ARTÍCULO ORIGINAL

 

Biofumigación con Brassica juncea L. Czerniak y Sinapis alba L. Acción sobre el crecimiento in vitro de Trichoderma spp. y Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner

 

Biofumigation with Brassica juncea L. Czerniak and Sinapis alba L. In vitro action on the growth of Trichoderma spp. and Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner

 

 

Omar Salvador Perniola^I*, Silvia Elena Chorzempa^II, Sebastián Staltari^I, Marta Mónica Astiz Gassó^I, Liliana Rosa Galian^II, María del Carmen Molina^I,III

^IInstituto Fitotécnico de Santa Catalina, Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, UNLP. Garibaldi 3400, Llavallol, CP 1836, Buenos Aires, Argentina.
^IIFacultad de Ciencias Agrarias, UNLZ. Ruta Nº 4, Km 2, Llavallol, CP 1836, Buenos Aires, Argentina.
^IIICONICET.

 

 

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RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto in vitro de la biofumigación con Brassica juncea L. Czerniak y Sinapis alba L. sobre el crecimiento de Trichoderma spp. y Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner. Se trituraron plantas de B. juncea y S. alba y se colocaron, por separado, en recipientes de plástico en dosis de 5, 15, 25, 35 y 55 g. Sobre el material triturado se apoyaron cajas Petri que contenían medio de cultivo inoculado con Trichoderma spp. o A. brasilense. Los recipientes de plástico se taparon e incubaron en oscuridad durante siete días, a 25±2ºC (Trichoderma spp.) y a 31±2ºC (A. brasilense). Finalizado ese periodo, se midió el diámetro de las colonias de Trichoderma spp. y se recontó el número de unidades formadoras de colonias de A. brasilense. Los resultados que se obtuvieron, in vitro, son los siguientes: i) no se observó efecto fungistático de B. juncea y de S. alba sobre Trichoderma spp. en ninguna de las dosis; ii) B. juncea inhibió el crecimiento de las colonias de A. brasilense con dosis de 15 g o superiores, con un aumento de la inhibición a medida que se incrementó la dosis del biofumigante; iii) S. alba no inhibió el crecimiento de las colonias de A. brasilense en ninguna de las dosis. Estos resultados sugieren que la técnica de biocontrol con el hongo antagonista Trichoderma spp. sería compatible con la biofumigación con B. juncea y S. alba. Además, A. brasilense solo sería compatible con la biofumigación con S. alba y con dosis bajas de B. juncea.

Palabras clave: hongo antagonista, rizobacteria (PGPR), brassicáceas, biocontrol.

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ABSTRACT

The aim of this work was to evaluate the in vitro effect of the biofumigation with Brassica juncea L. Czerniak and Sinapis alba L. on the growth of Trichoderma spp. and Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner. Five doses (5, 15, 25, 35 and 55 g) of triturated plant material from B. juncea and S. alba were placed separately in plastic containers. Petri dishes with culture medium inoculated with Trichoderma spp. or A. brasilense, were placed on top of the plant material. The plastic containers were then covered and incubated in darkness for 7 days at 25±2ºC (Trichoderma spp.) and 31±2ºC (A. brasilense). After that, the diameter of the colonies of Trichoderma spp. was measured, and the number of colony forming units of A. brasilense was counted. The results indicated that: i) fungistatic effect of B. juncea and S. alba was not observed on Trichoderma spp. at any doses; ii) B. juncea inhibited colony growth of A. brasilense at doses of 15 g or higher, with an increasing inhibition as the biofumigant dose increased; iii) S. alba did not inhibit colony growth of A. brasilense at any doses. These in vitro results suggest that the technique of biocontrol with the antagonist fungus Trichoderma spp. can be compatible with biofumigation with B. juncea and S. alba. Also, A. brasilense can only be compatible with biofumigation with S. alba and with low doses of B. juncea.

Key words: antagonistic fungi, rhizobacteria (PGPR), Brassicaceae, biocontrol.

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INTRODUCCIÓN

En los programas de manejo integrado de plagas es frecuente combinar diversas tácticas para lograr, ecológica y económicamente, un manejo eficiente de una plaga dentro del agroecosistema. Por ello resulta fundamental conocer la compatibilidad de las tácticas aplicadas para evitar interferencias entre las mismas. Algunas tácticas de manejo, como son la biofumigación, la aplicación de Trichoderma spp. y de Azospirillum spp. demostraron ser eficientes en el control de numerosos patógenos. Sin embargo, resulta escasa la información concerniente a la compatibilidad entre estas técnicas.

