Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana Facultad de Medicina “Dr. Salvador Allende”

Evaluación tóxica y genotóxica del extracto fluido de Piper auritum H.B.K.

Dra. Neylim Blanco Hernández,¹ Lic. Alberto Ramos Ruiz² y Lic. Ángel Vizoso Parra²

RESUMEN

Se evaluó la toxicidad aguda del extracto fluido de Piper auritum H.B.K. así como su actividad genotóxica a través de dos sistemas de ensayo a corto plazo, uno in vitro empleando la cepa D-30 de Aspergillus nidulans y otro in vivo, el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón. Los resultados permiten concluir que el extracto fluido de P. auritum H.B.K. mostró muy baja toxicidad aguda y resultó genotóxico in vitro pero no in vivo .

Palabras clave: Piper auritum H.B.K, caisimón de anís, Aspergillus nidulans, ensayo de micronúcleos, toxicidad aguda, genotoxicidad.

Los medicamentos naturales derivados de las plantas tienen un uso milenario. A partir de la segunda mitad del siglo XIX la fitoterapia comenzó a ser desplazada progresivamente por los medicamentos sintéticos, pero en tiempos recientes se observa un renacimiento mundial del interés por ellas. Un número creciente de personas recurren a sus propiedades curativas basándose en su uso tradicional.¹ No obstante, ciertas plantas medicinales no han mostrado las propiedades que les atribuye la medicina popular, e incluso han resultado peligrosas.² Esto señala la importancia de la evaluación farmacológica y toxicológica de diferentes especies, tanto para comprobar los efectos descritos en la literatura, en nuestras condiciones, como para encontrar nuevas especies con propiedades curativas y un mínimo de efectos tóxicos para el hombre. P. auritum H.B.K. perteneciente a la familia Piperaceae es un arbusto de hojas aovado-elípticas, profundamente acorazonadas, las cuales miden 32 cm de largo y 16 cm de ancho. Presenta espigas delgadas de 16 cm de longitud y fruto pequeño y subgloboso.³ Es una planta originaria de México muy extendida en Cuba donde se le conoce como caisimón de anís o anisillo.⁴ Sus hojas se usan como “emoliente” y para aliviar el dolor de cabeza. Su zumo es usado, tópicamente o por vía oral, como antídoto en las mordeduras de serpientes en Costa Rica. Se le atribuyen propiedades “diaforéticas”, estimulantes y ha sido empleada en el tratamiento de anginas, erisipelas, fiebres, gota y reumatismo.^3,4 Toda la planta es rica en alcaloides,⁵ su aceite esencial contiene una fracción oxigenada como componente mayoritario, la cual es rica en safrol, ß -linalol, cineol y acetato de terpineol, así como una fracción hidrocarbonada con un alto contenido de sesquiterpenos⁶ (Apecechea Coffigng MR, Quert Alvarez R, Pérez Castillo G. Cromatografía y constantes físico-químicas del aceite esencial del Piper auritum con fines terapéuticos. ISMM “Luis Díaz Soto”. Habana, Cuba. 1993). Ha sido extensamente estudiada y comprobada la actividad antibacteriana de diferentes extractos de la planta⁷ y se demostró actividad antifúngica frente a Candida albicans y Cladiosporium cucumerinum de extractos crudos de P. auritum H.B.K.⁸ Se reportó un estudio de toxicidad aguda de un extracto acuoso que arrojó baja toxicidad,9 también se realizó la evaluación genotóxica de un extracto acuoso de hojas de la planta a través de los ensayos de A. nidulans y de micronúcleos en médula ósea de ratón, los cuales resultaron negativos.10 Teniendo en cuenta la amplia utilización de la planta por la población de nuestro país, la cual se sirve de las propiedades que se le atribuyen tradicionalmente, algunas de las cuales han sido comprobadas de forma experimental y que se cuenta con escasa información acerca de sus efectos tóxicos, nos propusimos evaluar la toxicidad aguda del extracto fluido de P. auritum H.B.K., empleando el modelo clásico de determinación de LD₅₀ en roedores, así como comprobar si resulta genotóxico en los ensayos de segregación mitótica en A. nidulans y de micronúcleos en médula ósea de ratón.

