Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología

Identificación y caracterización de bacilos gramnegativos no fermentadores aislados en el medio hospitalario

Dra. Sara C. Esnard Bolaños¹ y Téc. Olvido E. Díaz Rosa²

RESUMEN

Se estudió un total de 251 cepas aisladas en el medio hospitalario con diagnóstico presuntivo de bacilos gramnegativos no fermentadores, enviadas por los Laboratorios de Infecciones Nosocomiales de los Centros Provinciales de Higiene y Epidemiología de Ciudad de La Habana, Santiago de Cuba, Holguín, Guantánamo, Camagüey e Isla de la Juventud desde septiembre de 1992 hasta junio de 1993. Se empleó un esquema inicial para corroborar el diagnóstico primario de estas cepas, los medios de producción de pigmentos King A y King B para la identificación de Pseudomonas aeruginosa y pruebas bioquímicas claves para el diagnóstico microbiológico de otros no fermentadores, se utilizó la piocinotipia y la serotipia para la caracterización posterior de la especie aeruginosa. Resultaron confirmadas 238 cepas y de ellas, el 88,23 % correspondió a la especie aeruginosa cuyos piocinotipo y serotipo predominantes fueron al 10a y 011, respectivamente. Otros bacilos encontrados con frecuencia fueron Pseudomonas cepacia (25 %); Pseudomonas fluorescens (17,8 %) y Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus 17,8 %.

Descriptores DeCS: PSEUDOMONAS AERUGINOSA/aislamiento & purificación; PSEUDOMONAS CEPACIA/aislamiento & purificación; PSEUDOMONAS FLUORESCENS/aislamiento & purificación, ACINETOBACTER CALCOACETICUS/aislamiento & purificación; PSEUDOMONAS AERUGINOSA/clasificación; PSEUDOMONAS CEPACIA/clasificación; PSEUDOMONAS FLUORESCENS/clasificación; ACINETOBACTER CALCOACETICUS/clasificación; SEROTIPIFICACION/métodos; MICROBIOLOGIA AMBIENTAL.

Con el término de bacilos gramnegativos no fermentadores (BNF), se designa un heterogéneo grupo de microorganismos que constituye, aproximadamente, el 15,0 % de todos los aislamientos en los laboratorios de microbiología clínica, se comportan como típicos patógenos oportunistas y actualmente han cobrado notoria importancia por su incidencia en infecciones hospitalarias; se destaca en estos casos el hallazgo de especies como Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus, Pseudomonas maltophilia, Pseudomonas cepacia y Pseudomonas putida.1-3

La identificación de BNF ocasiona numerosa dificultades en los laboratorios, ya que estos gérmenes resultan, con frecuencia, inertes para la mayoría de las pruebas bioquímicas corrientemente usadas para el diagnóstico bacteriológico.2

En las últimas décadas se han descrito varios procedimientos para identificar estos microorganismos mediante métodos convencionales,2-5 con nuevas pruebas bioquímicas,6 por ensayos de bacteriología analítica,7 mediante procesos que involucran al genoma bacteriano8 o con el empleo de sistemas diagnósticos comerciales como: Oxi-FERM, API 20E, API 20NE, NF-System, MINITEX, Micro ID y R/B Enteria, entre otros.4

Entre los métodos convencionales revisados, se destacan el de Hugh y Gilardi3 y el aportado por Silva,2 quien seleccionó un grupo de pruebas bioquímicas claves que permiten su identificación y clasificación, ya sea al nivel genérico o al específico.

En nuestro país aún se conoce poco sobre la incidencia de BNF en el medio hospitalario, se exceptúa la especie Pseudomonas aeruginosa que ha sido objeto de algunos estudios9-12 (GA Galloso. Tipaje de Pseudomonas aeruginosa por bacteriófagos y piocinas en un hospital clinicoquirúrgico de Ciudad de La Habana [Tesis para optar por el título de Especialista de I Grado en Microbiología], Ciudad de La Habana, 1987), por lo que la identificación y caracterización de BNF planteada en este trabajo pretende constituir un aporte al conocimiento sobre la ocurrencia de estos gérmenes en unidades de salud de varias provincias del país, mediante el empleo de una metodología de trabajo para el diagnóstico microbiológico de estas bacterias, y de 2 métodos de tipificación de reconocida utilidad para Pseudomonas aeruginosa.

