Instituto Nacional de Endocrinología

Metilación del receptor de la hormona estimulante del tiroides: marcador  diagnóstico de malignidad en cáncer de tiroides

Lic. María Teresa Marrero Rodríguez1

Resumen

Se analizó el estado de metilación del promotor del gen para el receptor de la hormona estimulante del tiroides (TSH) en el diagnóstico de tumores tiroideos de origen epitelial. El estudio se realizó en tejido tiroideo obtenido de bloques de  parafina de diferentes patologías tiroideas (carcinoma  papilar, folicular e indiferenciado, y adenomas foliculares). El trabajo se realizó empleando la técnica de modificación del ADN con bisulfito de sodio y el análisis del estado de la metilación del gen RTSH se realizó por el método de reacción en cadena de la polimerasa específica para metilación. Encontramos metilación del promotor para el gen del receptor de TSH en los carcinomas papilares (33 de 40; 82,5 %), en los 10 carcinomas indiferenciados (100 %) y en 10 de los 15 carcinomas foliculares analizados (66,6 %). En cambio, no se observó metilación en los  8 adenomas foliculares analizados. Se propone la metilación del gen para el receptor de TSH como un nuevo marcador diagnóstico de malignidad, y una base para emplear agentes desmetilantes conjuntamente con la terapia con radioyodo, en los pacientes con cáncer de tiroides de origen epitelial que no respondan a la terapia.

Palabras clave: Metilación, gen, ADN, cáncer de tiroides.

Introducción

El cáncer de tiroides representa el 1 % de todos los tipos de cáncer y es el más común entre las neoplasias endocrinas. Histológicamente los tumores tiroideos de origen epitelial se clasifican en: cáncer tiroideo papilar (CP), cáncer tiroideo folicular (CF) y cáncer tiroideo anaplásico o indiferenciado (CA), con una frecuencia del 80, 15 y 2,5 % respectivamente.1

La principal función de la glándula tiroides es la captación y concentración de yodo para la síntesis de las hormonas tiroideas. Este proceso involucra la participación de moléculas claves expresadas específicamente en las células foliculares de la glándula, entre las cuales se encuentran el transportador de yodo (NIS), la tiroglobulina (Tg), la tiroperoxidasa (TPO) y la TSH, cuya principal función es la de regular la síntesis y secreción de las hormonas tiroideas, a través de la unión a su receptor,2 un miembro de la familia de receptores de las hormonas glicoproteicas, perteneciente a la superfamilia de receptores de membrana  acoplados a la proteína G.

La expresión de estos genes específicos del tiroides, incluyendo el receptor de TSH (RTSH), se encuentra frecuentemente perdida en los tumores malignos, resultando en una disminución  de la capacidad de estas células para concentrar yodo.3 Consecuentemente, no hay respuesta a la terapia con yodo radioactivo, y es esta una de las principales causas de morbimortalidad relacionada con el cáncer de tiroides.4,5

La metilación juega un importante rol en el proceso de tumorigénesis, incluyendo la tumorigénesis tiroidea. Muchos genes supresores de tumores, así como genes específicos del tiroides como el RTSH se encuentran metilados en el cáncer de tiroides, que conducen a un inapropiado silenciamiento de los mismos, sugiriendo el papel  de este evento epigenético en el desarrollo temprano de la transformación maligna,6 por lo que determinar el estado de metilación del promotor del gen para el RTSH en el diagnóstico de tumores tiroideos de origen epitelial sería de mucha utilidad para mejorar el diagnóstico de este tipo de tumor.

Métodos

Para realizar el estudio se utilizó tejido tiroideo humano obtenido  de 73 bloques de parafina de diferentes patologías tiroideas (40 carcinomas papilares, 15 foliculares, 10 carcinomas anaplásicos y 8 adenomas foliculares), donados por el Departamento de Anatomía Patológica del Instituto Nacional de Cancerología de México. Cada bloque fue examinado por el patólogo para confirmar el diagnóstico de las diferentes patologías, y marcados para la lesión de interés. Se realizaron secciones de 30 micras de espesor de cada bloque, para posteriormente realizar la extracción del ADN.

