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INTRODUCCIÓN
La desmedida utilización de los insecticidas químicos constituye uno de los mayores problemas actuales de la agricultura, pues afecta, a largo y mediano plazos, la salud del hombre, los ecosistemas (1) y conlleva a la aparición de poblaciones de plagas resistentes al control (2). El control biológico, con el uso de ácaros, virus, bacterias, hongos y nematodos entomopatógenos (3), representa una opción para el manejo de plagas de forma segura, pues no afectan las plantas y vertebrados, y su aplicación en el campo no presenta toxicidad aguda o crónica para los humanos (4).
Los nematodos de las familias Steinernematidae y Heterorhabditidae son muy utilizados como agentes de control biológico (5). Ambas familias son parásitos obligados de insectos y matan rápidamente a sus hospedantes (6), incluyendo insectos que habitan en zonas protegidas como criptas y túneles (4). Estos nematodos poseen diversos atributos como agentes de control biológico, ya que son seguros para el hombre y, por lo general, seguros para organismos no dianas y el ambiente; además, por su relativa fácil producción y aplicación, amplia gama de hospedantes y capacidad de búsqueda (7).
Desarrollar productos, cuyo ingrediente activo sean especies/cepas de nematodos entomopatógenos eficientes en el control de plagas, requiere de estudios diversos que incluyan factores abióticos que afecten la eficacia de las formulaciones. Factores como la temperatura, humedad, pH, radiaciones UV y el tipo de suelo afectan la actividad biorreguladora de los nematodos entomopatógenos en dependencia de la especie/cepa, por lo que resulta necesario estudiar cada población para determinar los parámetros óptimos para su desempeño como controles biológicos (8).
En el año 2005, Chen y Glazer (9) refirieron que la viabilidad de los nematodos depende, en parte, de la cantidad de agua contenida dentro y alrededor de sus cuerpos, y que las altas temperaturas intervienen directamente sobre este punto, representando factores con alta influencia sobre los procesos fisiológicos y comportamental de los nematodos (10), constituyen los rangos extremos (<1; >35°C) letales en la mayoría de los casos (11), al igual que los valores de pH por encima de diez; sin embargo, refieren que entre 4-8 no corren el riesgo de provocarles daño (12). Estos factores pueden no ocasionar la muerte de los nematodos, pero sí afectar su movilidad e infectividad, lo que tendría un impacto en su actividad biorreguladora.
La especie Heterorhabditis amazonensis Andaló et al. (13) cepa HC1 se produce masivamente en más de dos decenas de laboratorios en Cuba y se utiliza para el manejo de diversas plagas en cultivos como col de repollo (Brassica oleracea capitata B.), tabaco (Nicotiana tabacum L.) y boniato (Ipomoea batatas Lam.) y, en menor medida, en cafeto (Coffea spp.), cítricos (Citrus spp.) y maíz (Zea mays L.), entre otros (14). Sin embargo, resultan escasas las investigaciones sobre el efecto de factores abióticos sobre esta cepa.
Por ello, el objetivo de este estudio fue determinar la influencia de factores abióticos sobre la viabilidad e infectividad de H. amazonensis cepa HC1.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los estudios se realizaron en el Laboratorio de Nematología Agrícola del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA) (23º N; 82º O), Cuba, entre octubre y diciembre de 2017 y entre abril y julio de 2018.
Se utilizaron juveniles infectivos (JI) de la cepa HC1 de H. amazonensis (GenBank: BankIt1899363 Hamaz_HC1 KU870321), obtenidos en el Laboratorio de Nematología Agrícola (CENSA), utilizando el método de reproducción in vivo sobre Galleria mellonella (L.) (Lepidoptera: Pyralidae) descrito por Dutky et al. (15), con modificaciones de Sánchez et al. (16) y utilizando los sustratos sugeridos por Enrique et al. (17).
Para todos los ensayos se emplearon JI recién emergidos, luego de las actividades iniciales para el “refrescamiento” de la cepa (16) y provenientes de cadáveres que presentaron la coloración que sugiere que la cepa está en buenas condiciones (14). Los JI se recolectaron utilizando Trampa White (18) modificada y presentaron 100 % de viabilidad.
