ARTÍCULO DE REVISIÓN

 

Enterococcus, medios de cultivo convencionales y cromogénicos

 

Enterococcus, conventional and chromogenic culture media

 

 

MSc. Marilyn Díaz Pérez, Dr. C. Claudio Rodríguez Martínez, Dra. C. Raisa Zhurbenko

Centro Nacional de Biopreparados. La Habana, Cuba.

 

 

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RESUMEN

El género Enterococcus ha sufrido variaciones en su clasificación y es considerado actualmente como un género independiente de Streptococcus. Por su elevada incidencia en las infecciones nosocomiales y su resistencia antimicrobiana, y por ser considerados indicadores de contaminación fecal, estos microorganismos han adquirido una importancia notable en la actualidad y se ha desarrollado una gran cantidad de medios de cultivo de diferentes propósitos, tanto convencionales como cromogénicos y/o fluorogénicos, específicos para este género, que son empleados en los laboratorios de Microbiología de todo el mundo para lograr su aislamiento e identificación de muestras clínicas, aguas y algunos alimentos. La selección del tipo de medio a utilizar depende de la experiencia, así como también del tipo de muestra, del método de cultivo y del grado de contaminación de la muestra con otros organismos, por lo que resulta de gran importancia realizar una revisión bibliográfica sobre esta temática. El objetivo de esta revisión bibliográfica sobre el tema consiste en realizar una recopilación de los principales medios de cultivo existentes para este género, su principio de funcionamiento, así como los principales ingredientes que contienen, y resaltar las ventajas que tiene el uso de los medios cromogénicos y/o fluorogénicos al ser mucho más sensibles, rápidos y exactos.

Palabras clave: Enterococcus, Streptococcus, medios cromogénicos y fluorogénicos.

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ABSTRACT

The genus Enterococcus has been classified in different manners. At present, it is considered to be a separate type of Streptococcus. These microorganisms have gained considerable importance due to their high incidence in nosocomial infections, their antimicrobial resistance and their role as indicators of fecal contamination. A large number of culture media have been developed for different purposes related to this genus. These include conventional, as well as chromogenic and/or fluorogenic culture media, used in microbiology laboratories around the world for isolation and identification in clinical samples, water and some food products. Choice of a given medium is based on experience, sample type, culture method and degree of sample contamination with other organisms. Hence the importance of carrying out a bibliographic review of the subject. The purpose of this second bibliographic review was to collect information on the main culture media used for this genus, their operating principle and their main ingredients, highlighting the advantages of chromogenic and/or fluorogenic media, due to their greater speed, sensitivity and accuracy.

Key words: Enterococcus, Streptococcus, chromogenic and fluorogenic media.

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INTRODUCCIÓN

La gran mayoría de las especies de Enterococcus habitan normalmente en el tracto gastrointestinal, y se encuentran en una concentración de más de 107 organismos por gramo de heces fecales.¹ Son miembros de la microbiota natural del tracto genital femenino¹ y no representan daños para el organismo en condiciones normales. Sin embargo, en ocasiones se comportan como patógenos oportunistas y pueden causar diferentes enfermedades, sobre todo en aquellos pacientes que han sido hospitalizados por períodos prolongados o sometidos a terapia antimicrobiana previa, que los convierte en un importante patógeno nosocomial.²

