A la semana de sembrados los tres explantes (Hi, Hc y Hv) en medio MS, suplementado con diferentes concentraciones de NaCl, se apreció la formación de masas de tejido desdiferenciado de color blanquecino en los sitios donde se realizó el corte. A los 15 días de la siembra eran evidentes masas callogénicas de aspecto friable (Pierik, 1990) en la superficie vegetal de todos los explantes (fig. 1), que manifestaban diferencias en cuanto al tamaño, la coloración y la textura. En la variante de medio suplementada con 100 mM de cloruro de sodio los callos tenían un menor desarrollo, con una coloración parda más intensa y una textura mucho más friable que en las restantes variantes de cultivo.

A los 30 días la mayoría de los explantes estaban completamente transformados en callos, aunque en algunos casos los hipocótilos en 75 mM mantenían zonas poco desdiferenciadas. Sin embargo, resultó interesante la formación de plántulas completas en Hi cultivados a 100 mM, lo que indica una organogénesis directa. En presencia de hormonas la respuesta morfológica, en términos de desarrollo de callos y formación de brotes o raíces, depende de la parte de la planta a partir de la que se obtuvo el callo (Consoli et al., 1996).

La capacidad callogénica in vitro de diferentes especies de este género ha sido referida por varios autores (Meijer, 1982; Consoli et al., 1996; Valarini, Otsuk y Vieira, 1997; Fuentes, Mesa, Ruíz, Peláez de Lucas y Fernández, 2005), siempre que se utilice un medio de cultivo suplementado con auxinas y citoquininas en una relación menor que uno (Mroginski y Kartha, 1981). Sin embargo, no se han encontrado referencias en relación con la formación de callos en presencia de cloruro de sodio.

La formación de callos a partir de distintos fragmentos de plantas en condiciones salinas, ha sido reportada por varios autores en otras especies tales como: Cicer arietinum (Pandey y Ganapathy, 1985); Lycopersicum esculentum Mill Peto 863 (El-Enany, 1995); cuatro cultivares de Solanum tuberosum (Rahnama, Ebrahimzadeh y Ghareyazie, 2003), en la especie Alhagi graecorum, tolerante a concentraciones entre 43 y 200 mM (Hassanein, 2004) y en Chrysantemum morifolium (Hossain, Azad, Datta y Biswas, 2007). En los estudios realizados en C. arietinum fue posible obtener líneas celulares tolerantes hasta 200 mM, las cuales eran capaces de acumular determinados metabolitos como la prolina, a diferencia de las líneas susceptibles evaluadas como control.

Otras posibles respuestas al estrés producido por NaCl en el medio de cultivo están relacionadas con la activación de mecanismos antioxidantes. En este sentido, en callos de 21 días de formados en condiciones salinas la actividad catalasa se mantuvo, de manera general, sin variaciones significativas hasta 50 mM, con excepción de los callos obtenidos a partir de Hv, donde se observó un incremento notable (fig. 2). Sin embargo, con concentraciones superiores la actividad enzimática decreció considerablemente.

Estos resultados pudieran estar relacionados con la afectación de la expresión de la enzima o de la propia actividad de ella por cambios en la conformación de su estructura, cuando las concentraciones son superiores a 50 mM de sal. En los estudios realizados por Rahnama et al. (2003), en cuatro cultivares de S. tuberosum sometidos a estrés salino (entre 0 y 150 mM de NaCl), se observaron cambios en la actividad catalasa en dependencia de la variedad.

En la actividad peroxidasa se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre la concentración de cloruro de sodio y el tipo de explante (fig. 3). Se observó un incremento de dicha actividad hasta 50 mM; a partir de esta concentración disminuyó progresivamente hasta 100 mM, con excepción de los callos provenientes de hipocótilos.