La biofumigación consiste en la supresión de organismos edáficos nocivos, por medio de la liberación de compuestos originados durante la descomposición de especies de brassicáceas (1, 2). Los conocimientos actuales sobre la técnica de biofumigación se refieren, principalmente, al biocontrol de organismos perjudiciales para los cultivos (3, 4, 5), pero es limitada la información relativa a su efecto sobre los microorganismos benéficos del suelo, como Trichoderma spp. y Azospirillum spp.

La técnica de biofumigación estimula la actividad de los microorganismos descomponedores del suelo, pues son directamente responsables de la degradación del material incorporado (6). La biofumigación produce cambios en la estructura y la función de la comunidad microbiana del suelo que se relacionan, principalmente, con cambios en la disponibilidad del sustrato microbiano, derivados de la modificación del suelo con materiales orgánicos (7). Qiujun et al. (8) observaron que la biofumigación con colza incrementó la diversidad bacteriana y disminuyó la diversidad de hongos del suelo.

Varias especies del género Trichoderma poseen acción biocontroladora como consecuencia de la elevada tasa de crecimiento, la producción de metabolitos con actividad antibiótica y la manifestación de micoparasitismo ante diversos patógenos (9). El control biológico de Trichoderma spp. abarca un amplio rango de patógenos (10, 11, 12).

Dentro del grupo de las bacterias rizosféricas promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), el género Azospirillum es el más intensamente estudiado (13). Además de tener un efecto benéfico para el crecimiento de las plantas, numerosas investigaciones mencionan a Azospirillum spp. con significativa actividad de control biológico (14, 15).

Los antecedentes del efecto de la biofumigación sobre hongos del género Trichoderma son escasos. Kirkegaard y Matthiessen (2) argumentaron que son necesarias bajas concentraciones de isotiocianatos para detener el crecimiento de ciertos patógenos, como son Sclerotinia spp. o Pythium spp.; pero para afectar a Trichoderma spp. se requieren dosis 30 veces superiores. Dandurand et al. (16) informaron que la biofumigación con Brassica napus L. puede ser incompatible en combinación directa con Trichoderma harzianum Rifai. Por su parte, Salem (17) trabajó con paja de arroz enriquecida con Trichoderma spp. y observó que la biofumigación con ese sustrato actuó en forma sinérgica con el hongo Trichoderma en el control de patógenos de suelo.

Actualmente, no se conocen antecedentes relativos al efecto de la biofumigación sobre las bacterias del género Azospirillum. Qiujun et al. (18) estudiaron el efecto in vitro de la biofumigación con harina de colza sobre la PGPR Bacillus amyloliquefaciens (ex Fukumoto 1943) Priest et al. 1987 emend. Wang et al. 2008 y observaron que el biofumigante inhibió su crecimiento. Otros investigadores mencionaron la utilización combinada de la biofumigación con Brassica juncea L. Czerniak y Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn para el control de tizón del arroz (19, 20, 21).

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto in vitro de la biofumigación con B. juncea y Sinapis alba L. sobre el crecimiento de Trichoderma spp. y Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner, con la finalidad de determinar la posibilidad de la utilización combinada de estas tácticas de manejo de plagas.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

El material vegetal utilizado para la biofumigación fue la parte aérea de plantas de B. juncea (mostaza parda) y S. alba (mostaza blanca), cultivadas en el campo experimental del Instituto Fitotécnico de Santa Catalina (IFSC), Llavallol, Argentina. El cultivo se sembró en mayo de 2013; cuando alcanzó el estadio de fin de fructificación (en octubre del mismo año), se cosechó la parte aérea.

El hongo Trichoderma spp. se obtuvo del producto comercial Biagro TL^® (5 x 10⁸ conidios de Trichoderma spp. x ml^-1 a la fecha de su elaboración), que consiste en un formulado biológico generado a través de un convenio de vinculación tecnológica entre el IFSC y el laboratorio Biagro S.A., a base de cepas nativas aisladas del campo experimental del IFSC (22).

La bacteria A. brasilense se obtuvo de un inoculante comercial con una concentración de 1 x 10⁷ x ml^-1 al momento de su elaboración.

Los ensayos realizados se basaron en una modificación de la metodología utilizada por Mayton et al. (4) para seleccionar genotipos de Brassica spp. que producen compuestos fungicidas volátiles. Los dos tercios superiores de la parte aérea de las plantas de B. juncea y S. alba se segaron y se llevaron al laboratorio. El material cosechado se lavó con agua destilada estéril, se cortó en trozos pequeños y se trituró en una procesadora durante un minuto aproximadamente. El material triturado se colocó en recipientes de plástico de 900 ml, en dosis de 5, 15, 25, 35 y 55 g.

