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INTRODUCCIÓN
La base fisiopatológica de las enfermedades cardiovasculares es la lesión de la pared vascular, reconocida por la OMS como el problema responsable de la mayor morbilidad y mortalidad entre todas las categorías patológicas en el ser humano.1,2,3,4
La morfofisiología de la pared vascular se caracteriza por un equilibrio entre los factores estructurales y la capacidad de los vasos de responder de forma adecuada ante diferentes estímulos. Frente a determinadas situaciones, como son la influencia de los factores de riesgo cardiovascular (tabaquismo, sedentarismo, hipertensión, hiperlipemias, estrés y diabetes),5 se altera la morfología endotelial y también la vasorreactividad de la pared, lo cual induce a la aparición de adaptaciones fisiológicas en la estructura vascular; si el estímulo permanece, las adaptaciones tisulares progresan hasta el asentamiento de la lesión vascular con sus infalibles consecuencias para la salud.6
Se han realizado muchas investigaciones en humanos, fundamentalmente en etapa postmortem, las cuales, han permitido ampliar los conocimientos sobre la morfología de la lesión de la pared arterial ya instaurada y sus consecuencias.7,8,9) Sin embargo, la investigación sobre el tema es aún insuficiente, por la escasez de trabajos en los estadios precoces o que antecedan al establecimiento de la lesión de la pared vascular.
Los modelos animales proporcionan una valiosa información para comprender los procesos fisiopatológicos de las lesiones de los vasos sanguíneos y sus consecuencias. A lo largo de este siglo se han perfilado diferentes modelos experimentales que han aportado algunas de las claves necesarias para entender este fascinante, complejo y dinámico proceso de adaptabilidad de la vasculatura ante ciertas condiciones; de hecho, constituyen la única vía para desarrollar nuevos métodos de diagnóstico y tratamiento, tanto preventivos como reparadores, antes de aplicarlos a la especie humana.10,11
Existen disímiles trabajos experimentales en aortas de animales donde se describen histológicamente las diferentes etapas en el desarrollo de la lesión vascular; sin embargo, no abundan los estudios relacionados con el proceso previo de adaptación celular morfofisiológica, momento en el cual podrían ser factibles terapias preventivas, sin mucho costo, o la intervención en los programas de salud pública.12,13
Las ratas Wistar se consideran un modelo aceptable para el estudio de las lesiones vasculares, pues presentan gran vulnerabilidad al desbalance metabólico provocado por dieta hiperglucídica, son de fácil manipulación, disponibilidad, y su anatomía, fisiología y bioquímica son semejantes a la de la especie humana.10,14) Con la realización de esta investigación en un modelo animal, se pueden comprender los procesos morfofisiológicos asociados a la ingesta elevada de azúcar, y su repercusión en la pared arterial de la aorta abdominal.
MÉTODOS
El Comité de Ética para la investigación de la Unidad de Toxicología Experimental perteneciente a la Universidad de Ciencias Médicas de Villa Clara aprobó el protocolo de esta investigación. Los modelos biológicos y el alimento fueron adquiridos en el Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Los animales fueron mantenidos en condiciones libre de patógenos, a una temperatura de 22± 2°C y un ciclo de luz / oscuridad de 12x12.
Se utilizaron Rattus norvegicus machos de la línea Wistar. Se formaron dos grupos de 10 animales cada uno. El grupo experimental recibió sacarosa al 35 % como agua de bebida durante 18 semanas además de la dieta estándar para la especie, y el grupo control fue alimentado solamente con dieta estándar. El acceso a la dieta y el agua fue ad libitum. Al concluir el estudio los animales fueron sacrificados con una sobredosis de anestésico seguido de dislocación cervical.
