Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología

Conservación bacteriana por método simple a temperatura ambiente: una alternativa viable

Lic. Zulia Weng Alemán,1 Dra. Raquel de los Ángeles Junco Díaz,2 Téc. Olvido Esther Díaz Rosa,3 Téc. Inalvis Álvarez Molina,4 José Ramón Beltrán Díaz3 y Téc. María Caridad Rodríguez Salazar3

Resumen

Con el objetivo de verificar la viabilidad y el mantenimiento de los caracteres fisiológicos de cepas bacterianas originalmente preservadas en medio semisólido de conservación desde finales de 1980, se estudiaron 60 cepas bacterianas de las familias Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae y Pseudomonaceae, mantenidas como patrones de referencia en la colección de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología. El 85,0 % de las cepas se mantuvo viable durante 12 años con un 45,3 de sus niveles de viabilidad del orden de 107 Ufc/mL y un 87,0 de pureza, así como un 95,2 de preservación de las características fenotípicas. El medio permitió la conservación con buenos resultados de las cepas, lo que sugiere su empleo como método simple en los laboratorios con limitados recursos.

Palabras clave: Temperatura ambiente, medio semisólido de conservación, viabilidad, cepas bacterianas.

Numerosas instituciones mantienen colecciones vivientes de microorganismos, ya sea con fines docentes, investigativos o para disponer de cepas patrones útiles en el aseguramiento de la calidad de múltiples procesos industriales, evaluación de materias primas, productos y tecnologías. En la actualidad, para la conservación de estos cultivos por largos períodos de tiempo se emplean la liofilización y la criopreservación,1,2 como métodos de elección que aseguran la viabilidad, pureza y estabilidad de las cepas. Cuando no existen los recursos necesarios para la utilización de estas técnicas, la búsqueda de alternativas de preservación menos costosas es una constante.

La colección de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología (CCINHEM) ha provisto de cepas bacterianas a numerosos laboratorios microbiológicos en todo el país, en medio semisólido de conservación (MSC), el cual es de fácil preparación, manipulación, costo y buenos resultados en el mantenimiento de los cultivos a mediano plazo, convertido en el método básico de transporte y preservación de los cultivos de la colección. Después de transcurrir más de 10 años desde su introducción a la práctica y al constatarse que mantenía su apariencia, consistencia e hidratación, se decidió verificar la viabilidad y el mantenimiento de los caracteres fisiológicos de los primeros cultivos inoculados en él, empleados como microorganismos patrones en el control de la calidad de medios de cultivos y reactivos en el Departamento de Microbiología Sanitaria del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología.

Métodos

Se preservaron en medio semisólido de conservación a temperatura ambiente 60 cepas bacterianas que integran el banco primario de trabajo de la colección de cultivos microbianos del Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología (CCINHEM), desde su aislamiento y/o incorporación entre 1986 y 1990. Después de su estudio se mantuvieron en este medio hasta mediados del 2000, fecha en que se comenzó la verificación nuevamente de su viabilidad y clasificación (tabla 1).

