ARTÍCULO ORIGINAL

 

Modulação in vitro da atividade antibiótica pelo óleo essencial dos frutos de Piper tuberculatum Jacq

 

Modulación in vitro de la actividad antibiótica por el aceite esencial de frutos de Piper tuberculatum Jacq

 

In vitro modulation of the antibiotic activity of essential oil from fruits of Piper tuberculatum Jacq

 

 

Valterlúcio dos Santos Sales, Emmily Petícia do Nascimento, Álefe Brito Monteiro, Maria Haiele Nogueira da Costa, Gyllyandeson de Araújo Delmondes, Tereza Raquel Carneiro Soares, Saulo Relison Tintino, Francisco Rodolpho Sobreira, Dantas Nóbrega de Figuêiredo, Cristina Kelly de Souza Rodrigues, José Galberto Martins da Costa, Henrique Douglas Melo Coutinho, Cícero Francisco Bezerra Felipe, Irwin Rose Alencar de Menezes, Marta Regina Kerntopf

Universidade Regional do Cariri-Urca (ce/Brasil).

 

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RESUMO

Introdução: Piper tuberculatum Jacq., popularmente conhecida como "pimenta-longa" ou "pimenta-d'Arda", é utilizada empiricamente no tratamento de doenças respiratórias (asma, bronquite e tosse) e digestivas (dores abdominais e diarreias). Na literatura é descrita com importantes atividades anti-inflamatória, antimicrobiana, antileucêmico e anti-helmíntica.
Objetivos: avaliar a atividade moduladora do óleo essencial dos frutos de P. tuberculatum (OEPT) em associação com diferentes antibióticos frente à Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Pseudomona aeruginosa.
Metodos: Os frutos (frescos) de P. tuberculatum foram coletados em Barbalha/CE e submetidos à hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger para ser extraído o óleo essencial, após a extração o óleo essencial foi tratado com sulfato de sódio anidro para eliminação da umidade residual. A avaliação da atividade antibacteriana e modulação (em resistência bacteriana) frente às cepas de S. aureus (SA358), E. coli (EC27) e P. aeruginosa (PA03) foram determinadas pelo método de microdiluição para identificar a concentração inibitória mínima (CIM), realizada em triplicata. CIM de ≤ 256 µg/mL foi considerado clinicamente relevante.
Resultados: a atividade antibacteriana do OEPT exibiu um CIM de ≥ 1024 µg/mL contra as cepas de bactérias de padrão resistente a múltiplas drogas. Na avaliação da atividade moduladora, o OEPT antagonizou o efeito da amicacina contra E. coli e S. aureus, mas teve efeito sinérgico contra P. aeruginosa. Combinado com a getamicina o óleo exibiu antagonismo frente a E. coli, no entanto não apresentou resultado relevante contra S. aureas e P. aeruginosa. A associação do OEPT com o antibiótico imipenem resultou efeito mais relevante, apresentando sinergismo para todas as bactérias avaliadas, por outro lado, em associação com ciprofloxacino não apresentou efeito significante em relação ao controle.
Conclusão: O OEPT apresentou uma melhor atividade quando associado ao imipenem frente todas as bactérias avaliadas, mostrando ser uma possível alternativa no desenvolvimento de novos fármacos com atividade antibacteriana advindos de produtos fitoterápicos.

Palavras chave: Piper tuberculatum Jacq.; atividade antibacteriana; óleo essencial; modulação.

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RESUMEN

Introducción: Piper tuberculatum Jacq. popularmente conocida como "pimenta-longa" o "pimenta-d'Arda", se utiliza empíricamente en el tratamiento de enfermedades respiratorias (asma, bronquitis y tos) y digestivas (dolor abdominal y diarrea). En la literatura es describe con importantes actividades antiinflamatorias, antimicrobianas, antileucémicas y antihelmínticas.
Objetivo: evaluar la actividad moduladora de los aceites esenciales de frutos de P. tuberculatum (AEPT) en asociación con diferentes antibióticos contra Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Pseudomona aeruginosa.
Metodología: los frutos (frescos) de P. tuberculatum fueron recolectados en Barbalha/CE y sometidos a hidrodestilación en un equipo Clevenger, para extraer el aceite essencial (AEPT), el cual, una vez extraído, fue tratado con sulfato de sodio anhidro para eliminar la humedad residual. Se evaluó su actividad antibacteriana contra las cepas de S. aureus (SA358), E. coli (EC27) y P. aeruginosas (PA03). Empleando el método de microdilución se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM), con tres réplicas por cada tratamiento. Un valor de CIM ≤ 256 μg/mL se considera clínicamente relevante.
Resultados: la actividad antibacteriana del AEPT exhibió una CIM ≥ 1024 μg/mL contra las cepas estándar de bacterias resistentes a múltiples fármacos. En efecto, la actividad AEPT antagoniza el efecto de amikacina contra E. coli y S. aureus, pero tenía un efecto sinérgico contra P. aeruginosa. Combinado con la getamicina el aceite exhibió antagonismo contra E. coli, sin embargo no presentó resultado relevante ante S. aureus y P. aeruginosa. La asociación de AEPT con el antibiótico imipenem resultó el efecto más relevante, mostrando sinergismo frente a todas las bacterias evaluadas. Por el contrario, en asociación con ciprofloxacina no mostró ningún efecto significativo con respecto al control.
Conclusión: el AEPT presentó una mejor actividad cuando se asoció a imipenem, frente todas las bacterias evaluadas, demostrando ser una posible alternativa en el desarrollo de nuevos fármacos con actividad antimicrobiana, a partir de productos herbarios.