Las muestras de aorta abdominal de 0,5 cm de longitud fueron tomadas inmediatamente después de la eutanasia y conservadas en formol neutro al 10 % durante 24 horas. Luego se procesaron con la técnica clásica de inclusión en parafina.15
Se realizaron cortes seriados transversales y uniformes de cinco micrómetros (μm) en un micrótomo de deslizamiento vertical (Reichert, Austria) para la preparación de las láminas, las cuales, posteriormente, fueron coloreadas con la técnica rutinaria de hematoxilina- eosina y la técnica histoquímica de Verhoeff para fibras elásticas, según los procedimientos descritos para estas técnicas.15,16,17
Se procedió a la realización del examen histológico de la muestra, mediante la observación de los fragmentos de aorta, para la descripción de las capas de la pared arterial en cada lámina, con la utilización de un microscopio ópticobinocular OPTECH (Optical Technology Japan), con ocular 10x y objetivo 4x, 10x y 40x. Las variables registradas fueron: tumefacción endotelial, denudación endotelial, proliferación subendotelial, estado de la lámina elástica interna, organización de las fibras elásticas de la media y vacuolización de la célula muscular lisa vascular.
Para las mediciones se utilizaron las láminas teñidas con la técnica de hematoxilina/eosina y con la técnica de Verhoeff, de manera que se pudieran distinguir con nitidez las láminas elásticas de la pared arterial. La captación de imágenes se efectuó con una cámara digital Canon Power Shot G11 (Japan). Se realizó la digitalización de las observaciones en formato JPG, para su posterior examen morfométrico con el uso del programa de análisis y medición de imágenes Image J versión 1.44p/ Java1.6.0_24.
De cada lámina histológica se eligieron tres cortes. Para la determinación de las áreas se efectuaron 15 mediciones en cada corte de anillo aórtico; se siguió el contorno endotelial del vaso y el de la lámina elástica externa a 40 aumentos (10X ocular y 4X objetivo), para poder encuadrar la sección arterial completa en la fotomicrografía.17 Para la obtención del grosor de la pared se realizaron 10 mediciones que siguieron el trayecto de líneas rectas trazadas desde la lámina elástica interna hasta la lámina elástica externa a 400 aumentos (10X ocular y 40X objetivo) en cuatro fotomicrografías tomadas de la pared arterial.
Las variables morfométricas registradas fueron:
Grosor de la túnica media: (GTM) Se utilizaron las láminas teñidas con la técnica de Verhoeff y objetivo de 40x. Se definió como la distancia, expresada en micrómetros (μm), delimitada por la lámina elástica externa y la lámina elástica interna. Se realizaron 40 mediciones para cada anillo aórtico.
Área de la luz del vaso: (AL) Se utilizaron las láminas teñidas con hematoxilina-eosina o con la técnica de Verhoeff y objetivo de 40x. Se definió como el área, expresada en milímetros cuadrados (mm2), delimitada por el contorno endotelial. Se realizaron 15 mediciones para cada anillo aórtico.
Área total del vaso: (AT) Se utilizaron las láminas teñidas con hematoxilina-eosina o con la técnica de Verhoeff y objetivo de 40x. Se definió como el área, expresada en mm2, delimitada por el contorno de la lámina elástica externa. Se realizaron 15 mediciones para cada anillo aórtico.
Área de la túnica media vascular: (AM) Parámetro obtenido mediante la diferencia del área total y del área de la luz del vaso, expresado en mm2.
Cociente media/lumen: (Cociente M/L) (Cociente M/L = AM/AL) Parámetro obtenido del cociente entre el área de la túnica media y el área de la luz.
El procesamiento estadístico se realizó con el apoyo informático del paquete SPSS Statistics 20.0 (SPSS Inc, Chicago,IL, EE.UU.). Para las variables cualitativas los resultados se expresaron como frecuencia relativa, y para la comparación entre grupos se aplicó la Prueba de Homogeneidad Ji cuadrado (2. Una probabilidad menor de 5 % (p<0,05) fue considerada estadísticamente significativa. En el caso de las variables cuantitativas los resultados se expresaron como la media y la desviación estándar. Previa comprobación del cumplimiento de la distribución normal de estas variables mediante el test de Shapiro-Wilk, se realizaron las comparaciones estadísticas y se aplicó una prueba t de Student para variables independientes.