Estos microorganismos son considerados indicadores de la calidad sanitaria de las aguas y de algunos alimentos, por lo que su presencia en el ambiente indica contaminación de origen fecal.³ Por su elevada incidencia en las infecciones nosocomiales, su resistencia antimicrobiana, y por ser considerados indicadores de contaminación fecal, estos microorganismos han adquirido una importancia notable en la actualidad y se ha desarrollado una gran cantidad de medios de cultivo de diferentes propósitos, tanto convencionales como cromogénicos y/o fluorogénicos, específicos para este género, que son empleados en los laboratorios de Microbiología de todo el mundo para lograr su aislamiento e identificación de muestras clínicas, aguas y algunos alimentos. La selección del tipo de medio a utilizar depende de la experiencia, así como también del tipo de muestra, el método de cultivo y del grado de contaminación de la muestra con otros organismos, por lo que resulta de gran importancia realizar una revisión bibliográfica sobre esta temática.⁴ El objetivo de esta segunda revisión bibliográfica sobre el tema consistió en realizar una recopilación de los principales medios de cultivo existentes para este género, su principio de funcionamiento, así como los principales ingredientes que contienen, y resaltar las ventajas que resulta el uso de los medios cromogénicos y/o fluorogénicos al ser mucho más sensibles, rápidos y exactos.

 

MEDIOS DE CULTIVO CONVENCIONALES PARA ENTEROCOCCUS

Se ha desarrollado una amplia variedad de medios de cultivo para el aislamiento de Enterococcus de aguas, alimentos, orina, heces u otros tipos de muestras.^5-7 En estos medios se emplean varios agentes selectivos dentro de los que se encuentran la azida de sodio, el cloruro de sodio, el acetato de talio, el telurito de potasio, el tiocianato de potasio, el etil violeta, el cristal violeta, el cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) y algunos antibióticos como, por ejemplo, kanamicina, gentamicina, ácido nalidíxico, ácido oxolínico, polimixina o colistina.^2,8 Estos agentes inhiben el crecimiento de hongos y bacterias Gram negativas y, a su vez, Enterococcus pueden metabolizarlos;⁹ sin embargo, no logran la inhibición total, pues en muchos de estos medios crecen otros microorganismos; además, la inclusión de la mayoría de estos agentes le confieren una elevada toxicidad, por lo que requieren de una cuidadosa manipulación y le restan estabilidad por ser, en su mayoría, sustancias altamente sensibles a la luz y a la temperatura.

La azida de sodio es el inhibidor activo contenido en la mayoría de estos medios. Muchas bacterias aerobias y anaerobias facultativas obtienen energía mediante el metabolismo respiratorio característico de las enzimas llamadas citocromos. La azida sódica actúa inhibiendo la transferencia de hidrógeno a través del sistema citocromo, bloquea el hierro de la molécula de citocromo en el estado férrico, e impide así la transferencia final del electrón al oxígeno molecular.⁵ Aquellos Streptococcus que carecen de la enzima citocromo, son capaces de desarrollarse en medios selectivos para Enterococcus que contienen azida sódica y forman ácidos por fermentación de la glucosa del medio, que provoca la aparición de un color amarillo visible.¹⁰ Además, se emplean otros ingredientes como inhibidores dentro de los que se encuentran el Tween 80, carbonatos, citratos y sales biliares.^2,11

Existen otros factores que contribuyen a la selectividad de los métodos de cultivo, como son las condiciones de crecimiento, en especial, el pH del medio, la temperatura de incubación, así como la concentración de cada uno de los inhibidores. Los relativamente bajos valores de pH (6,0 o 6,2), así como una temperatura de incubación elevada (42 o 45 C) son condiciones especiales de crecimiento para estos microorganismos. El uso correcto de los inhibidores, así como el incremento o disminución de las concentraciones de estos, también ofrece diferentes grados de selectividad al medio.¹¹

En estos diagnosticadores generalmente se añaden sustancias indicadoras que permiten el reconocimiento de los microorganismos y posibilitan la identificación de las especies por la apariencia de las colonias. En el caso de Enterococcus se aprovecha su capacidad para reducir el tetrazolio, y en casos especiales el telurito. También la formación de un complejo ferroso de esculina ha sido aplicado como criterio de identificación; sin embargo, para la correcta identificación o diferenciación de las especies deben ser considerados otros factores.¹¹

