Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM)

Evaluación genotóxica del extracto hidroalcohólico de Tamarindus indica L. empleando el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón

Msc.Antonia de la Caridad Remigio Montero,1 Lic. Janet Piloto Ferrer,2 Yamilé Vega Hurtado,3 Carlos Rodríguez Ferralá 3 y Caridad Carballo3

RESUMEN

El ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón, prueba incluida en la batería estándar de genotoxicidad, fue empleado para evaluar el potencial clastogénico y aneugénico de un extracto hidroalcohólico de Tamarindus indica L. Se utilizaron ratones NMRI de ambos sexos los que fueron administrados por vía intragástrica a razón de 10 mL/kg, separados 24 h, con sacrificio 24 h después de la última aplicación Se determinó el índice de genotoxicidad, porcentaje de eritrocitos policromáticos micronucleados en un total de 1 000 eritrocitos policromáticos por animal. Los índices de genotoxicidad de los grupos tratados con 500, 1000 y 2000 mg/kg de peso corporal del extracto, fueron estadísticamente significativos con respecto al grupo tratado con la sustancia control (H2O estéril). El extracto de Tamarindus indica L. resultó clastogénico, ya que produjo un aumento significativo en la frecuencia de micronúcleos de los eritrocitos policromáticos de la médula ósea y en la prueba de tendencia lineal de proporciones demostró una relación dosis-respuesta.

Palabras clave: Genotoxicidad, medula ósea, micronúcleos, Tamarindus indica L.

Se conoce que ningún ensayo por sí solo puede suministrar los datos necesarios para estimar el riesgo genético que constituyen determinados productos químicos para el hombre, debido a la gran variedad de efectos genotóxicos existentes. De ahí que las agencias regulatorias diseñaran baterías de ensayos para evaluar los productos químicos y predecir en general sus riesgos genéticos.1

Dentro de la batería estándar de genotoxicidad establecida fue incluido con carácter permanente el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratón desarrollado por Schmid (1976)2 capaz de predecir con un 91 % de sensibilidad el potencial clastogénico y aneugénico en los eritrocitos policromáticos de la médula ósea de una sustancia determinada.3 Esta prueba cuantifica el porcentaje de micronúcleos en los eritrocitos policromáticos que resultan de las rupturas cromosómicas, o la no disyunción por mal funcionamiento del uso mitótico debido a que la frecuencia espontánea de micronúcleos en las células es baja, ya que estas en su proceso de maduración pierden el núcleo pero no el micronúcleo.4

El estudio del efecto genotóxico de mezclas complejas obtenidas de las plantas usadas en la medicina tradicional, amplía los conocimientos acerca del potencial terapéutico que poseen las plantas medicinales y contribuye al desarrollo continuo de la industria biofarmacéutica. Tamarindus indica L. perteneciente a la familia Caesalpinaceae, es conocida en Cuba como tamarindo, se cultiva ampliamente en el trópico donde se propone como laxante, antiséptico, diurético y antilitiásico.5

Por otra parte a esta planta se le han demostrado científicamente varias aplicaciones terapéuticas como antimicrobiana,6 como refrescante y contra las enfermedades hepáticas.7 También se ha reportado que los extractos de las hojas de tamarindo reducen la actividad mitótica e inducen aberraciones cromosómicas en los meristemos de Allium sativum,8 y el extracto hidroalcohólico al 70% de la corteza del tallo presentó muy buena actividad antitubulínica.9 (Piloto et al, En prensa).

En el presente estudio se analizan las propiedades genotóxicas de un extracto hidroalcohólico al 70 % obtenido de esta especie vegetal, a través del ensayo in vivo de micronúcleos en médula ósea de ratón.

MÉTODOS

Material vegetal

La planta se cultivó en la Estación Experimental de Plantas Medicinales “Dr. Juan Tomás Roig” en San Antonio de los Baños, La Habana. Un ejemplar de la misma se conserva en el herbario de la institución con número ROIG (4670). El material vegetal seco y molinado fue sometido a la extracción por percolación hidroalcohólica10,11 con etanol al 70 % y finalmente concentrado a presión reducida hasta la obtención de un extracto blando.

Las pruebas se ejecutaron siguiendo las líneas directrices de la OECD y de la Comunidad Económica Europea para los ensayos de Genotoxicidad.12 Se realizó el ensayo de micronúcleos en médula ósea de ratones Cenp: NMRI que tenían entre 8 y 12 semanas de edad y 30 g de peso corporal que fueron suministrados por el Centro Nacional para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Se mantuvieron en un período de cuarentena de 7 días en el vivario de la institución, bajo condiciones controladas de temperatura (21 a 25 °C), humedad relativa (40 a 70 %) y con ciclos normales de luz –oscuridad de 12 h para eliminar el estrés de la transportación y lograr su adaptación a las nuevas condiciones. Una vez concluida esta etapa se procedió al pesaje individual de los animales utilizando la balanza. Luego fueron distribuidos aleatoriamente y ubicados por grupos de tratamiento, los cuales se distribuyeron en cajas de Macrolon tipo T3, encamadas con bagacillo de caña previamente esterilizado a 120 °C durante 20 min. Fueron provistos con la dieta comercial, fórmula EMO 1001 y agua ad libitum (acidulada con ácido clorhídrico hasta un pH de 2,4 a 2,5) para satisfacer sus requerimientos nutricionales.

