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Introducción
Existen diferentes tecnologías y métodos para la recuperación de ecosistemas contaminados con petróleo crudo y derivados del petróleo, sin embargo la biorremediacion es una tecnología que en los últimos años se ha venido desarrollando como una alternativa más económica y ambientalmente sostenible. La biorremediación utiliza la capacidad de los microor ganismos presentes en ambientes afectados para degradar compuestos o convertirlos a otros menos tóxicos. La recuperación de zonas afectadas con el uso de microorganismos ofrece una solución práctica y viable para la restauración de ecosistemas. Varios investigadores han reportado microor ganismos con una alta capacidad de degradar hidrocarburos, aislados de hábitats naturales histórica mente contaminados con petróleo o sus derivados. (Song, Tang, Zhen, Liu, 2019). Se ha demostrado que durante el crecimiento los microorganismos que viven en ambientes impactados con petróleo y sus derivados utilizan estos como fuente de carbono. Los compuestos saturados y aromáticos de uno a cinco anillos bencénicos son los más utilizados, en cambio los aromáticos de peso molecular elevado (con más de seis anillos bencénicos), las resinas y asfaltenos son difíciles de degradar por su recalcitrancia (Abdel, Hussein, Mansour, 2016). Las parafinas son hidrocarburos fácilmente degradables. Los isómeros, hidrocarburos cíclicos y de larga cadena carbonada tienen una lenta biodegradación por lo que necesitan una microbiota específica. Los hidrocarburos aromáticos policíclicos también pueden ser usados como fuente de carbono por diferentes especies de microorganismos (Kumari, Regar, Rajr, Manickam, Natesan, 2018). Al estar el petróleo constituido por numerosos compuestos químicos, ningún microorganismo puede degradar por sí solo todos sus constituyentes, sino que necesita agruparse con otros formando poblaciones mixtas o consorcios microbianos. Los consorcios microbianos tienen mayor poder biodegradativo porque la información genética que codifica al sistema enzimático del consorcio es más completa y por tanto es más probable la degradación de las mezclas complejas de hidrocarburos presentes en un área dañada. La bioaumentación con cultivos mixtos de bacterias aisladas de ambientes impactados con crudo ofrecen claramente una mejor opción de biorremediación que otros tratamientos (Brzeszcz, Kapusta, Steliga, Turkiewicz, 2020).
El objetivo de esta investigación fue evaluar la degradación de petróleo crudo y derivados a escala de laboratorio empleando un consorcio compuesto por cuatro cepas bacterianas aisladas de zonas costeras de Cuba. Este consorcio se encuentra en desarrollo, y una de las características que se le puede atribuir y de alta importancia es la versatilidad que pueda demostrar al enfrentarse a diferentes compuestos del petróleo.
Materiales y Métodos
Ensayo de degradación
El consorcio empleado para el ensayo está compuesto por bacterias aerobias degradadoras de hidrocarburos del petróleo aisladas de la zona costera del Oriente de Cuba. El mismo está compuesto por cepas de los géneros: Pseudomonas sp. B10, Alcaligenes sp. F10S1, Bacillus sp. F9S y Bacillus sp. RFA, se sembraron individualmente en 30 ml de medio de cultivo para la producción biomasa QBP (Sacarosa 30 g.l-1; MgSO47 H2O 0,2 g.l-1; NH4(2) HPO4 5,0 g.l-1 y Levadura forrajera 1,0 g.l-1). Los cultivos se incubaron en zaranda por 24 h en agitación de 130 rpm a una temperatura de 370 C. Para preparar el inóculo se tomaron los cultivos en medio QBP y se centrifugaron y el pellet de cada uno fue lavado y se re-suspendió en 20 ml de solución salina 0,85% hasta lograr una concentración en el orden de 106 UFC.ml-1 según la escala de McFarland, luego se mezclaron en un frasco estéril y se homogenizaron (Barrios, 2014).