MÉTODOS

El universo de trabajo estuvo constituido por un total de 251 cepas con diagnóstico presuntivo de BNF aisladas en unidades de salud de Ciudad de La Habana, Santiago de Cuba, Holguín, Guantánamo, Camagüey e Isla de la Juventud, enviadas al Laboratorio de Referencia del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología (INHEM) desde los laboratorios de infecciones nosocomiales de los respectivos centros provinciales de higiene y epidemiología.

El estudio inicial se realizó mediante la siembra de las cepas problema en placas de agar sangre y agar Mac. Conkey, se testó a partir del crecimiento obtenido en las primeras, la actividad citocromo oxidasa; y se comprobó la presencia o ausencia de crecimiento en el agar Mac. Conkey, del cual se inocularon cuñas de agar hierro de Kligler para corroborar la imagen característica de los organismos no fermentadores, y los medios motilidad y OF glucosa abier to/cerrado según esquema sugerido por Hugh y Gilardi.3

A las cepas que resultaron ser móviles, oxidasa positivas y demostraron acidificación oxidativa de la glucosa, se les aplicó el esquema de King y Philips5 para el diagnóstico de Pseudomonas aeruginosa basado en el empleo de los medios para la producción de pigmentos King A y King B.

Para el caso de las cepas King A negativas y King B positivas, se empleó la prueba del crecimiento a 42 0C, que permitió diferenciar la especie aeruginosa de Pseudomonas putida y Pseudomonas fluorescens, miembros también del grupo fluorescente.

Para el diagnóstico microbiológico de otros BNF, se utilizaron las pruebas bioquímicas claves descritas por Silva2 para su identificación genérica y específica.

Todas las cepas diagnosticadas como Pseudomonas aeruginosa fueron caracterizadas mediante la piocinotipia según el método de Fyfe y otros13 y serotipadas por aglutinación en lámina con el empleo de antisueros somáticos producidos en el Laboratorio de Pseudomonas del INHEM, que responden a los 17 antígenos reconocidos en el Esquema Internacional de Tipificación Antigénica (IATS) para este microorganismo.

RESULTADOS

De las 251 cepas recibidas con diagnóstico presuntivo de BNF, resultaron confirmadas como tal 238 (94,8 %) y 13 no (5,17 %). El esquema de King y Phillips5 empleado demostró la presencia de 210 cepas de Pseudomonas aeruginosa en el total estudiado (88,23 %); de ellas, 196 expresaron pigmentos en los medios King A y King B y 8 resultaron "apiocianogénicas" (3,3 %). En 6 cepas (2,5 %), se obtuvo una respuesta positiva solamente a la producción de pioverdina. Una respuesta negativa a la producción de ambos pigmentos fue encontrada en 28 cepas (11,7 %), las que clasificaron en calidad de "otros BNF" (tabla).

TABLA. Resultados del comportamiento de las cepas estudiadas frente a los medios King A y King B

Comportamiento	No. de cepas	%	Especie diagnosticada
King A positivo	196	82,3	Pseudomonas aeruginosa
King B positivo
King A negativo	8	3,3	Pseudomonas aeruginosa
King B positivo	6	2,5	Pseudomonas fluorescens o Pseudomonas putida
King A negativo	28	11,7	"Otros BNF"  King B negativo

 n = 238.

En la figura 1 se presentan las especies de otros bacilos gramnegativos no fermentadores hallados al aplicar las pruebas descritas por Silva,2 las de mayor ocurrencia fueron Pseudomonas cepacia (25 %), Pseudomonas fluorescens (17,8 %) y Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus (17,8 %).

FIGURA 1. Otras especies de BNF encontradas mediante las pruebas descritas por Silva (n=28).