El ADN genómico se obtuvo de tejido incluido  en bloques de parafina de acuerdo con la  metodología siguiente:

1. Obtener cortes de 30 micras de grosor. Colocar 3 cortes en un tubo eppendorf de 1,5 para microcentrífuga.
2. Desparafinar con 500 µL de n-octano. Agitar en vórtex.
3. Incubar 30 min a 50 °C.
4. Centrifugar a 12 000 rpm por 3 min. Eliminar el sobrenadante.
5. Repetir los pasos 2, 3 y 4.
6. Lavar el pellet con 500 µL de etanol absoluto, centrifugar a 12 000 rpm durante 3 min. Eliminar el sobrenadante.
7. Repetir el lavado 2 veces más.
8. Lavar con 500 µL de etanol al 70 %, centrifugar a 12 000 rpm durante 3 min y eliminar el sobrenadante.
9. Repetir el lavado.
10. Secar el  pellet a 50 °C.
11. Resuspender el pellet  en 300 µL de buffer de lisis.
12. Incubar de 2 a 3 h a 55 °C.
13. Inactivar con proteinaza a 90 °C durante 10 min.
14. Centrifugar a 12 000 rpm por 10 min.
15. Resuspender el sobrenadante y cuantificar con espectrofotómetro.
16. Guardar a -20 °C.

Modificación del ADN con bisulfito de sodio:

Se diluyó 1 µg de ADN genómico en 50 µL de agua, y se desnaturalizó durante 10 min con 5 µL de NaOH 3M a 42 ºC. Posteriormente el ADN fue incubado en la oscuridad durante 13 h a 55 °C en una mezcla de reacción que contenía 30 µL de hidroquinona 10 mM y 520 µL de bisulfito de sodio 3,9 M  pH 5,0. El ADN modificado fue purificado en una resina  Wizard, se desnaturalizó con 5 µL de NaOH 3M durante 5 min a 37° C, inmediatamente se neutralizó y se precipitó con 5 µL de acetato de amonio 3M y 500 µL de etanol absoluto durante 2 h a -20 °C. Finalmente se centrifugó 30 min a 13 000 rpm, se lavó con etanol 70 %, se secó por vacío, y se resuspendió en 50 µL de agua libre de nucleasa, conservándose a -20 °C.

El tratamiento del ADN genómico con bisulfito de sodio, tiene por finalidad convertir las citosinas no metiladas en uracilo, los que serán convertidos a timina durante la reacción de cadena de la polimerasa (PCR). Usando iniciadores específicos para secuencias metiladas M y no metiladas U, es posible discriminar entre citosinas metiladas y  no metiladas en las diferentes muestras analizadas.

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) específica para metilación:

El estado de metilación de la región promotora del gen RTSH en las muestras de ADN modificado de las diferentes patologías tiroideas y ADN control fueron analizados por PCR específica para metilación. La mezcla de la reacción  contenía aproximadamente 200 ng de ADN modificado, 2 µL de buffer 10X, 2 µL de MgCl2 (25 mM), 2 µL de  deoxinucleótidos trifosfatos (dNTPs) (2 mM), 0,2 µL de cada iniciador de la reacción para RTSH desmetilado (UM) y RTSH metilado (M), cuya secuencias se indican en la tabla 1, y  0,1 µL de la enzima ADN polimerasa (taq gol) para un volumen final de reacción de 20 µL. Como control positivo de metilación se utilizó ADN genómico de las líneas celulares W480 y Caski metilado.

Tabla 1. Resumen de las secuencias de cada iniciador de la reacción para RTSH metilado y desmetilado

Iniciadores de la reacción	Secuencias
Para RTSH desmetilado	5’-CACCAACTACAACAAATCCACCA-3’ (antisentido)               5’-TGTAGAGTTGAGAATGAGGTGATTTT-3’ (sentido)
Para RTSH metilado	5’-CAACTACAACAAATCCGCCG-3’    (antisentido)                        5’-TGTAGAGTTGAGAATGAGGTGATTTC-3’ (sentido)

Las condiciones de la reacción fueron las siguientes: desnaturalización inicial 94 ºC por 10 min, seguido por 35 ciclos de amplificación (40 s a 94 ºC, 40 s a 58 º C y 40 s a 72 ºC), y una elongación final de 7 min a 72 ºC.

Los productos de PCR fueron separados en un gel de agarosa al 2 %, teñido con bromuro de etidio y visualizados en luz UV. Mediante esta visualización se pudo comprobar el estado de metilación del gen para el RTSH de cada patología analizada.

Resultados

Se observó metilación de la región promotora del gen para el RTSH en los carcinomas papilares (CP) (82,5 %), de igual forma se observó el mismo patrón de metilación en los carcinomas anaplásicos (CA) (100 %) y en los carcinomas foliculares (CF) analizados (66,6 %), a diferencia de los adenomas foliculares  (AF), que mostraron una desmetilación completa de la región promotora del gen para el  RTSH  (figura y tabla 2).

FIG. Estado de metilación para el gen del RTSH en los diferentes tipos de patologías tiroideas analizadas. Carril M, indica positivo para metilación, carril UM, positivo para no metilado.