MÉTODOS

Material vegetal y elaboración del extracto P. auritum H.B.K. se cultivó en la Estación Experimental de Plantas Medicinales “Dr. Juan Tomás Roig”, una muestra clasificada se encuentra en dicha institución con número de herbario ROIG 4519. Con sus hojas se preparó un extracto fluido al 45 % en la Empresa Farmacéutica LABIOFAM, Ciudad Habana según la norma ramal vigente. (de la Torre RA, Martínez MJ, Fernández MR, Morejón Z, Machín M, Peña P, et al. Evaluación toxicológica y genotóxica de un extracto acuoso de hojas de Piper auritum H.B.K. (caisimón de anís). Informe de resultados de investigación. Lab Cent Farm, ISCM “Salvador Allende”: 1993). Este extracto contenía 34,99 % de etanol, 9,7 % de sólidos totales y 0,085 % de aceite esencial; su pH fue de 6,5, su densidad relativa era de 1,002 y su índice de refracción fue 1,3630. Estudio de toxicidad aguda (determinación de LD50) Se emplearon ratones de la línea OF1 procedentes del Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Los animales recibieron dieta consistente en pienso peletizado “Ratonina” y agua ad libitum. Al comenzar el ensayo los animales tenían un peso promedio de 28,5 ± 2,6g. Se establecieron 6 grupos de 10 animales cada uno (5 de cada sexo): centinelas (no tratados), un control negativo (etanol 35 %) y 4 dosis: 1,649, 1,236, 0,824 y 0,412g de sólidos totales/kg de peso corporal, las cuales fueron administradas en forma única por la vía oral (p.o). Los animales fueron observados durante los 14 días posteriores a la administración del extracto, se pesaron antes del tratamiento, a los 7 días y al final del mismo. Transcurridos 15 días se tomaron al azar 2 animales de cada grupo, una hembra y un macho, a los cuales se les realizó una laparotomía para la observación macroscópica y estudio histológico de los diferentes órganos.

Estudios de genotoxicidad Ensayo de segregación mitótica en A. nidulans. Se empleó la cepa diploide D-30 (14), obtenida de los haploides A593 y A594 procedentes del Fungal Genetics Stock Center (FGSC) en Atlanta, USA. La cepa se conservó en Medio Mínimo a 4 ºC. En el experimento se empleó Medio Completo (MC) según lo descrito al respecto.¹¹ Para determinar el rango de concentraciones a probar realizamos un ensayo piloto de toxicidad. Seleccionamos 7 concentraciones (0,097, 0,291, 0.485, 0,679, 1,455 y 1,940 mg/ml de MC). Se prepararon grupos de 14 placas de MC con las concentraciones elegidas, un control de frecuencia espontánea, un control negativo (solvente) y un control positivo (metil metano sulfonato 2,4 mM). Se inocularon las placas con conidios de la cepa en punto al centro y se incubaron a 37 ºC entre 6 y 10 días hasta que la colonia cubriera totalmente la placa.¹¹ A las 72 horas de la siembra se evaluó la toxicidad cuantitativa, que se expresa como el % de reducción del crecimiento lineal de la colonia respecto al control negativo. La toxicidad cuantitativa se clasificó de acuerdo al criterio de Kappas, que plantea que un índice de toxicidad menor de 15 % señala una baja toxicidad, mientras que índices entre 16 y 30 % y mayores de 30 % apuntan hacia toxicidades media y alta respectivamente.¹² Concluido el tiempo de incubación se evaluó la genotoxicidad en términos de la frecuencia de sectores aparecidos en cada colonia y observados para cada concentración.¹³ Se determinó el Índice de Segregación Mitótica Inducida (ISMI), definido como la razón entre la frecuencia (promedio) de sectores por colonia (FSC) para cada una de las concentraciones ensayadas respecto a la obtenida para el control negativo. El experimento se realizó 2 veces. Ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón Se establecieron 6 grupos de 10 animales cada uno (5 de cada sexo), seleccionados al azar: control negativo (solvente), control positivo (ciclofosfamida), control de frecuencia espontánea (no tratados) y 3 grupos tratados con dosis de 1,649, 0,824 y 0,412 g/kg en un volumen de 17 ml/kg por vía oral. Al control negativo se le administró etanol al 35 % en igual volumen. El esquema de tratamiento consistió en dos administraciones separadas por un intervalo de 24 h y sacrificio después de la última aplicación. Los animales fueron sacrificados por dislocación cervical y se procedió a la extracción de ambos fémures y al lavado de la cavidad medular como lo describe la técnica.14 Se prepararon dos láminas por animal que fueron codificadas siguiendo una tabla de números aleatorios. Se contaron al menos 1000 eritrocitos policromáticos (PCE) por animal y además los eritrocitos normocromáticos (NCE) presentes por cada 250 PCE para estimar la relación PCE/NCE, indicadora de citotoxicidad medular. Se empleó el número mínimo de animales posibles según las recomendaciones técnicas del experimento y fueron manipulados respetando las normas establecidas para la protección de los mismos. Cálculo de la LD₅₀ y análisis estadístico Para la determinación de la LD50 los datos fueron transformados a Probits y ploteados contra los logaritmos de las concentraciones. Luego se estableció la relación lineal a través del método de los mínimos cuadrados.¹⁵ Para el ensayo de segregación mitótica en A. nidulans, el análisis estadístico se realizó normalizando los conteos de sectores segregantes por colonia mediante la transformación v(x+0,5), antes de proceder a un análisis de varianza de 1 vía que permitió comparar las frecuencias de sectores por colonia (FSC) de las diferentes concentraciones ensayadas con el control negativo. Para las comparaciones entre controles y tratamientos de interés se utilizaron las pruebas t de student y el test de Dunnett 16. La posible existencia de una relación dosis – respuesta se comprobó con una prueba de regresión lineal. En el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón los datos de PCE/NCE y % de PCE micronucleados se normalizaron empleando la transformación √(x = 1). Después se procedió a realizar un análisis de varianza de 2 vías considerando sexo y tratamientos tanto para la relación PCE/NCE como para el % de PCE micronucleados, con el empleo del programa estadístico MICROSTAT. Las comparaciones entre controles y tratamientos de interés se realizaron utilizando las pruebas t de student y el test de Dunnett¹⁶. La existencia de una posible relación dosis – respuesta se chequeó a través del análisis de regresión de Cochran – Armitage para tendencias lineales en proporciones.¹⁷ Se trabajó con un nivel de significación p < 0,05.