Palabras clave: Piper tuberculatum Jacq.; actividad antibacteriana; aceite essencial; modulación.

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ABSTRACT

Introduction: Piper tuberculatum Jacq., commonly known as pimenta-longa or pimenta-d'Arda, is empirically used to treat respiratory conditions (asthma, bronchitis and coughing) and digestive disorders (abdominal pain and diarrhea). Reference may be found in the literature to outstanding antiinflammatory, antimicrobial, antileukemic and antihelmintic activity.
Objective: Evaluate the modulatory activity of essential oils from fruits of P. tuberculatum (AEPT) combined with various antibiotics againstStaphylococcus aureus, Escherichia coli and Pseudomona aeruginosa.
Methods: Fresh fruits of P. tuberculatum were collected in Barbalha, CE, and subjected to hydrodistillation in a Clevenger set to extract the essential oil (AEPT). The oil extracted was then treated with anhydrous sodium sulfate to eliminate residual humidity. Antibacterial activity was evaluated against strains of S. aureus (SA358), E. coli (EC27) and P. aeruginosas (PA03). Minimum inhibitory concentration (MIC) was determined by the microdilution method, with three replications for each treatment. A MIC ≤ 256 μg/mL was considered to be clinically relevant.
Results: Antibacterial activity of AEPT displayed a MIC of ≥1024 μg/mL against standard strains of multi-drug resistant bacteria. In fact, activity of AEPT antagonized the effect of amikacin against E. coli and S. aureus, but had a synergic effect against P. aeruginosa. Combined with gentamicin, the oil exhibited antagonism against E. coli, but no relevant result was obtained against S. aureus and P. aeruginosa. Combination of AEPT with the antibiotic imipenem had the most relevant effect, displaying synergism against all the bacteria evaluated. However, in combination with ciprofloxacin it did not show any significant effect with respect to the control.
Conclusion: AEPT displayed better activity against all the bacteria evaluated when combined with imipenem, proving to be a possible alternative for the development of new herbal drugs with antimicrobial activity.

Keywords: Piper tuberculatum Jacq.; antibacterial activity; essential oil; modulation.

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INTRODUÇÃO

A resistência de microrganismos patogênicos a substância antimicrobiana tem sido considerado um grande problema de saúde pública¹. As bactérias Gram-positivas do gênero Staphylococcus são constantemente identificadas como promotoras de infecções oportunistas em vários animais e seres humanos; e caracterizadas por possuir cepas resistentes.^2-3 Dentro desse gênero a S. aureus é um agente etiológico comum em infecções (furúnculos, carbúnculos, abscesso, miocardite, endocardite, meningite, pneumonia, e artrite bacteriana).⁴

Já a bactéria Gram-negativa Escherichia coli é um dos principais patógenos causadores de infecção em seres humanos, tem cepas resistentes. É conhecida pela produção de enterotoxinas, cujas propriedades e papel na doença diarreica tem sido bastante investigada. As ações das citotoxina e sua atuação nas infecções humanas já foram apontadas, sobretudo no trato urinário.⁵ Outra Gram-negativa a P. aeruginosa, é descrita em possuir alta resistência a antibióticos comuns,⁶ está relacionada como um dos principais agentes causadores de infecções hospitalares, como a peritonite, bacteremia, infecções do trato urinário e infecções cirúrgicas em indivíduos imunocompetentes.⁷

A pesquisa científica objetiva descobrir novas substâncias que possam ser uma alternativa à terapêutica de infecções bacterianas e um aliado na tentativa de reverter esses processos de resistência. Moléculas provenientes de espécies vegetais que possam conter propriedades antimicrobianas são alvos dessas pesquisas.