Para evaluar la capacidad de degradación del consorcio se diseñó un ensayo microcosmo, se utilizó medio mínimo mineral (MMM) que contenía por litro: NH4Cl 1,2g, KNO3 2,4 g, CaCl2 6H2O 0,0005 g, NaSO4 2,4 g, MgSO4 1,2 g, K2HPO4 0,6 g, FeSO7H2O 0,002 g. Se utilizaron frascos de cristal estériles con 250 mL de MMM al que se le agregó un 5 % de la fuente de carbono (petróleo crudo, queroseno, diésel, gasolina y Jet A1) y 10 % del inóculo. Se prepararon tres réplicas por tratamiento y dos controles sin inocular. Los cultivos se incubaron en agitación constante en una incubadora marca Incubator Shaker, modelo 625, a 130 rpm por 90 días a 370 C. Se evaluó la viabilidad de las cepas mediante un conteo de bacterias aerobias cultivables (UFC/mL) a los 0, 21, 45 y 90 días (ISO IS 15188, 2014).
Se emplearon técnicas analíticas para cuantificar la remoción de los diferentes hidrocarburos, la Espectroscopia Infrarrojo (IR) se utilizó para petróleo crudo, diésel, queroseno y el Jet A1. Los espectros se obtuvieron mediante la técnica de transmisión entre ventanas de cloruro de sodio, para el registro de los mismos se empleó un espectrómetro PerkinElmer, modelo Frontier (ASTME 1252-98, 2013). El registro se realizó en el modo fotométrico absorbancia en el intervalo de frecuencias de 4000 a 400 cm-1, resolución de 4 cm-1 y 16 barridos por punto. Se realizó el procesamiento de los espectros y los datos se interpolaron en el intervalo de frecuencias de 1550 a 1300 cm-1 con el objetivo de estudiar el comportamiento de las vibraciones de doblajes de metilos y metilenos (
de grupos metilenos y metilos 
y 
de grupos metilos 
terminales presentes en cadenas alifáticas) localizadas en torno a las frecuencias 1470 y 1377 cm-1, respectivamente. Se realizó corrección de línea base y la integración de las señales se efectuó de valle a valle para lo cual fue necesario establecer los valores iniciales y finales y los valores de las bases de las mismas. Posteriormente se calculó la relación de áreas A1470/A1377 para comparar los resultados entre muestras y controles (PerkinElmer Spectrum, 2015).
Se determinaron los componentes PIANO de la gasolina: parafinas, isoparafinas, aromáticos, naftenos y oleofinas, por Cromatografía de Gases empleando un Cromatógrafo Agilent 7890A con detector de Ionización de Llama (FID) (ASTM D6729, 2020). Se determinó el contenido de Hidrocarburos Totales del petróleo al inicio y al finalizar el ensayo para el diésel, queroseno y Jet A1 (APHA, 2017). Se determinaron los diferentes compuestos del petróleo crudo: saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos (SARA) al inicio y final del ensayo (EPA, 2020).
Las tasas de degradación de los hidrocarburos totales en diésel, queroseno y Jet A1 respecto al control y de las fracciones del crudo (SARA) Se calcularon mediante la siguiente ecuación:
Resultados y Discusión
Crecimiento bacteriano
En la tabla 1 se muestra el resultado del conteo de las bacterias durante el ensayo en presencia de crudo, diésel, queroseno, Jet A1 y gasolina y se mostró un incremento de 106 a 108 UFC/mL a los 21 días. A los 45 días aumentó el título bacteriano alcanzando niveles de 1011 UFC/mL. A los 90 días se observó una disminución en el crecimiento de 3 a 5 órdenes, lo cual puede estar asociado al agotamiento de los hidrocarburos accesibles a las cepas del consorcio. La biodisponibilidad de los hidrocarburos es directamente proporcional al incremento de la población de bacterias hidrocarburoclásticas (Ichor, Okerentugba, Okpokwasili, 2014).