RESULTADOS

Estudio de toxicidad aguda: las manifestaciones tóxicas presentadas por los animales después de la ingestión del extracto fueron de ligera intensidad con recuperación total a los 30 min y ocurrieron en las dosis 1,649 y 1,236 g/kg. Se caracterizaron por disminución de la actividad motora, marcha atáxica y arrastre del tren posterior. No ocurrieron muertes ni retardo del desarrollo ponderal de los animales tratados. En el estudio macroscópico no se encontraron alteraciones, no obstante, el estudio microscópico demostró ligera cromatolisis nuclear en los hepatocitos de todas las muestras de los animales tratados, no así en los controles negativos y espontáneos. También se observó ligero cambio hidrópico tanto en hígado como en riñón de todos los animales muestreados.

Ensayo de segregación mitótica en A. nidulans: observamos una toxicidad cuantitativa baja en todo el rango de concentraciones ensayadas de acuerdo con los criterios de Kappas; sin embargo, apreciamos un incremento creciente de la FSC en correspondencia con el aumento de las concentraciones ensayadas, que duplica y en ocasiones triplica la encontrada para el control negativo llegando a superar la FSC del control positivo en el rango de concentraciones de 1,455 a 1,940 mg/ml de medio de cultivo. El ANOVA de una vía indicó significación estadística (p <0,001). El análisis de regresión mostró la existencia de una relación dosis – respuesta lineal ( p < 0,001; r = 0,9745).

Ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón: no se detectaron alteraciones en la relación PCE/NCE, indicadora de citotoxicidad medular. El ANOVA de 2 vías para la frecuencia de PCE micronucleados fue negativo, así como la prueba de regresión de Cochran-Armitage para comprobar relación dosis-respuesta (p = 0,38).