Para los ensayos que lo requirieron, se utilizaron larvas del último instar de G. mellonella, obtenidas en el laboratorio (16,17). Para cada prueba, se pesaron las larvas de G. mellonella en balanza digital (Kern JKL®) y se utilizaron las que tuvieran ≥ 200 mg.
Para obtener las concentraciones de nematodos establecidas para cada ensayo, se utilizó el método descrito por Glazer y Lewis (19). Los tres ensayos siguieron diseños completamente aleatorizados.
Efecto del agua de diferentes características en la viabilidad de la cepa HC1 de H. amazonensis
Se evaluó el efecto del agua de diferentes características (agua potable, hervida, destilada y desionizada) sobre la viabilidad de los JI. El agua destilada se obtuvo en el laboratorio, tratando agua potable, por un destilador GFL (Gesellschaft für labortechnik, Alemania) para todos los ensayos. El agua desionizada fue suministrada por el Centro de Biopreparados (BIOCEN). El agua hervida se obtuvo sometiendo a calor con un horno de microondas (PANASONIC invertir 1200W, USA) por 10 minutos y el agua potable del pozo situado en el centro.
Cada tratamiento (combinación de agua de diferentes características y concentración de JI) consistió en tres placas Petri de 15 cm de diámetro (réplicas) donde se añadieron 100 ml de cada tipo de agua y se utilizaron dos concentraciones de JI: 5x104 y 105 JI por placa.
A cada tipo de agua se le determinó pH y conductividad eléctrica, utilizando un pH-conductímetro LPt 100 Meter Toledo® y se comprobó que cumplían los estándares establecidos en normas cubanas e internacionales (20,21,22). (Tabla 1)
Tabla 1 Valores promedios de pH y conductividad eléctrica de los tipos de aguas utilizadas en el estudio del efecto de estas sobre la viabilidad de los JI de H. amazonensis cepa HC1 y su comparación con sus correspondientes rangos establecidos en las normas cubana e internacionales / Table 1. Average pH values and electrical conductivity of the water types used in the study of their effect on viability of the IJ of H. amazonensis strain HC1 and their comparison with the corresponding ranges established in Cuban and international standards
Las placas se mantuvieron en el laboratorio (T=22±1°C) durante 49 días y las evaluaciones se realizaron cada siete días, momento en que se evaluaron el pH y conductividad del agua. En cada evaluación se determinó el número de JI vivos en cada tratamiento; para ello se colectó el agua de cada placa (réplica) en probetas de 100 ml, se homogenizó, se tomaron 5 ml con una pipeta y se trasvasaron a probetas de 50 ml que se completó a su volumen total con cada tipo agua. De esa suspensión final se tomó 1 ml y se vertió en una placa contadora de PVC de paredes verticales para contabilizar el total de JI vivos, utilizando un microscopio estereoscópico Zeiss STEMI DV 4® a 25 aumentos.
Antes de cada evaluación, se constató el olor y color del agua; así como la aparición de contaminantes y la formación, por parte de los JI, de acumulaciones semejantes a pequeñas rosetas, relacionadas con el fenómeno de agregación descrito por Ishibashi y Kondo (23).
Análisis estadístico
Los tratamientos se evaluaron semanalmente durante 49 días, determinando el número de JI vivos y se presentan, en este trabajo, los resultados de la viabilidad a los 7 y 35 días. Se probó la normalidad de la variable viabilidad mediante la prueba de Shapiro-Wilks y la homogeneidad de varianza por la prueba F. Se compararon los datos mediante un análisis de varianza bifactorial y prueba de rangos múltiples de Duncan para un nivel de significación de 95 %. Se empleó el paquete estadístico InfoStat versión 2016.
A partir de los resultados en este ensayo, se seleccionó el tipo de agua que se utilizó en los experimentos posteriores de pH y temperatura.