Tabla 1 Recuento de bacterias (UFC/mL), durante el proceso de degradación en los tratamientos. Tiempo (días)
Este crecimiento sugiere que las cepas emplearon al petróleo crudo y sus derivados como fuente de carbono para su crecimiento y por tanto que se ha estado produciendo un proceso de biotransformación. Cuando las bacterias crecen en medios con hidrocarburos o en presencia de estos producen sustancias tensoactivas (biosurfactantes) capaces de solubilizar compuestos no polares, como los que presenta el petróleo, además estas moléculas estimulan el crecimiento microbiológico (Rodríguez, 2017).
Degradación del petróleo crudo
En la Figura 1 se muestra la comparación de las intensidades relativas entre las bandas 1460 cm-1 (grupos CH2/CH3) y 1377 cm-1 (grupos CH3), obtenidas a partir de los espectros infrarrojos del petróleo crudo tratado y su control. Los valores de relación obtenidos para el crudo tratado y su control fueron de 3,49 y 3,71 cm-1 respectivamente, lo que demuestra que existe un proceso de transformación y degradación que ha alterado la composición del petróleo crudo, aumentando los grupos CH3 con respecto a los grupos CH2, esto se debe a los procesos de ruptura de cadenas que provocan los microorganismos para obtener energía y emplear los átomos de carbono en su metabolismo.
El análisis cuantitativo de los componentes del petróleo y sustancias relacionadas (SARA) a los 90 días del petróleo crudo tratado y su control, permitió determinar el comportamiento de cada una las de las fracciones (tabla 2). Se aprecia una disminución del 89,5 % de las resinas del tratamiento con respecto al control y de 19,4 % de los asfáltenos y la fracción de aromáticos aparentemente ha sido poco degradada esto se debe a que el proceso de transformación de las resinas y asfáltenos resulta en un incremento de aromáticos y saturados. Estos últimos a pesar de que aumentan en el proceso de degradación de resinas, asfáltenos y aromáticos, disminuyeron en un 38,46 %.
Tabla 2 Valores de concentración de los componentes de petróleo crudo (SARA) a los 90 días. Concentración (mg/L)
De manera general se observa una disminución de los hidrocarburos alifáticos en comparación con los encontrados en el control abiótico, se espera que la biodegradación se produzca en mayor extensión en los hidrocarburos alifáticos, ya que estos suelen ser más susceptibles a la degradación que los aromáticos y estos que resinas y asfaltenos (Germano de Almeida, 2017).
Los n-alcanos son los más propensos a la oxidación; sin embargo, a los 90 días, la biodegradación de saturados es menor que la de las resinas, y estas a su vez mayor que la de aromáticos, los cuales aparentemente no se degradaron. Los hidrocarburos aromáticos no disminuyeron significativamente posiblemente debido a las altas concentraciones de alifáticos, que son preferidos por las bacterias para su metabolismo y son fácilmente degradables, aun cuando se ha encontrado que algunos aromáticos de bajo peso molecular son metabolizados antes que muchos compuestos saturados (Tian, Wang, Peng, Zhou, 2018).
El análisis de estos resultados hace suponer que en los primeros 10-15 días ocurrió la degradación de las cadenas lineales de hasta 30 átomos de carbono. Las diferentes generaciones bacterianas en los cultivos debieron ajustar su metabolismo luego del agotamiento de sustratos menos complejos (saturados lineales y aromáticos de bajo peso molecular), los mecanismos de regulación del metabolismo probablemente indujeron un cambio enzimático orientado a la degradación de compuestos más complejos; la mineralización de estos compuestos, obviamente, no fue completa, sino que se acumularon como metabolitos intermediarios en forma de cadenas lineales y compuestos aromáticos; por lo que la batería enzimática debió variar en función de las fluctuaciones de las concentraciones de los diferentes compuestos. La capacidad de un microorganismo para asimilar diferentes mezclas de hidrocarburos como fuentes de carbono depende de la especificidad de sus enzimas. Algunas monooxigenasas, dioxigenasas y lipooxigenasas tienen el potencial para convertir el petróleo y sus derivados en enantiómeros que puedan ser asimilados, ampliándose de esta forma el ámbito de sustratos disponibles para el metabolismo (Naga & Scalvenzi, 2017).