Varios autores han hecho referencia a la correlación entre la respuesta de las enzimas antioxidantes (como las peroxidasas) y la tolerancia a las condiciones de estrés abiótico (Hassanein, Ahmed, Abed-El-Hafez y Soltan, 1999; El-Tayeb y Hassanein, 2000). Hassanein (2004) evaluó la actividad enzimática de varias enzimas detoxificadoras en callos inducidos, en condiciones de estrés hídrico y salino (176 mM de NaCl), en dos especies de plantas con diferentes niveles de tolerancia: A. graecorum (tolerante) y L. esculentum L. (sensible); este autor detectó incrementos en la actividad peroxidasa de las especies en ambas condiciones estresantes, motivado por la activación de nuevas isoformas en relación con el control y por los incrementos en la expresión de algunas isoenzimas, que mostraron bandas con mayor intensidad en la tinción. Sin embargo, el porcentaje de incremento en la actividad fue mucho mayor en los callos de A. graecorum, especie catalogada como tolerante a ambas condiciones. Hossain et al. (2007) obtuvieron resultados similares en regenerantes de Ch. morifolium, obtenidos a partir de callos tolerantes que fueron subcultivados en concentraciones cada vez mayores de NaCl. En otras especies, como S. tuberosum (Rahnama et al., 2003), la actividad peroxidasa sólo mostró incrementos en condiciones moderadas de salinidad.

La actividad enzimática específica se relacionó con el contenido de proteína de las muestras analizadas. Las proteínas totales en el sobre-nadante de los callos de Stylo 184, después de la maceración en frío y centrifugación, mostraron un comportamiento homogéneo para las diferentes variantes de salinidad y explantes (fig. 4).

Este resultado pudiera deberse a los cambios en la expresión de numerosos genes bajo la influencia del cloruro de sodio. Sairam y Tyagi (2004) encontraron numerosas evidencias de cambios en la expresión génica de plantas sometidas a diferentes factores abióticos. En este sentido, mientras determinados procesos que implican una síntesis activa de proteínas (como la división celular) son afectados total o parcialmente por el estrés osmótico debido a la presencia de cloruro de sodio en el medio (Xiong y Zhu, 2002), otro grupo importante de proteínas podrían ser sobreexpresadas. Entre estas se encuentran las enzimas antioxidantes como mecanismo para eliminar los radicales libres del oxígeno, cuyos niveles son exacerbados bajo el efecto del estrés salino (Hernández, Jiménez, Mullineaux y Sevilla, 2000), así como enzimas ATPasas, transportadores proteicos de iones y acuaporinas para mantener la homeostasis iónica intracelular (Xiong y Zhu, 2002).

Por otra parte, los carbohidratos totales en los distintos tratamientos mostraron un incremento para las mayores concentraciones de salinidad (75 y 100 mM) en todas las variantes de explantes (fig. 5).

El aumento en los carbohidratos en la medida que se incrementó la concentración salina del medio, pudo ser ocasionado por diversos factores. La acumulación considerable de almidón en tejidos cultivados en medios para la inducción de procesos organogénicos fue informada por Mangat, Pelekis y Cassels (1990) y Fortes y Pais (2000). La organogénesis es un proceso altamente consumidor de energía, la cual se obtiene a partir de la degradación del almidón, ya que se producen intermediarios glicolíticos que pueden ser catabolizados para producir gran cantidad de ATP. Los estudios realizados en diferentes especies, como: Nicotiana tabacum (Thorpe, Joy y Leung, 1986), Manihot sculenta (Stamp, 1987) y Humulus lupulus (Fortes y Pais, 2000), han demostrado este hecho.

Por otra parte, se ha referido la posibilidad de que el tejido sometido a estrés por salinidad, sintetice determinados azúcares para compensar la diferencia de potencial osmótico entre el medio intracelular y el extracelular (Sairam y Tyagi, 2004).

Los cambios en la concentración de carbohidratos y en la actividad enzimática catalasa y peroxidasa, tanto en plántulas como en callos de S. guianensis cv. CIAT-184 obtenidos en condiciones salinas, pueden constituir una parte del mecanismo fisiológico de defensa frente a este estrés, por lo que debe considerarse su pesquisaje en futuros estudios de selección de somaclones con tolerancia a la salinidad.

Conclusiones

La actividad catalasa fue mayor en las hojas verdaderas que en el resto de los explantes, aunque en los tres casos aumentó hasta 50 mM de NaCl y después decreció progresivamente. Entre los explantes, los hipocótilos fueron los de mayor actividad peroxidasa, los cuales mostraron incrementos sostenidos hasta 100 mM de NaCl; mientras que en las hojas cotiledonales y verdaderas la actividad decreció a partir de 75 mM. No se detectaron cambios sustanciales en la concentración de proteínas totales; mientras que en los carbohidratos hubo un incremento considerable con las mayores concentraciones de cloruro de sodio, lo cual pudiera estar relacionado con la acumulación de osmolitos protectores.

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Recibido el 4 de octubre del 2007
Aprobado el 13 de diciembre del 2007.