RESULTADOS
La Figura 1 muestra un fragmento de aorta abdominal de un animal del grupo control procesado por la técnica clásica de hematoxilina/eosina, donde se observa el estado de conservación e integridad de cada una de las capas arteriales.
La frecuencia de observación de las variables histológicas de los fragmentos de aorta abdominal de cada caso, expresada en porciento, se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1 Variables histológicas en los grupos de ensayo.
*Prueba de Homogeneidad Ji cuadrado (2 p(0,05
Leyenda: TE: tumefacción endotelial, DE: denudación endotelial, PSE: proliferación subendotelial, LEIF: lámina elástica interna fragmentada, FEMD: fibras elásticas de la media desorganizadas, y VCMLV: vacuolización de la célula muscular lisa.
Se observó una discreta tumefacción endotelial en un 90 % de los animales del grupo experimental, y en algunos casos estuvo presente adhesión leucocitaria, lo cual es un signo de daño intimal (Figura 2). En los animales del grupo control no se evidenció la presencia de tumefacción endotelial en ningún caso.
La denudación endotelial solo fue observada en un caso del grupo experimental, confirmándose que no existen diferencias significativas entre el grupo control y el grupo experimental. La proliferación subendotelial se presentó en cuatro casos (40 %) del grupo experimental, lo que es insuficiente para encontrar diferencias estadísticamente significativas entre los grupos analizados. Solo tres casos pertenecientes al grupo experimental manifestaron fragmentación de la lámina elástica interna.
La orientación que mostraron las fibras elásticas de la media arterial, indica que todos los casos examinados del grupo experimental presentaron desorganización; no ocurrió así en el grupo control donde el 100 % presentó una disposición organizada de las fibras elásticas arteriales (Figura 3).
Los resultados estadísticos demuestran diferencias significativas entre el grupo control y el grupo experimental en cuanto a la presencia de vacuolización de la célula muscular lisa de la pared del vaso. Esta variable se observó en los 10 casos (100 %) del grupo que recibió la dieta hiperglucídica (Figura 4).
Los estadísticos descriptivos de las variables morfométricas estudiadas en la pared arterial de la aorta abdominal de las ratas Wistar del grupo control y del grupo experimental, se reflejan en la Tabla 2. Al comparar ambos grupos se constató que existen diferencias significativas solo en las variables morfométricas: grosor de la túnica media y cociente media/lumen. Las medias determinadas para ambas variables mostraron valores superiores en el grupo experimental con respecto al grupo control.
Tabla 2 Estadísticos descriptivos de las variables morfométricas en la pared arterial de la aorta abdominal de los grupos control y experimental. Los valores se expresan como la Media ± DE.
Leyenda: GTM: grosor de la túnica media, AT: área total del vaso, AL: área de la luz del vaso, AM: área de la túnica media vascular, cociente M/L: cociente media/lumen, p: probabilidad estadística para un 95 % de confianza.