Efecto del pH y la temperatura sobre la viabilidad y patogenicidad de H. amazonensis cepa HC1
Para cada ensayo se utilizaron placas plásticas de 24 celdas (marca Costar®), una placa por tratamiento (tres pH y tres temperaturas). Las celdas de las placas plásticas se enrasaron con 2 ml de las soluciones de pH (para estudio de pH) o de agua destilada (ensayo de temperatura) y se colocaron diez JI en cada pocillo. Los JI se extrajeron de las suspensiones de nematodos utilizando un pelo o selector y con el auxilio de un estereomicroscopio Zeiss STEMI DV 4® a 25 aumentos.
Ensayo de pH
Utilizando agua destilada, se prepararon soluciones con diferente pH 5; 7 y 9, mediante el uso de HCl (0,1 mol/L) y NaOH (0,01 mol/L). Para preparar las soluciones se utilizaron una balanza digital Kern JKL®, un pHmetro Sevencompact® 5220 Meter Toledo y un agitador magnético IKA C-MAG MS7®. Las soluciones se mantuvieron a 22±1°C hasta su uso.
En cada evaluación se determinó el pH y se comparó con las soluciones antes preparadas (soluciones reservadas en recipientes de vidrio, tapadas y mantenidas en oscuridad a 22±1°C), para conocer si existía modificación del pH por parte de los JI; además, se tomó la temperatura diariamente.
Ensayo de temperatura
En este ensayo, los JI se colocaron en agua destilada (pH 7,4; Conductividad: 0,3 μS/cm) y se evaluaron tres temperaturas, 22±1°C (en cuarto climatizado), 25±2°C (condiciones de laboratorio con temperatura ambiente) y 27°C (en incubadora FRIOCELL®).
Efecto sobre la viabilidad
En ambos ensayos, las evaluaciones se realizaron cada siete días hasta completar los 42 días. Se observó la viabilidad de 40 JI al evaluar cuatro pocillos por semana en cada tratamiento; para ello se tuvieron en cuenta su movilidad, la adherencia de partículas extrañas en sus cuerpos, así como la traslucidez o no de la parte terminal de sus cuerpos, como signo de sus reservas lipídicas (16,24).
Los JI vivos se extraían de los pocillos y se mantenían en una placa, para luego evaluar su infectividad.
Efecto sobre la infectividad
Para la evaluación de la infectividad de los JI se utilizó el ensayo de infectividad uno en uno (19) sobre papel de filtro, con la modificación relacionada con la extracción de un JI y su colocación sobre la larva. Se utilizaron placas de 24 celdas (marca Costar®) y se colocaron pequeños discos de papel de filtro (Whatman No.GB/T1914-2007, Ø 15 cm) humedecidos con 30 μl de agua destilada, utilizando una pipeta TopPette Single Channel Pipettor vol. 0,5-10 μl.
De los 40 JI evaluados anteriormente en la prueba de viabilidad, se tomaban 10 JI por cada ensayo de pH y temperatura y se procedió de la siguiente forma: dentro de cada celda se dispuso una larva de G. mellonella, previamente inmovilizada a temperaturas entre -8 a -5°C durante tres a cinco minutos. Transcurrido este tiempo, se extraía un JI de la suspensión formada de los cuatro pocillos, con un pelo o selector, y se colocaba encima de la larva. Esta operación se repitió con los nueve JI restantes. Para evitar la salida de las larvas, se cubrieron los pocillos con discos de mallas de 300 μm y se incubaron a 27°C en oscuridad; el porcentaje de mortalidad se registró a las 72 h. Igualmente, se observó si los cadáveres de G. mellonella presentaron la coloración marrón oscura a las 72 h, descrita para la cepa evaluada (14).
Las larvas parasitadas se aislaron y se almacenaron de 5-10 días a 26±2°C (temperatura tomada dos veces al día con un termómetro analógico FISONS) en placas Petri, forradas internamente con una capa de papel de filtro (Whatman No.GB/T1914-2007, Ø 15 cm), humedecidas con 1 ml de agua destilada. Posteriormente, las larvas almacenadas se les realizó una pequeña disección bajo un estereomicroscopio (Zeiss®Stemi, DV4) con ayuda de una aguja y una espátula entomológica y se comprobó la presencia de nematodos entomopatógenos en varios estadios, como indicador de patogenicidad (25).