Tabla 1. Relación de microorganismos en estudio. INHEM 2000-2002

Cepas microbianas	Año conservación	Réplicas disponibles	Cepas microbianas (INHEM)	Año conservación	Réplicas disponibles
Bacillus cereus INHA	1989	2	Salmonella allenton	1987	1
Bacillus subtilis ATCC 6633	1990	1	Salmonella anatum	1988	2
Budvicia aquatica IHE 27426	1989	2	Salmonella binza	1988	1
Citrobacter freundii INHEM	1988	2	Salmonella braenderly	1987	1
Citrobacter sp INHEM	1986	1	Salmonella bredeney	1987	1
Edwarsiella tarda IHE 27456	1989	1	Salmonella B	1987	1
Enterobacter sp	1989	1	Salmonella C	1987	1
Enterobacter aerogenes	1988	2	Salmonella cerro	1987	1
Enterobacter sakazakii IHE 28132	1989	3	Salmonella edmonton	1987	1
Enterococcus faecalis	1988	2	Salmonella havana	1987	1
Enterococcus faecalis ATCC 19433	1989	1	Salmonella heidelberg	1987	1
Pseudomonas aeruginosa 2327	1988	3	Salmonella infantis	1987	1
Escherichia coli ATCC 25922	1988	1	Salmonella kentucky	1987	1
Escherichia coli 44o	1988	2	Salmonella mission	1988	1
Escherichia vulneris IHE 28599	1989	2	Salmonella minesota	1987	1
Klebsiella pneumoniae ATCC 13883	1990	2	Salmonella montevideo	1988	1
Klebsiella pneumoniae INHEM	1988	2	Salmonella muenchen	1986	1
Proteus mirabilis INHEM	1988	2	Salmonella ndolo	1986	1
Providencia sp INHEM	1988	1	Salmonella otmarschen	1987	1
Salmonella agona INHEM	1987	1	Salmonella oranienburg	1987	1
Salmonella albany INHEM	1987	1	Salmonella ser	1987	1
Salmonella stanleyville INHEM	1986	1	Serratia Fonticola IHE 28013	1989	3
Salmonella senptemberg INHEM	1986	1	Serratia Fonticola IHE 28501	1989	2
Salmonella sinstorf INHEM	1986	1	Serratia liquefaciens IHE 28107	1989	4
Salmonella soahanina INHEM	1987	1	Serratia marcescens ATCC 8100	1990	1
Salmonella tennesse INHEM	1987	1	Serratia arcescens IHE 27938	1989	1
Salmonella C INHEM	1987	1	Serratia marcescens	1988	1
Salmonella cerro INHEM	1987	1	Shigella flexneri ATCC 12022	1988	1
Salmonella typhimurium ATCC 14028	1987	1	Shigella flexneri	1988	2
Salmonella typhimurium INHEM	1987	1	Shigella sonnel ATCC 25931	1990	1

ATCC: American Type Culture Collection.
IHE: Instituto de Higiene y Epidemiología de Praga, República Checa.
INHEM: Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología de Cuba.

Composición, elaboración y método de siembra del medio de conservación

Composición:

Caldo corazón 7,5 g
Agar 31,5 g
Agua destilada csp 300 mL
pH=7

Este medio se basa en el empleo del caldo corazón en sustitución de los componentes de la fórmula original del medio de conservación, propuesto en el Bacteriological Analytical Manual de 1995.3

Elaboración:

• Pesar las cantidades exactas indicadas y calentar los ingredientes hasta lograr su total disolución.
• Esterilizar en autoclave a 121 °C por 15 min.
• Distribuir asépticamente 3 mL del medio en tubos de 90 x 10 mm (bacilo) y tapar con tapón de goma previamente esterilizados (tubos y tapones por separado).

Método de siembra del medio de conservación:

Tomar inóculos de las cepas cultivadas, previa comprobación de pureza; sembrar en el medio con aguja de nicrón hasta mitad del tubo; incubar por 18-24 h a 37 °C y posteriormente mantener a temperatura ambiente.

Chequeo de viabilidad

Los cultivos conservados en MSC fueron sembrados en caldo cerebro corazón y se incubaron a 37 °C por 18-24 h. A los cultivos viables se les realizaron las pruebas de tinción de Gram, evaluación de la viabilidad en medios sólidos mediante los métodos de cultivo en placa por agotamiento4 y la técnica de Miles y Misra "modificada",5 así como el chequeo de las propiedades bioquímicas por el método convencional de los tubos de ensayo, según lo que reporta la literatura de consulta.6,7,8 Además, se verificó el mantenimiento de las características antigénicas para las cepas del género Salmonella sp mediante la técnica de aglutinación en lámina portaobjetos según el esquema de Kauffman-White,9 para lo que se utilizaron antisueros comerciales (Wellcome). La figura ilustra la marcha técnica seguida para el desarrollo del trabajo.

 

FIG. Procedimiento de comprobación de los cultivos en la CCINHEM. INHEM, 2000-2002.

En la ejecución de este estudio fueron utilizados medios de cultivo BIOCEN10 y reactivos MERCK11 de calidad certificada, y los resultados obtenidos referente a la caracterización bioquímica fueron comparados con los datos del estudio inicial correspondiente a la fecha de conservación de las cepas.

Resultados

La tabla 2 muestra los valores de porcentaje de viabilidad de los cultivos estudiados en correspondencia con la familia microbiana a que pertenecen las cepas, mientras que las tablas 3 y 4 ilustran los resultados de las pruebas fisiológicas evaluadas y la nomenclatura y estructura antigénica de las cepas de Salmonella sp incluidas en el estudio, respectivamente. El 87,04 % de los cultivos viables permaneció puro y conservó su respuesta frente a la tinción de Gram, y se obtuvo una buena recuperación de los cultivos en medios sólidos.