En un medio a pH 7,0 la mayoría de Enterococcus reduce el tetrazolio a fomazán, y provoca la aparición de colonias rojas brillosas que pueden ser fácilmente identificadas; sin embargo, a pH 6,2 o cercano a 6,0 esa reacción es evidente solo para la especie E. faecalis, mientras que E. faecium y otros Enterococcus muestran solo una reacción débil, con colonias claras con un centro rojo o colonias ligeramente rosadas.^2,5,12

Existe una diversidad de medios para el examen de Enterococcus en los que el crecimiento de estos microorganismos se ve favorecido por la presencia de peptonas, hidrolizados y extractos.⁶ La selección del tipo de medio a utilizar depende de la experiencia, así como también del tipo de muestra, el método de cultivo y del grado de contaminación de la muestra con otros organismos.^5-13 Entre los medios no selectivos para Enterococcus se pueden señalar el agar y el caldo cerebro corazón que son ampliamente utilizados para el cultivo y mantenimiento de Enterococcus, el caldo cerebro corazón con 6,5 % de cloruro de sodio, el agar triptona glucosa extracto, el agar y el caldo triptona soya, el agar MRS, el agar Rogosa, el agar M17, el caldo Elliker y el caldo Tood-Hewitt.^2,6

Medios como el agar sangre azida, el agar sangre azida con cristal violeta, el caldo azida de Rothey y el caldo citrato azida se emplean para la detección de Enterococcus en aguas y productos de desecho.⁹ Se han desarrollado otros medios como son el caldo BAGG, el caldo azida púrpura de bromocresol, el agar y caldo confirmatorio para Enterococcus y el caldo presuntivo para Enterococcus que se utilizan en las pruebas presuntivas y confirmativas de calidad para Enterococcus.^2,9

Los medios agar bilis esculina, medio leche azul de metileno, caldo salino modificado y caldo SF son empleados para la diferenciación de Streptococcus del grupo D de Streptococcus no pertenecientes a este grupo.² El medio agar bilis esculina es uno de los más utilizados. Se basa en la hidrólisis del glucósido de esculina contenido en la formulación.^2,14 Ha sido empleado con la inclusión de vancomicina (6 mg/L) para el aislamiento de Enterococcus vancomicina resistentes de muestras de heces e hisopados rectales.^2,15

Este medio no es específico para el género Enterococcus, pues otros microorganismos como Lactobacillus y Pediococcus pueden crecer en él, incluso algunas especies como Lactobacillus plantarum no pueden distinguirse de Enterococcus porque exhiben la misma coloración ya que también hidrolizan la esculina.^2,16

El agar bilis esculina azida es otro medio desarrollado de acuerdo a la norma ISO 7899-2 para la enumeración y confirmación de los aislamientos que se obtienen a partir de las colonias que crecen sobre la membrana colocada sobre el medio agar selectivo para Enterococcus de aislamiento primario agar Slanetz-Bartley, a partir de muestras de agua.¹⁷ Este medio es conocido además con otras denominaciones: agar Enterococcus selectivo de Pfizer, agar Enterocococcel, (Becton Dickinson) y D-Cococcel (bioMérieux).² En este todos los Enterococcus, con excepción de E. gallinarum, muestran una fuerte reacción de hidrólisis de la esculina a las 24 h de incubación, y desarrollan colonias con un halo negro a su alrededor, pero igualmente pueden crecer cepas de Lactobacillus y Pediococcus, las cuales muestran colonias con estas mismas características, que pueden ser diferenciadas de Enterococcus por su tamaño.^2,16 Listeria monocytogenes exhibe una morfología colonial similar a Enterococcus a las 48 h.²

El agar m-E (conocido también como m-agar azida), el agar Slanetz-Bartley, el m-medio azida y el agar selectivo para Enterococcus se emplean para la detección de Enterococcus por el método de filtración por membrana.^2,9 Se conoce, por ejemplo, que con el medio agar m-E se obtienen recuentos superiores que por el procedimiento del número más probable.¹⁸ Además, se ha reportado que este medio es superior en el aislamiento, selectividad y enumeración de Enterococcus encontrados en aguas altamente contaminadas.¹⁹ Con la adición de carbonato de sodio (0,2 %) y Tween 80 (0,05 %) al agar m-E, se obtienen mejores resultados que con otros medios en la búsqueda directa de Enterococcus.²⁰ El agar Slanetz-Bartley es una modificación del agar m-E, basada en la inclusión del cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio en la formulación, la cual resulta ser superior al anterior en cuanto a la enumeración de Enterococcus.²¹