Los piocinotipos de Pseudomonas aeruginosa predominantes son descritos en la figura 2, encabezados por el 10 (58,7 %). En general, en las 210 cepas caracterizadas por piocinotipia se obtuvo 99,04 % de tipabilidad.

FIGURA 2. Piocinotipos de Pseudomonas aeruginosa más frecuentes (n=208).

El subtipaje efectuado a todas las cepas pertenecientes a este tipo evidenció la supremacía del subtipo a (43,0 %) (figura 3). Tanto en los resultados de la lectura del tipaje como en la del subtipaje, aparecieron patrones atípicos.

FIGURA 3. Subtipos de Pseudomonas aeruginosa asociados al piocinotipo 10 (n=121).

Como serotipos somáticos individuales aparecieron en orden de prioridad el O11, el O2a y el O6 (figura 4). La aplicación de este método de serotipaje ofreció 95,23 % de tipabilidad.

FIGURA 4. Serotipos de Pseudomonas aeruginosa de mayor ocurrencia (n=200).

DISCUSIÓN

De los esquemas mencionados para el diagnóstico microbiológico de BNF, los más frecuentemente empleados son los convencionales o tradicionales, con la consecuente aplicación de criterios operativos preliminares que posibiliten al menos una ubicación primaria a su condición de no fermentadores y una aproximación tentativa a su clasificación genérica. En este trabajo constatamos la importancia y necesidad de un estudio previo a la ejecución de pruebas adicionales para la completa identificación de este grupo bacteriano.

El método utilizado para el diagnóstico de la especie aeruginosa resultó eficaz. Además, los medios de pigmentación King A y B permitieron ubicar dentro del grupo fluorescente a aquellas cepas que no demostraron la producción de piocianina u otros pigmentos fenacínicos, y sí de pioverdina; así como clasificar al resto de las cepas dentro de la categoría de "otros BNF".

La detección de cepas apiocianogénicas puede producirse en 10 ó 20 % de las aisladas en el medio hospitalario;1 sin embargo, en este estudio solamente fue reportado como tal el 3,8 % del total de Pseudomonas aeruginosa diagnosticado.

Las pruebas bioquímicas claves empleadas para los "otros BNF" resultaron de gran utilidad, al llegar a su identificación genérica y específica con el empleo de un reducido número de medios de cultivo, ya que muchos de ellos formaron parte del diagnóstico microbiológico de varias especies, esto repercute en el ahorro de sustratos y tiempo de trabajo.

En este estudio reportamos la incidencia de Pseudomonas cepacia en 25 %; especie que aparece descrita también por García Pérez entre las más frecuentes (AL García Pérez. Identificación de especies del género Pseudomonas por el método Gilardi [Trabajo para optar por el título de Especialista de I Grado en Microbiología], Ciudad de La Habana, 1990). Esta bacteria se considera un importante contaminante hospitalario, se encuentra en fuentes de agua, soluciones, instrumental variado, nebulizadores y aun en agua destilada. Los catéteres venosos y urinarios, así como los sistemas de hemodiálisis han sido también el origen de infecciones nosocomiales a partir de fuentes contaminadas por este organismo.2

En cuanto al hallazgo reportado para Pseudomonas fluorescens, es importante destacar que este germen es considerado igualmente como un típico patógeno oportunista para el hombre, se encuentra en el medio hospitalario como contaminante de fuentes de agua, soluciones acuosas de amonio cuaternario, estanques y suelos, entre otros.2,3

Sobre la presencia del Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus, bacteria asociada intrahospitalariamente con reservorios ambientales, y que se suele describir como un comensal no patógeno, su aislamiento en unidades de salud no debe ser menospreciado, ya que es capaz de causar infecciones de importancia clínica al nivel del tracto respiratorio inferior, bacteremias y meningitis.14,15 En este trabajo se demostró el predominio de Pseudomonas aeruginosa sobre "otros BNF" encontrados, en coincidencia con los resultados alcanzados por García Pérez (1990, segundo documento inédito citado).