Tabla 2. Resultados de la viabilidad de los cultivos por familia bacteriana

Familia bacteriana	Cantidad de cepas		%
	Evaluadas	Viables
Bacillaceae	2	2	100
Enterobacteriaceae	55	47	85,45
Enterococaceae	2	1	50,0
Pseudomonaceae	1	1	100
Total	60	51	85,0

Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas

Pruebas bioquímicas	Respuestas coincidentes (% de positividad)	Respuestas no coincidentes (% de positividad)
Oxidasa	100	Ø
Catalasa	100	Ø
Reacción en medio de Kligler
Glucosa	100	Ø
Lactosa	100	Ø
Gas	100	Ø
H2S	100	Ø
Descarboxilación en medio de Moeller
Control	100	Ø
Lisina	91	9
Arginina	75	25
Ornitina	91	9
Pruebas misceláneas
Indol	100	Ø
Urea	100	Ø
Citrato	100	Ø
Movilidad	100	Ø
Fermentación de carbohidratos
Salicina	91	9
Sorbitol	85	15
Manitol	90	10

ø: Respuesta negativa.

Tabla 4. Nomenclatura y estructura antigénica de las cepas de Salmonella sp estudiadas

Nomenclatura original	Nomenclatura actual	Fórmula antigénica
Salmonella anatum	Salmonella stormont	3,10:d:1,2
Salmonella mission	Salmonella C1	6,7:gms
Salmonella montevideo	Salmonella C1	6,7:gms
Salmonella stanleyville	Salmonella B	O:4
Salmonella senftemberg	Salmonella E4	O:15,19
Salmonella bredeney	Salmonella B	O:4
Salmonella muenchen	Salmonella muenchen	6,8:d:1,2
Salmonella ndolo	Salmonella ndolo	1,9,12:d:1,5
Salmonella agona	Salmonella B	O:4
Salmonella B	Salmonella B	O:4
Salmonella C	Salmonella C2	O:8
Salmonella ser INHEM	Salmonella B	O:4
Salmonella braenderup	Salmonella C1	6,7:eh
Salmonella sinstorf	Salmonella larochelle	6,7:eh:1,2
Salmonella kentucky	Salmonella E1	3,10,15:eh
Salmonella binza	Salmonella E1	3,10,15:y
Salmonella othmarschen	Salmonella othmarschen	6,7,14:gmt:-
Salmonella infantis	Salmonella lomita	6,7:eh:1,5
Salmonella minnesota	Salmonella C	6,7:mt
Salmonella oranienburg	Salmonella oranienburg	6,7,14:mt:Z57
Salmonella havana	Salmonella oranienburg	6,7,14:mt:Z57
Salmonella albany	Salmonella	C2 6,7
Salmonella alachua	Salmonella no tipable	-
Salmonella allerton	Salmonella E	3,10:eh
Salmonella tennessee	Salmonella C1	O:6,7
Salmonella soahanina	Salmonella C1	6,7:enx
Salmonella typhimurium	Salmonella typhimurium	1,4,12:i:1,2
Salmonella typhimurium	Salmonella typhimuriumm	1,4,12:i:1,2

Discusión

Del análisis de la tabla 2 se aprecia que el 85,0 % de los cultivos bacterianos se mantuvo viable durante 12 años. El 15,0 de las cepas que no mostró crecimiento (Budvicia aquatica IHE 27426; Enterobacter sp INHEM; Shigella flexneri ATCC 12022; Salmonella cerro; Salmonella edmonton; Salmonella heidelberg; Salmonella C; Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Enterococcus faecalis ATCC 19433), pudiera responder a que originalmente estas fueran preservadas con una viabilidad inferior a 105 Ufc/mL, o a la influencia de factores externos como luz, humedad, temperatura y condiciones de almacenamiento que condicionaron este comportamiento.

Al verificarse la pureza y la morfología microscópica por tinción de Gram de las cepas, se obtuvo que el 87,04 % de los cultivos viables permaneció puro y conservó su respuesta frente a esta prueba. Además, se constató que la morfología microscópica resultó ser algo variable por la existencia de bacilos cortos Gram negativos, explicable por el tiempo de conservación que tienen las cepas durante el cual han permanecido inactivas y sometidas a condiciones de stress. Las 7 conservaciones restantes resultaron contaminadas y se reaislaron a partir de una colonia presuntiva, sin la obtención de resultados satisfactorios. El uso del tapón de goma en los tubos bacilo, las condiciones de esterilidad necesarias para la distribución del medio semisólido y la limpieza de los tubos son las posibles causas atribuibles de la contaminación.