DISCUSIÓN
El edema celular es la primera manifestación morfológica de casi todas las formas de daño celular. El aspecto tumefacto se revela debido a la aparición de vacuolas claras en el citoplasma, correspondientes a fragmentos de retículo endoplásmico distendidos y escindidos. Las causas relacionadas con este tipo de daño van desde la privación de oxígeno, la agresión por agentes físicos y químicos hasta desequilibrios nutricionales.18
El endotelio, debido a su localización estratégica, constituye un blanco para los estímulos provenientes del medio. La ingestión elevada y sostenida en el tiempo de dietas ricas en azúcares promueve la aparición de desórdenes metabólicos como la hiperglucemia y la resistencia a la insulina, los cuales son factores de riesgo que actúan sobre el endotelio vascular. En condiciones de hiperglucemia ocurre un incremento de los productos finales de la glucosilación (AGEs), los cuales, al reaccionar con el oxígeno, conducen a la formación de radicales libres. Esta situación desencadena el estrés oxidativo, que a su vez conduce al daño tisular endotelial a través de sus acciones proinflamatorias y a la disfunción endotelial. Como consecuencia se producen alteraciones estructurales en el endotelio que incluso comprometen la supervivencia celular, al involucrar procesos celulares apoptóticos y necróticos en su sistema.19,20,21
La denudación endotelial consistente en la pérdida de células endoteliales focalizadas o en zonas extensas de la superficie intimal (esto solo se observó en uno de los animales del grupo experimental). Dicho resultado coincide con el obtenido por Buitrago L y colaboradores, aunque las especies de animales y el estímulo agresor fueran diferentes.22 Por otra parte, Batista AH y colaboradores describieron zonas extensas de denudación endotelial en la íntima de conejos tratados con dieta hipercolesterolémica, los cuales también habían desarrollado lesiones ateroscleróticas.13) Hoy se conoce que en el ser humano las lesiones ateroscleróticas en sus diferentes estadios de progresión no están acompañadas, necesariamente, por la denudación endotelial.18
La presencia de proliferación subendotelial se apreció de manera discreta, como mínimos engrosamientos a ese nivel de la íntima, en pequeñas áreas de aortas de ratas sometidas a la dieta hiperglucídica. En la revisión de trabajos publicados de estudios en animales de experimentación, se observó que la proliferación subendotelial marcada estaba presente en las arterias de los animales, que bajo diferentes estímulos, tenían un desarrollo ya establecido de la lesión aterosclerótica.23,24
Las enfermedades vasculares, con un progreso que conlleva a la oclusión de la luz por remodelación o adaptación celular (hipertrofia e hiperplasia) de los componentes de la pared, se relacionan con la perturbación en la organización de las fibras elásticas en estos vasos.25,26
Los trastornos metabólicos relacionados con la hiperglucemia, la resistencia a la insulina y el hiperinsulinismo resultante, están asociados a la generación del estrés oxidativo y a la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS) por el depósito de productos de glucosilación avanzados (AGEs). Estos elementos favorecen mecanismos de cambio en el tropismo de las células musculares lisas vasculares que determinan un aumento en su proliferación, migración y actividad sintética. También se modifica el contenido de la matriz extracelular subyacente, incrementándose el colágeno sobre la elastina. Esta situación influye en el remodelado de la pared e intervienen en el desarrollo de la injuria vascular.27,28
En el presente estudio la vacuolización de la célula muscular lisa vascular se observó en todos los casos del grupo experimental. Sin embargo, no se puede determinar si la naturaleza de estas vacuolas es hidrópica, glucogénica o lipídica, pues no se realizaron técnicas especiales contempladas en estudios posteriores.
El análisis de las variables morfométricas reveló diferencias significativas en el grosor de la túnica media y el cociente media/lumen. Norouzi L y colaboradores estudiaron la influencia del etanol sobre la pared arterial de ratas Wistar machos y constataron morfométricamente variaciones en el grosor de la pared arterial que se relacionaban con modificaciones en las fibras elásticas de la media y las células musculares lisas vasculares.29) En estos casos, los autores demostraron la existencia de remodelado en la pared media de las aortas de los animales estudiados, basándose en las observaciones histológicas y los datos morfométricos registrados.
Los cambios celulares que se producen en las estructuras vasculares dependen, en gran medida, de los factores dependientes del estímulo agresor, del tiempo de exposición a este, y de la capacidad de respuesta tisular para enfrentar la agresión. Los procesos adaptativos iniciales demostrados en esta investigación constituyen un requisito para el desarrollo y progreso de las lesiones celulares aterogénicas irreversibles en la pared arterial.