El agar enterococcosel es una modificación del medio agar bilis esculina que consiste en la reducción de la concentración de bilis de buey de 40 a 10 g/L y la adición de azida de sodio. Se emplea para el aislamiento selectivo rápido, cultivo y enumeración de Enterococcus y el caldo enterococcosel para su cultivo y diferenciación.⁹ El caldo azida etil violeta (caldo EVA) es utilizado para el aislamiento, cultivo y enumeración de Enterococcus de aguas y otras muestras.⁹

El medio azida esculina con kanamicina es otro de los productos disponibles comercialmente para el aislamiento y enumeración de Enterococcus presentes en alimentos, aguas y otras muestras.² En el medio, estos microorganismos crecen como resultado de la hidrólisis de la esculina, y producen colonias rodeadas de un halo de color negro. A pesar de que contiene kanamicina y azida de sodio, como agentes selectivos, los Lactobacillus mesófilos, que también hidrolizan la esculina, pueden crecer parcialmente. El método prevé la incubación a 37 ^oC durante 24 h; sin embargo, un incremento de la temperatura a 42 ^oC y la disminución del tiempo a 18 h aumenta la selectividad de este, aunque no se logra inhibir el crecimiento de Lactobacillus esculina positivos. Este problema podría resolverse incrementando la concentración de azida de sodio; pero ese incremento no es recomendable, ya que disminuye la razón de recuperación de Enterococcus.⁷ Para el aislamiento de especies de Enterococcus de alimentos de origen animal, se recomienda incubar el medio a 42 ^oC durante 24 h.⁶

Medios como el agar y el caldo Streptococcus KF, el agar de MacConkey No. 2 y el agar de MacConkey sin cristal violeta también son aplicados para la detección de Enterococcus.² El agar KF es utilizado específicamente para la enumeración de Enterococcus de aguas y alimentos no lácteos,⁵ aunque puede ser empleado para productos lácteos elevando la temperatura de incubación a 44 ^oC.¹⁴ El medio contiene TTC; es relativamente rico en maltosa (2 % p/v) y posee lactosa en menor proporción (0,1 % p/v).⁵ Algunos Enterococcus y Streptococcus son capaces de fermentar estos azúcares y crecer en el medio; sin embargo, la intensidad en la reducción del TTC varía entre las diferentes especies. Por ejemplo, E. faecalis produce colonias con un fuerte color rojo, mientras que otras especies de Enterococcus y Streptococcus producen colonias más pequeñas y de color rosado brillante.² La formulación, a pesar de contener azida de sodio, no es selectiva para Enterococcus, ya que otros microorganismos, como Pediococcus, Lactobacillus y Aerococcus pueden crecer desarrollando colonias rosadas brillantes. El método de cultivo requiere de un período de incubación de 48 h a 37 ^oC. Este producto puede ser utilizado para el examen de la microbiota del queso, pero requiere de una incubación durante 2 días a 44 ^oC.¹⁴ El agar de Pfizer selectivo para Enterococcus se recomienda para el aislamiento selectivo y cultivo de Enterococcus por la técnica de tubos múltiples.⁹

El medio leche, extracto de levadura y jugo de tomate se utiliza para el cultivo y mantenimiento de una variedad de bacterias fastidiosas, las cuales requieren factores de crecimiento complejos, dentro de las que se incluyen las especies de Enterococcus.⁹ Además, existe el agar CATC para la identificación de Enterococcus en carnes, derivados cárnicos, productos lácteos y otros alimentos, y el medio BACTO SF para la detección de Streptococcus fecales en leche, aguas, aguas residuales y heces.^1,19