En general se obtuvo una buena recuperación de los cultivos, ilustrada por el crecimiento hasta las últimas estrías en los medios ensayados. Durante la cuantificación de las Ufc/mL en agar nutriente se obtuvo que el 45,3 % de los cultivos mantuvo sus niveles de viablidad del orden de 107 Ufc/mL, valor considerado como muy bueno si se considera el tiempo de vida de las cepas, dato que sugiere que su conservación se efectuó a partir de cultivos en óptimas condiciones de crecimiento, es decir, fase exponencial. Este resultado, al igual que los obtenidos por Aulet de Saab12 contribuye a enriquecer la evidencia de que la probabilidad de obtener resultados satisfactorios de recobrado es mayor cuando se realiza la preservación de los microorganismos, partiendo de cultivos con niveles de viabilidad elevados (>10).10

En la tabla 3 se muestra que el 95,2 % de las respuestas bioquímicas obtenidas en los 2 estudios (inicial y actual) fueron coincidentes para las 17 pruebas evaluadas de forma común en ambos estudios. Esto corrobora que ambas caracterizaciones son válidas, sin errores en la identificación de los microorganismos, lo que se comprueba al compararse los datos obtenidos en el comportamiento bioquímico de cada uno de los microorganismos con los valores de las tablas de identificación de Barrow & Feltham6 y Weissfeld.7

La nomenclatura y estructura antigénica de las cepas de Salmonella sp incluidas en el estudio, se muestra en la tabla 4, en las cuales se verificó que todas las cepas corresponden a serovares de Salmonella enterica subsp enterica9 y, aunque algunas mantienen su nombre original, otras han adquirido uno nuevo, lo que demuestra, una vez más, que la nomenclatura de estas bacterias ha cambiado muchas veces y todavía no es estable,13 por la aparición de nuevas estructuras antigénicas. De las 28 cepas identificadas como especies del género Salmonella sp, se reporta que el 64,29 % de los cultivos (18) se identificaron hasta el nivel de grupo al no disponer de una batería completa de antisueros flagelares, el 32,14 (9) hasta el nivel de serogrupo y sólo una cepa resultó no tipable (3,57).

De los resultados obtenidos en este trabajo se concluye que el medio semisólido de conservación resultó apropiado para el mantenimiento de las cepas bacterianas en estudio durante más de 12 años, al permitir la conservación de los cultivos con un 85,0 % de viabilidad del orden de 107 Ufc/mL, la pureza en un 87,0 y la estabilidad de las propiedades fisiológicas en un 95,2. Este hecho, unido a las ventajas de fácil elaboración, manipulación y condiciones de almacenamiento del medio, sugiere su utilización como método simple de conservación en los laboratorios con limitados recursos.

Summary

Bacterial conservation by simple method at room temperature: a viable alternative

In order to verify the viability and maintenance of the physiological features of bacterial strains originally preserved in semisolid conservation medium since the end of 1980, 60 bacterial strains of the families Bacillaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae and Pseudomonaceae, maintained as reference patterns in the collection of microbial cultures of the National Institute of Hygiene, Epidemiology and Microbiology, were studied. 80.50 % of the strains were viable during 12 years with 45.3 % of their levels of viability in the neighborhood of 107 Ufc/mL and 87.0 % of puritiy, as well as 95.2 % of preservation of the phenotypical characteristics. The medium allowed the conservation of the strains with good results, which suggest its use as a simple method in the laboratories with lilmited resources.

Key words: Room temperature, semisolid conservation medium, viability, bacterial strains.

Referencias bibliográficas

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Recibido: 3 de marzo de 2005. Aprobado 15 de abril de 2005.
Lic. Zulia Weng Alemán. Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología (INHEM). Departamento de Microbiología Sanitaria. Infanta 1158 e/ Llinás y Clavel, Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: [e-mail]

1Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Investigadora Agregada, Instructora.
2Máster en Salud Ambiental. Especialista en Microbiología. Investigadora y Profesora Auxiliar.
3Técnico A en Laboratorio Sanitario.
4Técnica en Procesos Biológicos. Adiestrada.