El método de piocinotipia empleado, resultó de gran utilidad para la caracterización de Pseudomonas aeruginosa y se encontró entre los recomendados por Pitt16 para el tipaje de este microorganismo con fines epidemiológicos. En cuanto a la frecuencia de aparición de piocinotipos, se destacó la del 10a, localizado fundamentalmente en cepas provenientes de la provincia de Santiago de Cuba, constituyó el de mayor circulación en este territorio, al menos en el período estudiado. Esta presencia mayoritaria del piocinotipo 10 ya había sido reportada anteriormente en nuestro país10,11 (GA Galloso, 1987, primer documento inédito citado). La ocurrencia de piocinotipos atípicos ha sido referida también por autores cubanos y extranjeros9-11,17 (GA Galloso, 1987, primer documento inédito citado).

La tipificación serológica realizada permitió alcanzar un porcentaje de tipabilidad acorde con el referido por Pitt para este método. Coincidiendo con resultados anteriormente obtenidos en el INHEM11 (AL García Pérez, 1990, segundo documento inédito citado) el serotipo predominante fue el O11, por lo que, si se considera el criterio de Pitt acerca de la posible distribución geográfica de tipos somáticos individuales, bien pudiéramos asociar este serotipo con nuestro país, detalle que se debe considerar, sobre todo a la hora de seleccionar cepas vacunales.

Los resultados obtenidos en este estudio reiteraron la circulación en nuestro medio hospitalario de gérmenes pertenecientes a este heterogéneo grupo bacteriano, que constituyen indudablemente agentes biológicos de riesgo para la salud humana y sobre los que debe mantenerse una vigilancia microbiológica adecuada.

Se puede concluir que:

1. La metodología utilizada para el diagnóstico microbiológico y caracterización de BNF aislados en el medio hospitalario resultó factible, adecuada y permitió alcanzar este objetivo.
2. Se destacó la circulación predominante del piocinotipo 10a de Pseudomonas aeruginosa específicamente en la provincia de Santiago de Cuba, se reiteró, además, la ocurrencia mayoritaria del serotipo O11 en el total de cepas estudiadas de este microorganismo.

SUMMARY

A total number of 251 strains isolated from a hospital environment with the presumptive diagnosis of non-fermenting gram-negative bacteria was studied. The strains were sent by Laboratories of Nosocomial Infections from the Provincial Centers of Hygiene and Epidemiology of Havana City, Santiago de Cuba, Holguín, Guantánamo, Camagüey, and the Isle of youth from September 1992 to June 1993. An initial scheme to corroborate the primary diagnosis of these strains was employed, as well as the production means of pigments King A and King B for the identification of Pseudomonas aeruginosa and biochemical tests for the microbiological diagnosis of other non-fermenting germs. Pyocin typing and serotyping were used for the characterization of the aeruginosa specimen. A number of 238 strains was confirmed and of them, 88.23 % corresponded to aeruginosa specimen whose predominant pyocin type and serotype were 10a and O11, respectively. Other bacilli frequently found were Pseudomonas cepacia (25 %); Pseudomonas fluorescens (17.8 %), and Acinetobacter calcoaceticus var. anitratus (17.8 %).

Subject headings: PSEUDOMONAS AERUGINOSA/isolation & purification; PSEUDOMONAS CEPACIA/isolation & purification; PSEUDOMONAS FLUORESCENS/isolation & purification; ACINETOBACTER CALCOACETICUS/isolation & purification; PSEUDOMONAS AERUGINOSA/classification; PSEUDOMONAS CEPACIA/classification; PSEUDOMONAS FLUORESCENS/classification; ACINETOBACTER CALCOACETICUS/classification; SEROTYPING; ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY.

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Recibido: 21 de diciembre de 1995. Aprobado: 8 de mayo de 1996.

Dra. Sara C. Esnard Bolaños. Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología. Infanta No. 1158 entre Llinás y Clavel, Centro Habana, Ciudad de La Habana 10 300, Cuba.
 

¹ Doctora en Ciencias Biológicas. Investigadora Agregada.
² Técnico A en Laboratorio Sanitario.