El agar BARNES permite el aislamiento y enumeración de Enterococcus en alimentos, aguas y otros materiales.²² Sobre este medio las colonias de Enterococcus crecen de mediano tamaño y muestran una coloración que va de rosada pálido a rosada fuerte; sin embargo, también pueden crecer especies de Lactobacillus y Pediococcus como colonias de pequeño tamaño que no pueden distinguirse de Enterococcus.¹⁶

El medio agar arabinosa aztreonam cefalexina y el agar KF son medios para Enterococcus que basan su funcionamiento en la fermentación de azúcares contenidos en la formulación, y provocan un cambio de coloración de los indicadores como resultado de la acidificación que producen algunas especies que pueden metabolizarlas. Aunque en estos medios pueden crecer especies de Lactobacillus y Pediococcus, donde muchas de ellas exhiben la misma reacción, el grado de selectividad es diferente en cada uno de estos productos, ya que en el primero estas especies no pueden distinguirse de Enterococcus, como sucede también en el agar m-E, mientras que en el segundo, no se puede diferenciar la especie Pediococcus dextrinicus. De manera similar, en el medio agar kanamicina esculina azida, los Lactobacillus y Pediococcus son positivos a la hidrólisis de la esculina, por lo que estos no se pueden diferenciar de Enterococcus. Sin embargo, otros medios, como el agar azida carbonato tween citrato, poseen un mayor grado de selectividad, ya que solo crecen Enterococcus, los cuales muestran colonias de rosado a rosado oscuro de variados tamaños.^2,16

Como se evidencia, en la mayoría de estos medios, a pesar de ser estos selectivos para el género Enterococcus y basarse en diferentes principios, desde reacciones de hidrólisis de determinados componentes, como la esculina, hasta reacciones de fermentación de azúcares, pueden crecer especies pertenecientes a otros géneros y muchas veces no pueden diferenciarse de Enterococcus. Otra desventaja que poseen algunos de ellos es que requieren de períodos de incubación prolongados, a veces hasta de 3 o más días, lo cual incide negativamente en el diagnóstico. En la tabla 1 se recogen algunos de los principales medios convencionales para Enterococcus (cuadro 1).

 

DESARROLLO DE NUEVOS MÉTODOS EMPLEADOS EN EL DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO

Aunque se continúan empleando los medios convencionales, a partir de la década de los 80 se han venido desarrollado técnicas para la detección y diferenciación de bacterias basadas en la utilización de sustratos cromogénicos y fluorogénicos, para revelar las actividades enzimáticas específicas de diferentes microorganismos.^23,24 Son métodos muy sensibles que permiten obtener resultados más exactos y rápidos, lo cual constituye un ahorro de tiempo al no ser necesario el procedimiento de aislamiento previo a la identificación.²⁴ Sin embargo, a pesar de sus innumerables ventajas, estos productos no han reemplazado el uso de los medios convencionales en el diagnóstico de rutina; incluso existen requerimientos establecidos en diferentes normas internacionales que describen y definen a muchos de los medios convencionales como parte de los métodos oficiales, aunque no eliminan la posibilidad de utilizar los métodos alternativos.²⁵

 

CARACTERÍSTICAS DE LOS SUSTRATOS FLUOROGÉNICOS Y CROMOGÉNICOS

El uso de sustratos fluorogénicos para la detección de enzimas bacterianas fue propuesto por primera vez por Dyer en el año 1970.²⁶ Estos generalmente están compuestos por un determinado sustrato para la enzima específica, ya sea para azúcares o aminoácidos, y un grupo fluorógeno como el 4-metilumbelliferyl, que hace posible la observación de la emisión de fluorescencia al incidir la luz de longitud de onda de 366 nm. Los sustratos de la metilumbeliferona son solubles en agua, altamente sensibles y muy específicos. Por su dependencia del pH, su fuerte difusión por el medio sólido y la necesidad del empleo de la luz ultravioleta, el uso de estos sustratos es limitado.²⁷

