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INTRODUCCIÓN
Las bacterias fitopatógenas provocan un impacto negativo en los sistemas de producción agrícola, disminuyen los rendimientos y aumentan las pérdidas económicas (1). El género Xanthomonas (Proteobacteria) es un grupo diverso de bacterias Gram negativas que afecta numerosos cultivos (1,2). La enfermedad conocida como Bacteriosis común o Tizón común, ampliamente distribuida en el mundo, es causada por Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli (Smith) Vauterin y Xanthomonas citri subsp. fuscans (Burkholder) Starr & Burkholder (2) y constituye el principal factor biótico que afecta los rendimientos del cultivo de Phaseolus vulgaris (frijol), leguminosa de mayor importancia a nivel mundial, pues causa pérdidas en este cultivo que oscilan entre 10-40 %, en dependencia de la susceptibilidad del cultivar y las condiciones medioambientales (1,2,3).
Por otra parte, estudios anteriores sugieren a algunos tipos de nanopartículas (NP), específicamente las metálicas (NPM), como alternativas prometedoras en diferentes campos de la biotecnología agrícola para la obtención de nuevos agentes antibacterianos (4,5). La síntesis de nanopartículas de plata (NPP), a partir de plantas, constituye una vía de obtención sencilla, rápida y ambientalmente segura (6), en la que se informan numerosas especies de plantas con resultados positivos para este fin (6).
Además, los estudios de gestión y valorización de los residuales, tanto líquidos como sólidos, constituyen una prioridad de numerosos grupos de investigación a nivel global (7), con vistas al aprovechamiento de los mismos en la obtención de productos de alto valor agregado y ayudar a la disminución del impacto ambiental generado por el vertimiento de estos al medio ambiente (7,8).
Específicamente, los procesos de destilación de aceites esenciales, a partir de plantas aromáticas, involucran altos volúmenes residuales de extractos acuosos del material vegetal, los cuales pueden constituir fuentes potenciales de compuestos de valor para diferentes fines (8), entre ellos la síntesis de nanopartículas metálicas.
Thymus vulgaris es una especie botánica de la familia Lamiaceae, muy estudiada por sus propiedades medicinales y culinarias (9,10). El aceite esencial obtenido de esta planta aromática presenta fuerte actividad antimicrobiana frente a bacterias como Klebsiella neumoniae, Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, entre otras (11); y frente a bacterias fitopatógenas como Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum (12,13), Pseudomonas syringae aislada de soya (14), y especies de Xanthomonas como X. euvesicatoria y X. vesicatoria (15,16).
Los objetivos del presente trabajo fueron evaluar el extracto acuoso residual del proceso de hidrodestilación del aceite esencial, a partir de la planta aromática Thymus vulgaris L., como posible fuente de agentes reductores y estabilizantes para la obtención de NPP, así como determinar las potencialidades de estas NP como agente antibacteriano frente a X. phaseoli pv. phaseoli.
MATERIALES Y MÉTODOS
Obtención de las nanopartículas
El extracto acuoso residual se obtuvo del proceso de hidrodestilación (ERH) del aceite esencial de la planta aromática T. vulgaris, extraído del material vegetal fresco (17). Se determinó el contenido de sólidos totales mediante la medición del peso seco en balanza infrarroja (Sartorius MA35) y se conservó en refrigeración (0-4ºC) hasta su evaluación.
Para la síntesis de las NPP se usó la solución de nitrato de plata (4 mM) como agente reductor, que se mezcló con el extracto vegetal (9:1) (18). La solución se homogenizó con un agitador mecánico (IKA-VF2) y se dejó en reposo a temperatura ambiente (27- 30ºC) durante 24 horas.
La reacción de biorreducción se monitoreó mediante observación visual a diferentes tiempos (5 minutos, 1 hora y 24 horas). La ocurrencia de un cambio brusco de coloración (solución de ion metálico + extracto del material vegetal), indicativa de la formación de la suspensión coloidal de las partículas de interés, se confirmó mediante el análisis espectral UV-Vis en el rango 200-800 nm, en un espectrofotómetro (RAY Light UV- 2601), a las 24 horas de iniciada la reacción, determinándose la longitud de onda de máxima absorción (19). La solución de las nanopartículas se conservó a temperatura ambiente hasta su evaluación.
Evaluación de la actividad antimicrobiana
La actividad antibacteriana de las NPP, sobre X. phaseoli pv. phaseoli, se evaluó mediante el método de difusión en agar en pocillos de 5 mm (20). Se preparó un inóculo a la concentración de 7 x 108 UFC. ml-1, en solución de cloruro de sodio (0,9 %), a partir de un cultivo de 24 horas de incubación a la temperatura de 28ºC en placas de agar nutriente, según la escala de McFarland. La cepa utilizada fue la Xap1, perteneciente al cepario del Laboratorio de Bacteriología Vegetal del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), Cuba (1).