Tabla 2. Resultados de la metilación del gen para el RTSH en las diferentes patologías estudiadas          

Tipo de tumor	(Metilado/total)	% metilación
Adenoma folicular	0/8	0
Carcinoma folicular	10/15	66,6
Carcinoma papilar	33/40	82,5
Carcinoma anaplásico	10/10	100

Discusión

La metilación del ADN es un proceso epigenético que participa  en la regulación de la expresión génica.6,7 Los genomas de las células preneoplásicas, neoplásicas  y envejecidas comparten cambios importantes en los niveles de metilación, que constituyen eventos tempranos en el desarrollo de algunos tumores, entre los que se encuentran, la inhibición  de la trascripción, con la consecuente pérdida de  la expresión de genes constitutivos e individuales  y de  genes supresores de tumores.8-16

Mingzhao Xing y otros en 200317 observaron metilación de la región promotora del RTSH en tumores tiroideos humanos y en diferentes líneas celulares18-22  con resultados similares a los encontrados en este trabajo. En   los estudios realizados por Ikuyama y otros23 en líneas celulares  de ratas observaron que las células FRTl-5  expresaban niveles normales del gen  RTSH, sin embargo, la línea celular FRT (línea tumoral) no lo expresaba. Demostraron, igualmente, que la transformación oncogénica de las células  FRTl-5  conducía a la pérdida de la expresión del gen para el RTSH, así como que la pérdida de la expresión de este gen ocurre solamente en células tiroideas malignas.24 Estos resultados coinciden con los obtenidos en este estudio.

En recientes estudios realizados con el transportador de yodo (NIS) fue también encontrada la  no  expresión  de  esta proteína y del RTSH en cánceres tiroideos de origen epitelial,5 y la metilación del RTSH y del (NIS) fue encontrada en ambos estudios. Resulta interesante que el mismo estudio también demostró la restauración funcional de la expresión del transportador de yodo por el tratamiento de las células con agentes desmetilantes.

En resumen, los resultados de este trabajo demostraron  metilación del gen RTSH en cáncer tiroideo de origen epitelial,  como una de las vías moleculares del silenciamiento de este gen en  cáncer de tiroides. Debido a que la metilación del gen RTSH no es vista en los adenomas benignos, la metilación del gen RTSH puede ser usado como un nuevo marcador diagnóstico de malignidad para distinguir lesiones benignas de malignas, sobre todo, en el diagnóstico del CF, en el que no existe un patrón citológico para su diagnóstico prequirúrgico, y constituye hoy día uno de los principales problemas de la biopsia de tiroides.

Además, tomando en cuenta que la metilación es un proceso reversible, es preciso comenzar a  diseñar estrategias terapéuticas encaminadas al uso de agentes desmetilantes para la restauración de la expresión de estos genes,  y así  aumentar  la capacidad de la células tiroideas para concentrar yodo radioactivo en respuesta a la estimulación de la TSH en los pacientes con cáncer de tiroides que no respondan a la terapia.

abstract

Methylation of the thyroid stimulating hormone receptor: diagnostic marker of malignity in thyroid cancer

The methylation state of the gene promoter for the receptor of the thyroid stimulating hormone (TSH) in the diagnosis of thyroid tumors of epithelial origin was analyzed. The study was conducted in thyroid tissue obtained from paraffin blocks of different thyroid pathologies (papillary, follicular and undifferentiated carcinoma and follicular adenomas). The work was done by using the DNA modification technique with sodium bisulfite, and polymerase chain reaction was applied to analyze the gene methylation state. Methylation of the promoter for the gene of the TSH receptor was found in the papillary carcinomas (33 of 40; 82.5 %), in 10 undifferentiated carcinomas (100 %), and in 10 of the 15 follicular carcinomas analyzed (66.6 %). No methylation was observed in the 8 follicular adenomas under study. The methylation of the gene for the TSH receptor was proposed as a new diagnostic marker of malignity and as a basis for using demethylating agents together with radioiodine therapy in patients with thyroid cancer of epithelial origin that do not respond to therapy. 

Key words: Methylation, gene, DNA, thyroid cancer.

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Recibido: 2 de noviembre de 2007. Aprobado: 6 de diciembre de 2007.
Lic. María Teresa Marrero Rodríguez. Instituto Nacional de Endocrinología. Calle Zapata y D, Vedado, municipio Plaza, Ciudad de La Habana. Cuba. E mail: [e-mail]

1Licenciada en Biología. Investigadora Agregada del Instituto Nacional de Endocrinología.