Los sustratos cromogénicos son compuestos que se encuentran unidos a un grupo cromógeno que es liberado por la acción de las enzimas específicas, y provocan un cambio de color por la acción de la enzima microbiana. En 1987, Bascomb describió detalladamente las rutas sintéticas, tanto de los sustratos fluorogénicos como cromogénicos, y su aplicación para el estudio de las enzimas microbianas.²³

Manafi, en 1990, refirió cuatro grupos de compuestos cromogénicos basados en sus reacciones químicas. Los derivados del indolil son solubles en agua, estables a altas temperaturas y no muestran difusión en la placa de agar. Sus derivados más comunes son: 5-bromo-4-cloro-3-indoxil (X), 5-bromo-6-cloro-3-indoxil (Magenta) o 6-cloro-3-indoxil (Salmón).²⁷

Dentro de las reacciones fluorogénicas y cromogénicas que más frecuentemente se emplean, se encuentra la hidrólisis de los sustratos sintéticos por parte de las enzimas microbianas, que causan un incremento considerable de la fluorescencia y/o absorción de la mezcla bacteria-sustrato. Los sustratos de este tipo más comunes son los sustratos sintéticos fluorogénicos de enzimas específicas que contienen derivados cumarínicos del 4-metilumbelliferyl (4-MU) o 7-amino-4-metilcumarin (7-AMC).²³

El uso de sustratos cromogénicos y fluorogénicos para la detección de la actividad b-D-glucosidasa para diferenciar Enterococcus ha recibido considerable atención. El 4-metillumbeliferil-b -D-glucósido, es uno de los sustratos fluorogénicos que se utilizan para este propósito; cuando es hidrolizado por la enzima b-D-glucosidasa de Enterococcus, se desprende 4-metillumbeliferona, la cual exhibe fluorescencia azul-verdosa cuando se ilumina con una lámpara de luz ultravioleta (366 nm). Enterolert™ (IDEXX Laboratorios Inc, Westbrook, ME, USA), microtiterplate MUST® (Biorad, Marnes-la-Coquette, Francia) contienen MUG que es utilizado por la enzima b-D-glucosidasa.²

MEDIOS DE CULTIVO CROMOGÉNICOS Y/O FLUOROGÉNICOS PARA ENTEROCOCCUS

El medio fluorogénico agar carbonato de talio gentamicina (fGTC) contiene el sustrato fluorogénico 4-metilumberiferil-a-D-galactósido y almidón, ingredientes que le confieren al medio propiedades diferenciales, y permiten la diferenciación de Streptococcus bovis y E. faecium de otras especies de Enterococcus y Streptococcus basada en la hidrólisis del almidón y la presencia de fluorescencia.⁹ El medio no es específico para el género Enterococcus. En este la hidrólisis del almidón y la fluorescencia indican la presencia de S. bovis. La ausencia de hidrólisis del almidón con la emisión de fluorescencia es indicativa de E. faecium y biotipos relacionados y la ausencia de ambas reacciones indica crecimiento de E. faecalis, E. avium, S. equinius y otros estreptococos.⁸

El indoxil-b-D-glucósido es uno de los sustratos cromogénicos que se utiliza para detectar la actividad glucosidasa. Fue incorporado por Dufour, en 1980, al medio agar m-EI para detectar Enterococcus. Como resultado se produce un complejo insoluble azul índigo que difunde alrededor del medio y se forma un halo azul alrededor de la colonia que permite identificar estos microorganismos. Este medio ha sido modificado y ha reducido el contenido de TTC de 0,15 a 0,02 g/L.²⁸