DISCUSIÓN

En el estudio de toxicidad aguda los resultados negativos harían válido el planteamiento de que este extracto posee muy baja toxicidad; sin embargo, el estudio histológico mostró una ligera cromatolisis nuclear en los hepatocitos de todas las muestras correspondientes a los animales tratados. Este es un cambio muy discreto cuya significación radica en su exclusiva presencia en las muestras de los animales que recibieron el extracto, lo que podría constituir un signo de alerta hacia la posible existencia de un componente tóxico con afinidad por el núcleo celular, que de estar en concentraciones mayores o por tiempo prolongado en contacto con su sitio de acción, podría provocar daños más importantes. Un estudio precedente con un extracto acuoso de la planta administrado por vía peritoneal a ratas mostró baja toxicidad y una LD₅₀ de 1947 mg/kg, algo mayor que la dosis máxima ensayada por nosotros.¹⁰ Estas diferencias podrían relacionarse con las especies de roedores utilizadas, con la vía de administración empleada y las características fitoquímicas del extracto. Respecto al cambio hidrópico ligero observado en las láminas de hígado y riñón de todos los animales muestreados, se atribuye a una respuesta adaptativa celular al volumen líquido, de carácter reversible y sin relación con la calidad del mismo. El ensayo de segregación mitótica en A. nidulans evidenció toxicidad cuantitativa sobre el hongo en todo el rango de concentraciones estudiadas, la cual aunque fue baja pudiera estar relacionada con las propiedades bactericidas y fungicidas comprobadas para diferentes extractos de la plantas.^9,10 En este caso la citotoxicidad está en correspondencia con la clara acción genotóxica del extracto, avalada por aumentos significativos de la FSC en el rango de 0,29 a 1,94 mg/ml de MC, dosis dependiente; esta respuesta genotóxica pudiera deberse a la presencia de safrol como componente mayoritario del aceite esencial de P. auritum H.B.K.^6,18,19,20 que es un compuesto mutagénico (detectado en un sistema de ensayo con el hongo Saccharomyces cerevisiae) y hepatocarcinogénico en roedores.^21,22 Conocemos de un resultado negativo en un sistema de detección similar al nuestro, donde se ensayó un extracto acuoso de hojas de la planta hasta una concentración de 400 mg/ml de MC.¹⁰ La obtención de un resultado positivo con concentraciones entre 0,2 y 1,9 mg/ml de MC indica la presencia en el extracto hidroalcohólico de compuestos con actividad genotóxica que no se encuentran en el extracto acuoso, probablemente a causa de su menor polaridad. El ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón resultó negativo. Sólo encontramos una tendencia al aumento en la relación PCE/NCE (p = 0,052), que contrariamente debiera disminuir en caso de toxicidad medular. Este hecho nos resulta inexplicable hasta el momento.

Probada la actividad genotóxica in vitro del extracto debemos pensar en la existencia de factores propios de la fisiología animal que atenúan la expresión de esta respuesta in vivo, como son los procesos de absorción, distribución, metabolismo y excreción, de tal forma que el componente genotóxico del extracto haya sido inactivado por diferentes sistemas enzimáticos y como consecuencia no haya causado daño detectable a nivel del ADN del órgano diana. Por otra parte si el compuesto responsable de la actividad genotóxica in vitro es una sustancia química de una vida media muy corta, esta puede ser transformada o destruida antes de ejercer su acción sobre el ADN medular, o no encontrarse en concentraciones suficientes ya sea por esta razón o a causa de su deficiente absorción, rápida excreción, eficiente metabolismo, etc.²³ Otro factor pudiera estar relacionado con la ausencia de una necesaria activación enzimática en el órgano diana que impida la formación del compuesto genotóxico a nivel de la médula ósea, pudiendo hacerse evidente su acción a través de otro sistema de ensayo in vivo.²⁴

Los resultados obtenidos nos permiten concluir que el extracto fluido de P. auritum H.B.K. es una mezcla de baja toxicidad aguda con signos de alerta sobre el núcleo de las células hepáticas, que mostró una clara respuesta genotóxica en el ensayo de segregación mitótica con la cepa D-30 de A. nidulans, lo que no fue corroborado por el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón.

Summary

Toxic and genotoxic assessment of fluid extract from Piper auritum H.B.K.

The acute toxicity of fluid extract from Piper auritum H.B.K. as well as its genotoxic activity were evaluated through two short term assay systems, one in vitro using the D-30 strain of Aspergillus nidulans and, another in vivo, the micronuclei assay in mouse bone marrow. The results allow to conclude that the fluid extract from P.auritum H.B.K. showed a very low acute toxicity and that it proved to be genotoxic in vitro but not in vivo .

Key words: Piper auritum H.B.K., caisimon de anís, Aspergillus nidulans, micronuclei assays, acute toxicity, genotoxicity.

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Recibido: 10 de septiembre de 2006. Aprobado: 20 de octubre de 2006.
Dra. Neylim Blanco Hernández. Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana.
Facultad de Medicina “Dr. Salvador Allende”. La Habana. Cuba.

1Especialista I grado de Farmacología.
2Licenciado en Biología.