Previamente, la cepa de Trichoderma spp. se multiplicó en medio agar papa glucosado (APG) al 2%, durante siete días a 25±2ºC y en oscuridad. De ese cultivo se tomaron discos de 5 mm de diámetro que se extrajeron de la parte más externa de las colonias y de activo crecimiento micelial; se transfirieron, de a uno, a cajas Petri con medio APG al 2%.

Por otro lado, se obtuvieron los cultivos de A. brasilense mediante la técnica de siembra en placa por extensión en superficie, en medio Rojo Congo (RC) (23). Se realizaron diluciones decimales sucesivas hasta 10^-6 de inoculante comercial en solución fisiológica con 0,01% de Tween 80. Luego se sembraron 100 ml de dilución por caja Petri.

Las cajas Petri con un disco de Trichoderma spp. y las inoculadas con A. brasilense se colocaron, de a una, dentro de los recipientes que contenían el biofumigante, apoyadas sobre soportes de plástico y elevadas 2 a 3 cm por encima del material vegetal triturado. Los recipientes se cerraron con tapas plásticas. Para el tratamiento control se siguió la misma metodología pero no se utilizó material vegetal biofumigante.

Los recipientes de plástico con sus respectivos contenidos se incubaron en cámara de crecimiento durante siete días, en oscuridad. La temperatura de incubación fue de 25±2ºC para Trichoderma spp. y de 31±2ºC para A. brasilense.

Finalizado el periodo de incubación, se midió el diámetro de las colonias de Trichoderma spp. y se cuantificó el número de unidades formadoras de colonias (UFC) de A. brasilense por caja Petri.

Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado con cinco repeticiones por tratamiento. El análisis de los datos de A. brasilense se realizó mediante un ANOVA simple y la comparación de medias con la prueba de Tukey. En el caso de la evaluación del efecto de B. juncea sobre A. brasilense, los datos no cumplieron los supuestos de normalidad, homocedasticidad y aleatoriedad; por ese motivo se transformaron mediante la raíz cuadrada y se sometieron al mismo análisis estadístico y a una regresión simple. Los datos de Trichoderma spp. no registraron varianza, por lo tanto, se aplicó estadística no paramétrica mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Los análisis se efectuaron con el programa Statistica 7.

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efecto de la biofumigación con B. juncea y S. alba sobre Trichoderma spp.

En todos los tratamientos, el hongo Trichoderma spp. colonizó íntegramente las cajas Petri y sus colonias presentaron el mismo diámetro que el control sin biofumigante (p value = 1; H = 0). La biofumigación con B. juncea y S. alba no inhibió el crecimiento de las colonias de Trichoderma spp. en ninguna de las dosis evaluadas.

Estos resultados concuerdan con los de un trabajo previo donde no se observó inhibición del crecimiento in vitro de las colonias de Trichoderma spp. con dosis de 5 y 10 g del biofumigante B. juncea (5).

Resultados similares hallaron otros investigadores que analizaron el efecto de la biofumigación de otras brassicáceas sobre Trichoderma spp. En pruebas in vitro, Sanchi et al. (24) observaron que Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary y Sclerotinia minor Jagger fueron más sensibles a los isotiocianatos liberados por Brassica carinata Braun que la cepa T39 de T. harzianum. Galletti et al. (25) analizaron in vitro el efecto de la biofumigación con harina de semilla de B. carinata sobre 40 aislados de Trichoderma spp. y hallaron que fueron menos sensibles a los gases que todos los patógenos ensayados (Pythium ultimum Trow, Rhizoctonia solani Kühn, Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr.), aunque observaron un efecto fungistático sobre Trichoderma spp. a la dosis más alta del biofumigante.

Efecto de la biofumigación con B. juncea y S. alba sobre A. brasilense

En los tratamientos con dosis de 15 g o más de B. juncea, la cantidad de UFC de A. brasilense fue significativamente inferior que en el control sin biofumigante (p value = 1,9 x 10^-14) (Tabla 1).

El número de UFC de A. brasilense disminuyó a medida que se incrementó la dosis de B. juncea. A los datos observados se ajustó un modelo de regresión exponencial, que ofreció un elevado coeficiente de determinación (R² = 0,828; S = 0,316; p value = 3,2 x 10^-13) y respondió a la ecuación: Y = 55,679 * e^-0,0718*X, donde Y representa las UFC de A. brasilense por caja Petri y X es la dosis de B. juncea (Fig. 1).