Se establecieron cinco grupos experimentales: control negativo (agua destilada), control positivo (Ciclofosfamida, 40 mg/kg de peso corporal) y tres dosis del extracto 500, 1000 y 2000 mg/kg para ambos sexos, las que fueron diluidas en agua destilada para ser aplicadas en un volumen de 10 mL/kg de peso corporal por vía intragástrica.

Se realizaron 2 administraciones consecutivas con intervalos de 24 horas y se procedió al sacrificio 24 h después de la última aplicación. Este tiempo de muestreo está basado en la cinética de maduración de los eritrocitos en ratones.13

El procedimiento empleado para la obtención de las preparaciones de la médula ósea, fue realizado de acuerdo a la metodología propuesta por Schmid en 1976.2 Con este procedimiento se obtiene una tinción diferencial entre los eritrocitos policromáticos (PCE) y los eritrocitos normocromáticos (NCE). Se cuantifica el número de PCE portadores de micronúcleos (PCE-MN) y se expresa como porcentaje con respecto al total de PCE observados (2000 por animal).

Los criterios de genotoxicidad tomados fueron los recomendados por Hayashi14 significación estadística del incremento del % PCE-MN en una o más dosis con respecto al control negativo. Como criterio de toxicidad se tomó la significación estadística de la disminución de la proporción PCE/NCE en una o más dosis con respecto al control negativo.15

Para el análisis estadístico de los resultados del ensayo, primeramente se determinó la media del índice de genotoxicidad (IG) de cada grupo de tratamiento con su correspondiente desviación estándar, y se verificó el ajuste de los datos a una distribución normal y el cumplimiento de la homogeneidad de varianza. El método estadístico principal utilizado fue un ANOVA bifactorial para determinar si existía un incremento estadísticamente significativo del IG de cada una de las dosis del extracto respecto al control negativo teniendo en cuenta la posible diferencia entre los sexos, con una significación de p < 0.05. Además se realizó una prueba de tendencia lineal de proporción para determinar una relación dosis-respuesta entre las proporciones de PCE micronucleado total observadas y las dosis aplicadas.

RESULTADOS

Los resultados del ensayo aparecen en la Tabla 1. En ambos sexos se encontró un aumento significativo ( p < 0.05 ) en la frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados (PCE-MN) de las dosis en estudio.

Tabla 1. Porcentaje de Micronúcleos e Índice de Toxicidad de los grupos controles y tratados.

Dosis (mg/kg)	Sexo	Índice de Toxicidad (PCE/NCE) (X ± DE)	Índice de Genotoxicidad (%PCE-MN) (X ± DE)
500	M	0,47 ± 0,04	0,35 ± 0,25*
H	0,48 ± 0,12*	0,52 ± 0,16*	0,52 ± 0,16*
1000	M	0,40 ± 0,13	0,48 ± 0,21*
H	0,56 ± 0,09*	0,23 ± 0,14*	0,23 ± 0,14*
2000	M	0,53 ± 0,54	0,61 ± 0,11*
H	0,51 ± 0,04*	0,60 ± 0,31*	0,60 ± 0,31*
Ciclofosfamida 40 mg/kg	M	0,40 ± 0,03	1,84 ± 0,99**
H	0,36 ± 0,03	0,86 ± 0,14**	0,86 ± 0,14**
Agua estéril	M	0,49 ± 0,07	0,27 ± 0,17
H	0,36 ± 0,1	0,15 ± 0,21	0,15 ± 0,21

          MN: micronúcleos
          PCE: Eritrocitos policromáticos
          NCE: Eritrocitos normocromáticos
          X: Media
          DE: Desviación Estándar
          M: machos
          H: hembras
          *Diferencia significativa respecto al control negativo ( p< 0,05 ).
          **Diferencia significativa respecto al control negativo ( p< 0,.01 ).    

DISCUSIÓN

Tal como puede observarse a partir de los resultados, el extracto fluido de Tamarindus indica L. estudiado, induce efecto mutagénico en el sistema de ensayo donde se evaluó.

Para las hembras ninguna dosis causó toxicidad detectable en el órgano blanco, esto es la médula ósea, los valores obtenidos van desde 0,48 hasta 0,56, que difieren del control 0,36 pero es de destacar que al ser el índice de toxicidad una relación inversa (PCE/NCE), indica que ninguna de las dosis en estudio afecta citotóxicamente la médula ósea con el extracto de Tamarindus indica L. en estudio, pues son registrados microscópicamente muchos más eritrocitos maduros (PCE).