Análisis Estadístico
Se realizaron tres réplicas de cada ensayo. Se seleccionaron los mejores valores de pH y temperatura en cuanto a viabilidad y patogenicidad mediante la prueba de Wald por corrección por continuidad, del software CompaProWin 2.0 (26).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto del agua de diferentes características en la viabilidad de la cepa HC1 de H. amazonensis
En cuanto a porcentaje de vivos, se originaron diferencias significativas entre los tratamientos (diferentes características de agua), con ambas concentraciones de JI, a los siete y 35 días. (Fig. 1)
A los siete días, los mayores resultados de supervivencia se obtuvieron con agua destilada y hervida a la concentración de 5x104 JI por placa, con valores por encima de 90 % de viabilidad, seguido del agua potable con 82,1 %; no así en agua desionizada con un resultado de 67,6 %. Estos rangos de viabilidad se mantuvieron a los 35 días de haberse establecido el ensayo.
Por otro lado, al aumentar la concentración de JI a 105 en 100 ml en los tratamientos de agua destilada, hervida y potable, se observó una disminución significativa del porcentaje de vivos con respecto a la concentración anterior.
Fig. 1 Viabilidad (%) de los juveniles infectivos (JI) de H. amazonensis cepa HC1 mantenidos por 35 días en agua de diferentes características, utilizando dos concentraciones de JI en placas Petri (5x104JI y 1x105JI) (p<0,05) / Viability (%) of infectives juveniles (IJ) of H. amazonensis strain HC1 maintained in water with different characteristics for 35 days; two concentrations of IJ in Petri dishes (5x104 JI y 1x105 JI) were used (p<0.05)
Los resultados de este estudio coinciden con los obtenidos por Sánchez (30) al comparar la viabilidad de los JI de esta cepa cuando se mantenían en aguas destilada y potable. Estas se usaron como soportes líquidos de formulados en bolsa de polietileno transparente y fragmentos de esponjas de poliéster-poliuretano para su almacenamiento; el agua idónea fue la destilada. Se produjo menor proliferación de contaminantes y fue mayor el periodo en que los JI se mantuvieron con altos porcentajes de viabilidad entre 45 y 60 días. El agua hervida, donde se produjo menor cantidad de contaminantes que en el agua potable, exhibió mayores porcentajes de viabilidad de JI.
Las características organolépticas se mantuvieron en todos los tipos de agua durante los primeros días; sin embargo, se produjo fetidez con la aparición de contaminantes en el agua potable en las últimas dos semanas. Por otro lado, la formación de agregados de JI que se observó en todos los tratamientos disminuyó gradualmente al pasar de los días.
Según Ishibashi y Kondo (23), la agregación ocurre, comúnmente, en muchas especies de nematodos entomopatógenos y es un comportamiento que puede ser conducido por sensibilidad mecánica o táctil; este posee valor en la supervivencia de los JI contra la desecación o la luz solar. Es un fenómeno frecuentemente observado en los estudios de laboratorios.
La mortalidad de los JI en agua “potable” podría estar relacionada con el aumento que se produjo de organismos contaminantes en las suspensiones de JI, los que pudieran haber competido por el oxígeno con estos últimos.
El oxígeno es esencial para la supervivencia de los nematodos entomopatógenos (27). Se pudo comprobar en diversos estudios donde, previo a ensayos de formulación, los JI se mantuvieron en laboratorios en suspensiones acuosas en refrigeración entre 6 y 12 meses donde recibieron aireación (28). El oxígeno constituye también un factor limitante para los JI en diferentes tipos y condiciones de suelos (27). Otra causa de la mortalidad de JI en las suspensiones de agua potable podría estar relacionada con el hecho de que los contaminantes excretaran al medio productos de su metabolismo, que pueden ser tóxicos a los JI y provocarles la muerte.