El medio agar Chromocult® Enterococcus (Merck, Darmstadt, Alemania) es uno de los medios cromogénicos que se utilizan para el aislamiento, diferenciación y enumeración de Enterococcus en aguas, productos alimenticios y otros materiales. El crecimiento de Enterococcus en este medio se ve favorecido por la inclusión de peptonas, fosfatos y Tween 80. Contiene, además, azida de sodio y bilis de buey que inhiben el crecimiento de la mayoría de la microbiota acompañante; sin embargo, pueden crecer las especies de Aerococcus viridans (incoloras o azul/violeta) y Streptococcus equi (turquesa). No obstante, estas especies pueden distinguirse fácilmente de las colonias rojas características de Enterococcus y que varían desde 0,5 a 2 mm de diámetro. Las especies de Lactobacillus y Pediococcus pueden crecer sin poder distinguirlas de Enterococcus.¹⁶ Este producto ha sido evaluado en comparación con el Agar MRS (Merck) para el aislamiento e identificación de Enterococcus en pollos de ceba, y se ha obtenido un 98 % de sensibilidad. No obstante, se encontraron diferencias significativas en cuanto a las razones de los aislamientos de Enterococcus entre ambos medios, donde fue pobre el crecimiento de algunas especies de Enterococcus en el medio cromogénico y se encontraron además resultados falsos positivos en este tipo de muestras que correspondieron a cepas de Leuconostoc spp.²⁹

El caldo Chromocult® Enterococcus es utilizado para el enriquecimiento selectivo de Enterococcus en el examen bacteriológico de las aguas. Contiene el sustrato cromogénico X-GLU (5-bromo-4-cloro-3-indolil-b-D-glucopiranósido) que es escindido por la enzima b-glucosidasa, y se produce un intenso color azul-verde en el caldo cuando hay presencia de Enterococcus y Streptococcus del grupo D en la muestra que se analiza.⁴ Este medio, a pesar de contener azida de sodio, no es capaz de inhibir el crecimiento de otras bacterias b-glucosidasa positivas, como Streptococcus bovis, y no se puede diferenciar de las especies de Enterococcus.³⁰

El agar RAPID Enterococcus® (Biorad, Marnes-la-Coquette, Francia) es otro medio que contiene el sustrato X-GLU, que permite detectar la actividad glucosidasa. Este diagnosticador contiene una mezcla de inhibidores que actúa sobre el crecimiento de microorganismos Gram-negativos y de otras bacterias b-D-glucosidasa positivas.²De igual modo existen medios cromogénicos para la detección de Enterococcus de muestras clínicas, en especial de muestras de orina, donde se incluye el sustrato X-GLU.³¹

El medio cromogénico MPO® se recomienda para la detección, enumeración e identificación de patógenos del tracto urinario; dentro de ellos los Enterococcus. Los resultados de los recuentos y los tipos de microorganismos aislados en el MPO® han sido comparados con los que se obtienen en el medio C.L.E.D., que resultan ser análogos, aunque en algunos casos la presencia de Enterococcus spp. solo se detectó en el medio cromogénico. Este diagnosticador no es específico para el género Enterococcus, ya que crecen otros patógenos urinarios importantes como, Escherichia coli, Proteus spp., enterobacterias del grupo Klebsiella-Enterobacter-Serratia, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus spp. y Candida albicans. Como ventaja se plantea que su utilización conlleva una importante disminución de la carga de trabajo asociada a la realización de esta técnica.³²

El chromID VRE (bioMérieux, Francia) es un nuevo medio cromogénico selectivo que refuerza el aislamiento e identificación presuntiva de Enterococcus vancomicina resistente directamente de hisopados rectales. Con este medio se reduce el tiempo de ensayo, al no ser necesaria la confirmación, lo cual es de vital importancia para el control de la diseminación de resistencia a la vancomicina.³³ Este producto ha sido evaluado en comparación con otros medios cromogénicos, como el VRE Agar (AES VRE agar; AES Chemunex) y el Agar VRE (Oxoid), con muestras de heces fecales para el propósito antes mencionado. Todos ellos muestran valores de sensibilidad muy bajos tanto en el cultivo directo (77,8, 66,7 y 44,4 %, respectivamente) como después de haber enriquecido la muestra en un caldo de enriquecimiento (83,3, 66,7 y 77,8 %, respectivamente). De todos ellos, el medio perteneciente a la firma Oxoid es el que tiene mayor dificultad para la interpretación de los resultados por la difusión de la coloración negra que muestran las colonias.³⁴