Degradación de diésel
La figura 2 muestra el espectro IR del diésel, donde la relación de las intensidades de las bandas 1470 cm-1 (gruposCH2/CH3) y 1377 cm-1 (grupos CH3) en el control es de 3,74 cm-1 y en la muestra tratada de 3,39 a cm-1. Esta variación se debe a un cambio en la composición del producto debido a una modificación de las cadenas carbonadas, la ruptura de compuestos que presentan grupos CH2 da lugar a grupos CH3 que posteriormente se mineralizan totalmente.
Los hidrocarburos totales a los 90 días en el diésel tratado (8183 mg/L) y el control (9540 mg/L) experimentan una disminución del 14.22 %. Estos resultados validan lo que se aprecia en el espectro infrarrojo. El diésel está compuesto principalmente por hidrocarburos alifáticos y bajos niveles de aromáticos (Akwukwaegbu, Okerentugba, Okpokwasili, Stanley, 2019).
Degradación del queroseno
La figura 3 muestra el espectro IR para el queroseno tratado y su control. Las relaciones de intensidades de banda de 1470 cm-1 (grupo CH3) y 1377 cm-1 resultaron de 4,03 cm-1 y 3,66 cm-1 en el control en el tratado respectivamente, mostrando una transformación en la composición del queroseno, con un incremento relativo en la proporción de grupos CH3 terminales. Este resultado está respaldado por la tasa de degradación de los hidrocarburos totales (41,69 %) a los 90 días. El contenido de hidrocarburos totales del queroseno fue de 166 mg/L en el tratamiento y de 96,8 mg/L en el control.
Degradación del Jet A1-13-12-132
3.2.5 Degradación de gasolinas
Las muestras analizadas (tratamiento y control) se compararon con patrones de gasolina coincidiendo los tiempos de retención tanto de las muestras como de los patrones. Los resultados están expresados en porciento de área, a partir de los cuales se determinaron las tasas de degradación (tabla 3). Numéricamente se observa una desaparición de los compuestos no identificados y las olefinas; los aromáticos disminuyeron en un 27, 5 % y las parafinas en un 66, 37 %; mientras que se observa un incremento en los naftenos y las isoparafinas producto de la transformación de las olefinas y aromáticos.
La aplicación de un consorcio donde cada miembro revela capacidades para la degradación de diferentes hidrocarburos puede ser una interesante alternativa de bioaumentación para ambientes contaminados con hidrocarburos alifáticos y de alto peso molecular (Brzeszcz, Kapusta, Steliga, Turkiewicz, 2020). Varios autores reportan la efectividad de consorcios integrados por cepas que producen biosurfactantes (Pseudomonas y Bacillus) en la degradación de hidrocarburos policíclicos aromáticos (Pugazhendi et al, 2017), (Kumari, Regar, Manickam, 2018), (Sagar, Avani, Kunal, Seema , Datta M, 2021).
Conclusiones
Las cepas del consorcio utilizaron el petróleo crudo y derivados (diésel, queroseno, Jet A1 y gasolina) como única fuente de carbono y energía, degradando los compuestos del petróleo crudo (saturados, resinas, asfáltenos) y los hidrocarburos del diésel, queroseno y el Jet A1, asimismo el consorcio transformó las olefinas, parafinas y aromáticos presentes en la gasolina. Según estos resultados el consorcio tiene potencialidades para degradar hidrocarburos del petróleo y pudiera ser una alternativa viable para su aplicación el saneamiento de ecosistemas impactados.