La biofumigación con 15 g o más de B. juncea inhibió el crecimiento de las colonias de A. brasilense, según modelo exponencial negativo; la inhibición fue mayor cuanto mayor fue la dosis del biofumigante (Fig. 1).

Los tratamientos con 25, 35 y 55 g del biofumigante B. juncea provocaron, además, alteraciones morfológicas macroscópicas en las colonias, las cuales presentaron forma atípica y coloración rosada con halo mucoso.

Los tratamientos con S. alba no registraron diferencias significativas en el número de UFC de A. brasilense con respecto al control sin biofumigante ni entre las distintas dosis (p value = 0,1118) (Tabla 1). La biofumigación con S. alba no inhibió el crecimiento de las colonias de A. brasilense en las dosis evaluadas.

Este es el primer reporte sobre el efecto de la biofumigación con B. juncea y S. alba sobre el crecimiento de la bacteria A. brasilense.

 

CONCLUSIONES

Los resultados in vitro sugieren que la técnica de biocontrol con el hongo antagonista Trichoderma spp. sería compatible con la biofumigación con B. juncea y S. alba. En cambio, el biocontrolador A. brasilense solo sería compatible con el biofumigante S. alba y con dosis bajas de B. juncea, ya que con dosis de 15 g o más de B. juncea se inhibe significativamente el crecimiento de la bacteria.

Los estudios in vitro realizados son la base para la ejecución de los ensayos en campo que permitirán determinar fehacientemente la compatibilidad de estos métodos de control biológico.

 

REFERENCIAS

1. Kirkegaard JA, Gardner PA, Desmarchelier JM, Angus JF. Biofumigation using Brassica species to control pests and diseases in horticulture and agriculture. Proceedings of 9th Australian Research Assembly on Brassicas. 5-7 Octubre 1993. Wagga Wagga, Australia. p. 77-82.

2. Kirkegaard JA, Matthiessen JN. Developing and refining the biofumigation concept. Agroindustria. 2004;3:233-239.

3. Kirkegaard JA, Wong PTW, Desmarchelier JM. In vitro supression of fungal root pathogens of cereals by Brassica tissues. Plant Pathol. 1996;45:593-603.

4. Mayton HS, Olivier C, Vaughn SF, Loria R. Correlation of fungicidal activity of Brassica especies with allyl-isotiocyanate production in macerated leaf tissue. Phytopathology. 1996;86:267-271. URL disponible en: https://www.researchgate.net/publication/43276659_Correlation_of_fungicidal_activity_of_Brassica_species_with_allyl_isothiocyanate_production_in_ macerated_leaf_tissue.

5. Perniola OS, Staltari S, Chorzempa SE, Astiz Gassó MM, Molina M del C. Control biológico de Fusarium graminearum: utilización de Trichoderma spp. y biofumigación con parte aérea de Brassica juncea. Rev Fac Cienc Agrar. 2014;46(2):45-56. URL disponible en: http://revista.fca.uncu.edu.ar/images/stories/pdfs/2014 -02/Cp04_Perniola.pdf.

6. Sacristán G, Reguera JI, López-Robles J, de Aymerich B. Soil microbial population changes in soil biodisinfection process. En: Trasar-Cepeda C et al. editores. Soil enzymology in the recycling of organic wastes and environmental restoration, Environmental science and engineering. Springer-Verlag Berlin Heidelberg; 2012. p. 339-350.

7. Omirou M, Rousidou C, Bekris F, Papadopoulou KK, Menkissoglou-Spiroudi U, Ehaliotis C, et al. The impact of biofumigation and chemical fumigation methods on the structure and function of the soil microbial community. Microbial Ecol. 2011;61(1):201-213.

8. Qiujun W, Yan M, Hao Y, Zhizhou C. Effect of biofumigation and chemical fumigation on soil microbial community structure and control of pepper Phytophthora blight. World J Microb Biot. 2014;30(2):507-518. URL disponible en: https://www.researchgate.net/publication/256291021_Effect_of_biofumigation_and_chemical_fumigation_on_soil_microbial_community_structure_and_control_of_pepper_Phytophthora_blight.

9. Grondona I, Hermosa R, Tejada M, Gomis MD, Mateos PF, Bridge PD et al. Physiological and biochemical characterization of Trichoderma harzianum, a biological control agent against soilborne fungal. Appl Environ Microb. 1997;63(8):3189-3198.