Sánchez (16) sugirió utilizar agua hervida para lograr la limpieza de soluciones de nematodos cuando no se posea agua destilada en los laboratorios. Sin embargo, para la formulación de nematodos entomopatógenos en esponjas siempre se debe elegir el agua destilada, como medio eficiente para ofrecer la humedad requerida para la supervivencia, dispersión y acción de los nematodos en general (27,30).
Efecto del pH y la temperatura sobre la viabilidad y patogenicidad de la cepa HC1 Heterorhabditis amazonensis
Tanto a los siete días como a los 42, los mayores valores de viabilidad e infectividad de los JI de H. amazonensis cepa HC1 se obtuvieron a pH 5 y 7; mientras que, los mayores valores de mortalidad en larvas de último instar de G. mellonella, se obtuvieron con JI que se mantuvieron en soluciones de pH=7. El pH= 9 afectó a los JI desde los siete y hasta los 42 días, donde murieron más del 50 % de los JI. (Fig. 2)
Fig. 2 Valores de viabilidad de JI y mortalidad de G. mellonella (en el ensayo de infectividad uno en uno) mantenidos en soluciones de pH 5,7 y 9 (p< 0,05) / Fig. 2 Viability and mortality values of G. mellonella in the one-on-one trial at pH 5,7, and 9 (p< 0.05).
A los 42 días los valores más bajos de viabilidad se produjeron en pH 9, lo que ratifica lo planteado por Kung et al. (31), quienes señalaron que un rango de pH entre 4-8 aseguraba la sobrevivencia de los nematodos. Según Strauch et al. (32), pH bajos inhiben el crecimiento bacteriano y fúngico; sin embargo, valores de pH por debajo de 3 tienen un efecto negativo sobre H. bacteriophora y H. indica.
Fig. 3 Viabilidad de JI de H. amazonenesis cepa HC1 e infectividad (conocida a través de los valores de mortalidad de G. mellonella del ensayo de infectividad uno en uno), cuando los JI se mantuvieron en tres temperaturas (p<0,05) / Fig. 3 Viability of IJ of H. amazonenesis strain HC1 and mortality values of G. mellonella in the one-on-one trial at 22±1, 25±2 and 27ºC.
A los 42 días los JI mostraron sus cuerpos transparentes con solo algunas pequeñas zonas oscurecidas, relacionadas con sus reservas de lípidos. Un estudio realizado por Patel et al. (33) indicó que dos especies de Steinernema agotaron sus reservas de lípidos entre 44 y 47 días, lo que comprobaron utilizando una tinción con aceite Rojo O, que les permitió proponer una escala o índice de lípidos de ocho puntos. Esa escala no se aplicó en este estudio, pero se constató que los JI estaban traslúcidos al término de 42 días, con la observación de los JI al microscopio estereoscópico.
La temperatura afectó más la viabilidad de los JI (Fig. 3) que el pH, pues la cepa no alcanzó 100 % de viabilidad en los tres valores evaluados, como ocurrió en pH 7; adicionalmente, la infectividad sobre G. mellonella evidenció valores menores. La T podría afectar las reservas de lípidos y, por tanto, aumentar la mortalidad de JI y disminuir su infectividad. Al respecto, señalaron Grewal et al. (34) que los rangos de temperaturas del nicho termal de los NEP fueron para el movimiento (4-40°C), penetración del hospedante (5-39°C), muerte del hospedante (8-39°C) y reproducción (10-35°C).
Este estudio evidenció que H. amazonensis cepa HC1 puede ser almacenada en formulaciones acuosas, en bandejas y esponjas, utilizando agua destilada con pH neutro y a temperaturas frescas de unos 22±1°C. Estos elementos resultan importantes en los estudios de formulación que se desarrollan en el grupo de trabajo de Nematología Agrícola del Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), donde se pretende obtener formulaciones comerciales que tengan como ingrediente activo esta cepa de nematodos entomopatógenos.