Se aplicaron, en cada pocillo, 100 µl de la solución de NPP y de los controles positivos y negativos. Como controles positivos se emplearon el sulfato de estreptomicina AppliChem (1 mg.ml-1), el sulfato de cobre (II) Merck (1 mg. ml -1) y un plaguicida comercial a base de cobre (PC Cu) (1 mg. ml -1). Como control negativo se utilizó agua estéril. Se realizaron, como mínimo, cuatro réplicas del tratamiento y de los controles. Las placas se incubaron a 28ºC durante 24 horas. Transcurrido este tiempo se midieron, con regla graduada, los halos de inhibición del crecimiento bacteriano.
Los datos obtenidos se procesaron estadísticamente mediante un análisis de varianza simple y las medias se compararon mediante la prueba de comparación de rangos múltiples de Duncan, con un nivel de significación del 5 %, usando el paquete estadístico InfoStat/L (Versión 2016).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La reacción de biorreducción entre los cationes Ag+ y los compuestos fitoquímicos presentes en el extracto ocurrió instantáneamente (antes de los cinco minutos), evidenciada por la presencia de un complejo coloreado marrón oscuro (Fig. 1), indicativo de la formación de las nanopartículas (4,6,18,19). El espectro UV-Vis mostró una longitud de onda máxima entre 460 y 480 nm, lo que coincide con los resultados informados por otros autores, acerca de la síntesis de NPP a partir de T. vulgaris (21).
FIGURA 1 Identificación de la formación de las nanopartículas de plata a partir de Thymus vulgaris (Tv): visual (A) y espectrofotométrica (B). a: reacción positiva del Extracto Residual Hidrodestilación (ERH): solución de plata 4 mM (1:9); b: Reacción negativa del ERH: agua destilada (1:9); c: solución de plata 4 mM: agua destilada (9:1); d: agua destilada. / Identification of the formation of silver nanoparticles from Thymus vulgaris (Tv): visual (A) and spectrophotometric (B). a: positive reaction of Hydro-distillation Residual Extract (HRE): silver solution 4 mM (1:9); b: negative reaction of HRE: distilled water (1:9); c: silver solution 4 mM: distilled water (9:1); d: distilled water.
Los estudios sobre la composición química del aceite esencial y extractos de las hojas de T. vulgaris coinciden en la presencia del p-cymeno (8,41 %), γ-terpineno (30,90 %) y timol (47,59 %), entre sus componentes principales (11). También se informó otro monoterpeno, el carvacrol (22), así como otros compuestos polifenólicos, como los ácidos rosmarínico y vanílico (22,23). La presencia de estos compuestos en el ERH pudiera aportar los grupos funcionales para la formación de las NNP.
En los últimos años, se amplió el estudio de T. vulgaris para la síntesis ecológica de NPM, como fuentes de agentes reductores y estabilizantes para diferentes fines. Se obtuvieron nanopartículas de óxido de cobre (NP- OCu) de esta fuente y se evaluaron como catalizador químico con buenos resultados (24). Otros estudios informaron la síntesis de NPP y sus propiedades antimicrobianas (25).
Los resultados obtenidos con el ERH confirman la posibilidad de obtención de NPP a partir de los compuestos presentes en este residual de tomillo, mediante un método simple, con el uso de precursores naturales y baratos, y bajo condiciones respetuosas con el medio ambiente.
Las NPP evidenciaron actividad antimicrobiana frente a la bacteria fitopatógena X. phaseoli pv. phaseoli (Fig. 2), similar a la actividad de la plata iónica (AgNO3). Los extractos acuosos residuales no inhibieron el crecimiento del microorganismo. Por otra parte, las actividades antimicrobianas de las formas de cobre evaluadas mostraron halos de inhibición difusos e inferiores a las formas de plata estudiadas. (Tabla 1)
FIGURA 2 Actividad antimicrobiana de nanopartículas de plata obtenidas de Thymus vulgaris frente a Xanthomonas phaseolipv phaseoli. ERH: Extracto Residual Hidrodestilación; NPAg: nanopartículas de plata; ERHD: Extracto Residual Hidrodestilación: agua (1:9); AgNO3: Nitrato de plata 4 mM: agua (9:1); CuSO4: sulfato de cobre (II) (100 µg); St: sulfato de estreptomicina (100 µg); PC Cu: plaguicida comercial de cobre (100 µg)./ Antimicrobial activity of silver nanoparticles obtained from Thymus vulgaris against Xanthomonas phaseoli pv phaseoli. ERH: Hydro-distillation Residual Extract; NPAg: Silver nanoparticles; ERHD: Hydro-distillation Residual Extract: water (1:9); AgNO 3 : Silver nitrate 4 mM: water (9:1); CuSO 4 : Copper sulphate (II) (100 µg); St: Streptomycin sulphate (100 µg); PC Cu: Commercial copper-based pesticide (100 µg).