Sin embargo encontramos que los valores para el índice de toxicidad en los machos para la dosis de 1000 mg/kg (0,40) difieren estadísticamente del control negativo (0,49) indicando una clara toxicidad medular. La citotoxicidad del Tamarindus indica L. ha sido comprobada con el test antimicótico de inhibición del ensamblaje/desensamblaje de la tubulina a concentraciones de 0,08 mg/mL de un extracto hidroalcohólico similar al nuestro.9

Obsérvese que la toxicidad celular conduce a la rotura del ADN y la consiguiente aparición de aberraciones cromosómicas, ya que los índices de genotoxicidad en los grupos tratados con 500, 1000 y 2000 mg/kg de peso corporal del extracto fluido de Tamarindus indica L., que indican un incremento significativo de este índice respecto al grupo control negativo, y en el caso particular de los machos al realizar la prueba de tendencia lineal en proporciones para analizar la relación dosis–respuesta, se encontró un aumento de la frecuencia vinculado al aumento de la dosis.

Estos resultados positivos indican, que bajo las condiciones probadas, el extracto fluido de Tamarindus indica L. es genotóxico en ratones NMRI, ya que produjo un aumento significativo en la frecuencia de micronúcleos en los eritrocitos poli-cromáticos de la médula ósea en todas las dosis evaluadas. Se encontró un aumento de la frecuencia vinculado al aumento de la dosis.

SUMMARY

Genotoxic assessment of hydroalcoholic extract of Tamarindus indica L using micronuclei assay in mouse bone marrow

Micronuclei assay in mouse bone marrow, test included in genotoxicity standard battery, was used to assess clastogenic and aneugenic potential of a hydroalcoholic extract of Tamarindus indica L. We used NMRI mice of both sexes, with administration by intragastric route at a rate of 10 mL/kg, in the space of 24 hours, sacrified 24 hours after last application. Genotoxicity rate, polychromatic micronucleated erythrocyte percentage in a total of 1 000 polychromatic erythrocytes per animal. Genotoxicity rates of treated groups using 500, 1000, and 2000 mg/kg extract/body weight were statistically significant as for group treated with control substance (H2O sterile). Extract of Tamarindus indica L was of clastogenic type, since give raise to a significant increase in micronuclei frequency of bone marrow polychromatic erythrocytes, and in ratios linear trend test showed a dosis-response relationship.

Key words: Genotoxicity, bone marow, micronuclei, Tamarindus indica L.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Choy W. Regulatory Genetic toxicology tests. In: Choy WN, editor. Genetic Toxicology and Cancer Risk Assessment. New York: Marcel Dekker, Inc;2001.

2. Schmid W. The micronucleus test for cytogenetic analysis. Chemical mutagens. New York: Ed. A. Hollaender Plenum;1976.

3. Heddle J, Cimino M, Hayashi M, Vanparys P, McGregor J. Micronucleus test: index of citogenetic damage. Past, present and future. Mut Res.1995;344:103-8.

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8. Yadav S. Antimitotic and cytological activities of tropical forest Tamarindus indica L. Journal of Tropical Forestry. 1986;2(1):53-8.

9. Piloto J, Remigio A, Guerra M, Hurtado Y. Tamarindus indica L. (“tamarindo”): Evaluación del potencial antimitótico, antioxidante, genotóxico y antimutagénico. [En prensa]

10. Martin E, Cook E. Remington's Practice of Pharmacy, 12 th ed. Easton: Mack Publishing; 1961.

11. Soler B, Méndez G, García M, Miranda M. Normas Ramales. Medicamentos de Origen Vegetal. Tinturas y Extractos Fluidos. Ministerio de Salud Pública 1992.

12. OCDE. Organization for Economic Co-operation and development. Mammalian erythrocyte micronucleus test. Guideline for the testing of chemiclas. Updated test Guideline 474. Paris, France; [serie de Internet] 1997 [citado…]. Disponible en: http://www.oecd.org//ehs/test/health.htm.

13. Mavournin K, Cimono N, Salamone M, Heddle J. The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. Mutation Research.1990;239:29-80.

14. Hayashi M, Tice R, McGregor J, Romagna F, Pacchierotti F. In vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. Mutation Research.1994;312:293-304.

15. Gollapudi B, McFadden L. Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test. Mutation Research.1995;347:97-99.

Recibido:27 de noviembre de 2006. Aprobado: 10 de enero 2007.
MsC. Antonia de la Caridad Remigio Montero. CIDEM. Ave. 26 No 1605 e/ Puentes Grandes y Boyeros, Plaza. Ciudad de la Habana. CP 106000 Telf. 811930. Fax: [phone]. Dirección particular: Ave. Ceiba. No 1523, e/ Segunda y Entrada. Cerro. Ciudad de La Habana. Teléfono: 8811424. E-mail: [e-mail]

1Investigador Auxiliar.
2Investigador Agregado.
3Técnico.