A família Piperaceae é considerada entre as famílias mais primitivas de angiospermas, estima-se ser composta por 10 a 12 gêneros com um significante e indeterminado número de espécies, entre 1.400 e 2.000.^8,9 O gênero Piper distribui-se geograficamente em regiões subtropicais, tropicais e temperadas de ambos os hemisférios, abrangendo mais de 1.000 espécies.¹⁰ No território brasileiro são descritas em torno de 266 espécies.¹¹ No Nordeste a Piper tuberculatum Jacq., é popularmente conhecido como "pimenta-longa" ou "pimenta-d'Arda",¹² utilizada empiricamente no tratamento de patologias do aparelho respiratório (asma, bronquite e tosse) e digestivo (dores abdominais e diarreias). Na literatura é descrita com importantes atividades anti-inflamatória, antimicrobiana, antileucêmico e anti-helmíntica.¹³

Portanto essa pesquisa objetiva avaliar a atividade moduladora do óleo essencial dos frutos de P. tuberculatum em associação com diferentes antibióticos frente a E. coli, S. aureus e P. aeruginosa.

 

MÉTODOS

Material vegetal

O material vegetal (frutos da P. tuberculatum, família Piperaceae) foi coletado às 9h da manhã no sítio Arajara, no município de Barbalha, estado do Ceará, à orientação sul 07º 19'568'', e a oeste 039º 23'580'', estando de acordo com a autorização com base na Instrução Normativa no154/207; licença no 41398-1, do Ministério do Meio Ambiente-MMA/Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade-ICMBio.

O material vegetal foi identificado e uma exsicata foi depositada no Herbário Caririense Dárdano de Andrade Lima - HCDAL da Universidade Regional do Cariri - URCA catalogada sob o registro de número 10.631.

Obtenção do óleo essencial de P. tuberculatum

Os frutos (frescos) coletados foram submetidos à hidrodestilação em aparelho tipo Clevenger. O material foi pesado (2,56 kg) e em seguida colocado em balão de vidro, sendo acrescentada água destilada e submetidos à ebulição por 2 h. O óleo essencial extraído foi tratado com sulfato de sódio anidro para eliminação da umidade residual e teve um rendimento de 0,46 %; após todo o processo de extração o material foi depositado em frasco âmbar sendo mantido em refrigerador.

Drogas

Os antibióticos utilizados foram: amicacina, gentamicina, imipenem e ciprofloxacino (SIGMA Chemicals, St Louis, EUA), preparado de acordo com as instruções do fabricante.

Materiais bacterianos

As estirpes bacterianas utilizadas foram S. aureus (SA-ATCC25923 e SA358), E. coli (ATCC-CE10536 e EC27) e P. aeruginosa (PA-ATCC15442 e PA03). Todas as cepas foram mantidas em ágar infusão de coração inclina (HIA, DifcoLaboratories LTDA). Antes dos experimentos, as células foram cultivadas por 24 h em 37 °C em fusão de cérebro coração (BHI, DifcoLaboratories LTDA).

Atividade antimicrobiana do teste

A concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada em ensaio de microdiluição em caldo,¹⁴ utilizando-se um inóculo de 100 μL de cada linhagem, suspensas em caldo BHI que apresentava uma concentração de 10⁵ UFC/mL em placas de microtitulação com 96 poços, com diluições em série ½. Em cada poço foi adicionado 100 μL de solução do óleo essencial. As concentrações finais do óleo variaram entre 512 - 8 μg/mL. Para os controles foram utilizados os antibióticos padrões amicacina, gentamicina, imipinem e ciprofloxacino cujas concentrações finais variaram entre 512 - 8 μg/mL. As CIMs foram registradas como as menores concentrações para a inibição do crescimento. Para evidenciá-las, preparou-se uma solução indicadora de resazurina sódica (Sigma) em água destilada estéril na concentração de 0,01 % (p/v). Após a incubação, 20 µL da solução indicadora foram adicionados em cada cavidade e as placas passaram por um período de incubação de 1 h em temperatura ambiente. A mudança de coloração azul para rosa, devido à redução da resazurina, indica o crescimento bacteriano,¹⁵ auxiliando a visualização da CIM, definida como a menor concentração capaz de inibir o crescimento microbiano, evidenciado pela cor azul inalterada.