TABLA 1 Actividad antimicrobiana de las NPP obtenidas a partir del extracto residual de la destilación del aceite esencial de Tymus vulgaris sobre Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli. / Antimicrobial activity of SNP obtained from hydro-distillation residual extract of the essential oil of Tymus vulgaris against Xanthomonas phaseoli pv. phaseoli.
| Muestra | N |
Halo de inhibición (mm) a las 24 h (Media ± DS) |
|---|---|---|
| Ag+ | 11 | 15,55 ± 0,93 b |
| NPP | 11 | 14,91 ± 1,04 b |
| ERH | 6 | NI |
| ERHD | 6 | NI |
| Cu2+ p.a | 5 | 7,80 ± 0,84 d |
| Cu2+ comercial | 4 | 10,00 ± 2,83 c |
| Agua | 6 | NI |
| St | 6 | 21,17 ± 1,60 a |
Media ± DS: Desviación estándar de la media; NI: No inhibición; N: número de réplicas de cada tratamiento; AgNO3: Solución de nitrato de plata 4 mM: agua (9:1); NPP: Nanopartículas de plata; ERH: Extracto Residual de Hidrodestilación; ERHD: Extracto Residual de Hidrodestilación diluido (ERH: agua 1:9); Cu 2+ p.a: solución de sulfato de cobre (II) calidad puro para análisis (1mg/ mL); Cu 2+ comercial: solución de bioplaguicida comercial de cobre (1 mg/ mL); .St: sulfato de estreptomicina (1 mg/ mL).
Numerosos estudios demostraron que el principal impacto biológico de las NPP ocurre a nivel celular, de ahí la actividad antibacteriana demostrada. Diversos autores apuntan hacia la función del metal en esta actividad (26,27), debido a que la liberación de los cationes metálicos posibilita la interacción con los grupos tiol de muchas enzimas vitales y las inactiva. De hecho, el uso de compuestos metálicos como agente antimicrobiano, específicamente la plata, se remonta a miles de años (28). Sin embargo, aunque la plata se considera un agente antibacteriano con un modo de acción conocido, e incluso los mecanismos de resistencia a este elemento están descritos (29,30), con la nanotecnología, la estructura química y las propiedades físicas de la plata se modifican, lo que puede aumentar su potencial antibacteriano (30,31).
Otros estudios demostraron que las propiedades fisicoquímicas de las NPP y su interacción con las células vivas difieren sustancialmente de las de los iones de plata (31). Además, la variedad de las formas y características de varias NPP son responsables de las diferencias en el modo de acción y probablemente en el mecanismo bacteriano de resistencia (30,31).
Recientemente se informó la actividad antimicrobiana de NPP sintetizadas a partir de caldo de algas rojas (Hypnea musciformis) sobre Xanthomonas campestris. En este caso, la actividad antimicrobiana fue dependiente de la concentración; alcanzó la mejor actividad a 150 µg/ ml (17 ± 0,33 mm) (6). Similares resultados se informaron con NP de cobre obtenidas a partir de Ocimum sanctum frente a Xanthomonas axonopodis pv. punicae (17,25 ± 0,95 mm) (5).
A diferencia de las NPM obtenidas por métodos físicos y químicos, en el caso de las NPM que se logran a partir de plantas, es necesario esclarecer la función de los compuestos fitoquímicos presentes. Los informes recientes demostraron la contribución de los componentes del material vegetal de partida y queda esclarecido que este es fundamental y determina las características físicas y químicas de las NPM obtenidas, y se observan comportamientos biológicos diferentes al variar el extracto vegetal inicial (32). Diferentes condiciones de la síntesis de las NPM, a partir de una misma planta, conllevan a diferente composición de compuestos y, por consiguiente, variación en la actividad antimicrobiana (33).
Actualmente es un tema muy debatido el/ los mecanismo(s) que emplean estas NPM para causar efecto antimicrobiano y, aunque en el caso de las bacterias fitopatógenas estos estudios recién inician, de forma general se conocen varias teorías que explican el modo de acción de las NPM sobre las células bacterianas, tanto a nivel de la membrana celular, de la cadena respiratoria, o mediante la afectación de rutas metabólicas y activación de los mecanismos oxidativos, así como la modulación de la señalización celular (29,30,31).
CONCLUSIONES
El extracto residual de la hidrodestilación del aceite esencial de Thymus vulgaris es promisorio para la síntesis verde de las NPP, lo cual contribuye con el desarrollo de procesos limpios y seguros para el medio ambiente. Las NPP obtenidas demostraron actividad antimicrobiana similar a otra forma iónica de plata y superior a las formas de cobre evaluadas, lo que sugiere la necesidad de continuar los estudios de optimización de la tecnología, la caracterización físico-química y del modo de acción, así como las evaluaciones biológicas que posibiliten el aprovechamiento de este tipo de residual.