10.Matarese F, Sarrocco S, Gruber S, Seidl-Seiboth V, Vannacci G. Biocontrol of Fusarium head blight: interactions between Trichoderma and mycotoxigenic Fusarium. Microbiology. 2012;158:98-106. URL disponible en: http://mic.sgmjournals.org/content/158/1/98.long.

11.Shovan LR, Bhuiyan KA, Begum JA, Pervez Z. In vitro control of Colletotrichum dematium causing anthracnose of soybean by fungicides, plant extracts and Trichoderma harzianum. Int J Sustain Crop Prod. 2008;3(3):10-17. URL disponible en: http://cidsbd.org/wp-content/uploads/2014/03/10-17.pdf.

12.Stefanova M, Sandoval I, Martínez ML, Heredia I, Ariosa MD, Arévalo R. Control de hongos fitopatógenos del suelo en semilleros de tabaco con Trichoderma harzianum. Fitosanidad. 2004;8(2):35-38. URL disponible en: http://www.redalyc.org/pdf/2091/209117836008.pdf.

13.Bashan Y, de-Bashan LE. Chapter two - How the plant growth-promoting bacterium Azospirillum promotes plant growth - A critical assessment. Adv Agron. 2010;108:77-136.

14.Tortora ML, Díaz-Ricci JC, Pedraza RO. Azospirillum brasilense siderophores with antifungal activity against Colletotrichum acutatum. Arch Microbiol. 2011;193:275-286.

15.Di Barbaro G, González Basso V, Batallán Morales S. Trichoderma sp. y Azospirillum sp., potenciales agentes de biocontrol de fitopatógenos. Artículo de revisión. Biología en Agronomía. 2014;4(1):177-189. URL disponible en: http://www.agrariasvirtual.com.ar/fca/rebea/2014-marzo/15.DiBarbaro.Basso.pdf.

16.Dandurand LM, Mosher RD, Knudsen GR. Combined effects of Brassica napus seed meal and Trichoderma harzianum on two soilborne plant pathogens. Can J Microbiol. 2000;46(11):1051-1057.

17.Salem MF. Innovative approaches through modified biofumigation in controlling soil-borne pathogens and root-knot nematode. Aspects of Applied Biology. 2014;126:77-81.

18.Qiujun W, Yan M, Guangfei W, Zhiguang G, Di S, Xia A, et al. Integration of biofumigation with antagonistic microorganism can control Phytophthora blight of pepper plants by regulating soil bacterial community structure. Eur J Soil Biol. 2014;61:58-67. URL disponible en: https://www.researchgate.net/publication/259994132_Integration_of_biofumigation_with_antagonistic_microorganism_can_control_Phytophthora_blight_of_pepper_plants_by_regulating_soil_bacterial_community_structure.

19.Zhou XG, Liu G, Kloepper JW, Reddy MS. Use of brassica biofumigation cover crop and plant growth promoting rhizobacteria to manage sheath blight of rice. (Abstr.). Phytopathology. 2012;102(Suppl. 4):S4.144. URL disponible en: http://dx.doi.org/10.1094/PHYTO-102-7-S4.1.

20.Zhou XG, Liu G. Efficacy of combined use of brassica biofumigant crop and PGPR strain for managing sheath blight in rice, 2012. Plant Disease Management Reports. 2013;7:FC049.

21.Anders MM, Zhou X, Jia Y, Liu G. Evaluation of brassica cover crop and PGPR strain for suppression of sheath blight of rice in Arkansas, 2012. Plant Disease Management Reports. 2013;7:FC048.

22.Astiz Gassó MM, Pagliocca R, Varaschin C. Comportamiento del formulado biológico Biagro TL en el manejo integrado de enfermedades. En Actas del 2º Congreso Argentino de Fitopatología; 1-3 Junio 2011; Mar del Plata, Argentina. p. 373.

23.Rodríguez Cáceres EA. Improved medium for isolation of Azospirillum spp. Appl Env Microb. 1982;44:990-991.

24.Sanchi S, Odorizzi S, Lazzeri L, Marciano P. Effect of Brassica carinata seed meal treatment on the Trichoderma harzianum T39-Sclerotinia species interaction. Acta Hort. (ISHS). 2005;698:287-292.

25.Galletti S, Sala E, Leoni O, Burzi PL, Cerato C. Trichoderma spp. tolerance to Brassica carinata seed meal for a combined use in biofumigation. Biol Control. 2008;45(3):319-327.

 

 

Recibido: 26-10-2015.
Aceptado: 7-3-2016.

 

 

* Autor para la correspondencia. Omar Salvador Perniola. Correo electrónico: [e-mail]