Efeito sinergísta ou antagonista na associação com antibióticos

O óleo essencial foi misturado em caldo BHI 10 % em concentrações subinibitórias, obtidos e determinados após a realização de teste de avaliação da CIM, sendo que para o teste de modulação a concentração da solução de extrato foi reduzida 8 (oito) vezes (CIM/8). A preparação das soluções de antibióticos foi realizada com a adição de água destilada estéril em concentração dobrada (1024 µg/mL) em relação à concentração inicial definida e volumes de 100 µL diluídos seriadamente 1:1 em caldo BHI 10 %. Em cada cavidade com 100 µL do meio de cultura continha a suspensão bacteriana diluída (1:10). Os mesmos controles utilizados na avaliação da CIM para o óleo foram utilizados durante a modulação.¹⁶ As placas preenchidas foram incubadas a 35 ºC por 24 h e após esse período a leitura foi evidenciada pelo uso de resazurina como citado anteriormente no teste de determinação da CIM.

Análise estatística

Os ensaios foram feitos em triplicata, e expressos como média geométrica. Na análise estatística foi aplicada à análise de variância de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni (onde p< 0,001 foi considerado significativo) utilizando o software GraphPad Prism 5.00.288®.

 

RESULTADOS

Atividade antibacteriana do óleo essencial da P. tuberculatum (OEPT) exibiu um CIM de ≥ 1024 μg/mL contra estirpes de bactérias multirresistentes e padrão (um valor CIM de ≤ 256 μg/mL foi considerado clinicamente relevante) (tabela 1).

Quando associado com os antibióticos, o OEPT apresentou importante atividade. A associação com amicacina resultou efeito antagônico frente E. coli e S. aureus em 60 % e 37 % respectivamente, por outro lado, manifestou efeito sinérgico (26 %) quando avaliado contra P. aeruginosa. Em associação com a gentamicina o óleo exibiu efeito antagônico em 37 % frente aE. coli, no entanto não apresentou resultado relevante contra S. aureus y P. aeruginosa. O OEPT com imipenem apresentou efeito sinérgico para todas as bactérias avaliadas, E. coli 59 %, P. aeruginosa 50 % e S. aureus 26 %. Por outro lado em associação com ciprofloxacino não apresentou efeito significante em relação ao controle (tabela 2).

 

DISCUSSÃO

Estudos prévios vêm mostrando a importância das interações de derivados de plantas, em variadas concentrações, com antimicrobianos na inibição do crescimento de microrganismos patogênicos e multiresistentes a drogas.^16-18 Muitas plantas podem servir como alternativa terapêutica devido à atividade antimicrobiana comumente associada aos seus óleos essenciais.¹⁹

Espécies correlata ao gênero Piper têm sido descrita na literatura apresentando atividade antimicrobiana, incluindoPiper aduncum,^20-24 Piper marginatum^24,25 Piper regnelli,²⁵ Piper arboreum,^26,27 Piper caldense, Piper mollicomum, Piper montealegreanum,²⁸ Piper malacophyllum,¹⁹ Piper alliaceae.²⁹

Estudos realizados com óleos essenciais e seus componentes isolados mostraram atividade antibacteriana.^29-35 No OEPT foi identificado como componentes majoritários o alfa-pineno e o beta- pineno (dados não mostrados e não publicados). No trabalho realizado por Leite e colaboradores³⁰ β-pineno mostrou-se efetivo ao inibir as cepas de S. aureus e S. epidermidis. Burt³² também encontrou atividade antimicrobiana dos pinenos frente às bactérias S. aureus e E. coli.

Facundo e colaboradores¹² ao realizarem um estudo fitoquímico visando reconhecer os constituintes fixos e voláteis do óleo essencial dos frutos de P. tuberculatum verificaram a presença de monoterpenos e sesquiterpenos. Os terpenóides e óleos essenciais estão inclusos nos principais grupos de compostos com propriedades antimicrobianas extraídos de plantas.^36,37 Facundo e colaboradores,¹² identificaram também a presença de limoneno e germacreno-D, substâncias reportadas para atividade antimicrobiana, contra bactérias gram-positivas e gram-negativas.^38,39 É provável que as atividades antagônicas observadas no presente estudo se devem a possíveis interações dos constituintes químicos do óleo com os antibióticos. No entanto, novos estudos devem ser realizados para elucidar essas interações e, assim, possivelmente, explicar a diminuição da atividade desses fármacos.

Com base nos resultados alcançados com neste estudo, pode se afirmar que o óleo essencial dos frutos de P. tuberculatum apresentou uma melhor atividade quando associado ao imipenem frente todas as bactérias avaliadas, mostrando ser uma possível alternativa no desenvolvimento de novos fármacos com atividade microbiológica advindos de produtos fitoterápicos.

 

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Recibido: 8 de marzo de 2016.
Aprobado: 31 de enero de 2017.

 

 

Marta Regina Kerntopf. Universidade Regional do Cariri (URCA), Crato-CE, Brasil. Correo electrónico: [e-mail]