De igual modo, el medio chromID VRE (bioMérieux, Francia) ha sido evaluado para este mismo propósito con el medio Agar bilis esculina, con resultados similares a las 48 h, aunque con el medio cromogénico se obtiene mayor porcentaje de recuperación de EVR a las 24 h (39,3 % versus 21,3 %, P-0,003) por lo que su utilización resulta muy conveniente en el control de estas infecciones.¹⁵

En el Centro Nacional de Biopreparados (BioCen, Cuba) se ha desarrollado el primer medio cromogénico del país para el aislamiento, identificación y recuento de Enterococcus en muestras clínicas. Ha sido evaluado con muestras clínicas (urocultivos, vaginales, hemocultivos, coprocultivos, uretrales y endocervicales), y se han obtenido valores elevados de sensibilidad (100 %), especificidad (96,19 %) y exactitud diagnóstica (93 %) para el total de las muestras ensayadas, valores estos superiores a los reportados con otros medios cromogénicos como el chromID VRE (bioMérieux, Francia), VRE Agar (AES VRE agar; AES Chemunex) y el Agar VRE (Oxoid).^33,35

También fue desarrollado el medio cromogénico m-CromoCen ENT, que se deriva de pequeñas modificaciones de la formulación anterior, y que se destina al aislamiento de estos microorganismos en muestras de agua por la técnica de filtración por membrana.³⁶ En la tabla 2 y en el cuadro 2 aparece un resumen de algunos de los principales medios de cultivo cromogénicos y fluorogénicos para Enterococcus.

CONSIDERACIONES FINALES

El género Enterococcus ha sufrido variaciones en su clasificación. Antiguamente se encontraban incluidos dentro del género Streptococcus; sin embargo, en la actualidad se reconocen como un género independiente. Existe un número considerable de medios de cultivo para el aislamiento e identificación de las especies de Enterococcus; sin embargo, no existe un medio universal para el aislamiento de estos microorganismos, por lo que la selección del tipo de medio a emplear depende de la muestra que se desee analizar y de su microbiota acompañante; tampoco son medios sencillos debido a los requerimientos nutricionales que poseen estos microorganismos. Muchos de estos productos no son específicos para el género pues, en ellos pueden crecer otros microorganismos, por lo que es difícil distinguirlos de Enterococcus, ya que en muchos casos exhiben la misma reacción de degradación de los glucósidos. Para lograr mejores resultados en cuanto a la selectividad, muchos de estos diagnosticadores contienen antibióticos que afectan su estabilidad y otros inhibidores, que son sustancias altamente tóxicas para la salud humana y para el medio ambiente, por lo que necesitan ser manipulados con precaución y requieren de condiciones especiales para su fabricación o descarte. Por otra parte, en muchos casos es necesario variar las concentraciones de los agentes inhibidores en el medio o variar las condiciones de incubación (temperatura y tiempo) para lograr un mayor grado de selectividad; sin embargo, esto conlleva una menor razón de recuperación de Enterococcus. En muchos casos un método de cultivo no es suficiente para la correcta identificación de las especies o del género y se necesitan de pruebas fenotípicas y genotípicas adicionales.

 

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Recibido: 6 de junio de 2012.
Aprobado: 20 de noviembre de 2012.

 

 

MSc. Marilyn Díaz Pérez. Departamento de Investigaciones de Medios de Cultivo, Centro Nacional de Biopreparados. Apartado 6048, Habana 6, CP 32600. La Habana, Cuba. Correo electrónico: [e-mail]