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INTRODUCCIÓN
Justicia es el género más grande de la familia Acanthaceae, con aproximadamente 400 especies que se distribuyen en regiones pantropicales y tropicales (The Plant List, 2013). Nativa de América Latina, la Justicia pectoralis Jacq. en Cuba es popularmente conocida como Tilo y se emplea por sus propiedades ansiolíticas y sedativas (Rodríguez-Chanfrau et al., 2008; Venâncio et al., 2011; Ribeiro et al., 2020). Sus metabolitos principales son las coumarinas 1,2 benzopirona y la umbeliferona reportadas en altas concentraciones en sus partes aéreas y se emplean en el control de la calidad de extractos acuosos e hidroalcólicos obtenidos a partir de esta planta. (Angonese et al., 1992; Barros et al., 1997; Oliveira y Andrade, 2000; Govín et al., 2003 Rodríguez-Chanfrau et al., 2008; Rodríguez-Chanfrau et al., 2013; Rodríguez-Chanfrau et al., 2014, Rodríguez-Chanfrau et al., 2016)
En Cuba, desde 1992, esta especie está incluida en el arsenal terapéutico del sistema nacional de salud cubano como sedante en afecciones nerviosas (Minsap, 1992). En el Formulario Nacional de Fitofármacos y Apifármacos de Cuba, de 2017, aparece un jarabe formulado con extracto fluido 30% de partes aéreas de la planta indicado para el insomnio, ansiedad y depresión. (Cruz, 2017)
La obtención de extractos estandarizados de manera más económica, segura y amigable con el medio ambiente, ha guiado a las investigaciones para el desarrollo de nuevos métodos y tecnologías, superiores a los métodos convencionales de extracción. Por tanto, son objeto de investigación continua con el fin de optimizar, entre otros, los procesos de extracción, con la mejora o sustitución de las tecnologías tradicionalmente empleadas. (Mandal et al., 2007; Chan et al., 2013; Chemat y Cravotto, 2013; Bagade et al., 2021)
Las microondas son radiaciones electromagnéticas no ionizantes, su principal efecto, cuando interactúan con un material receptivo, es de naturaleza térmica. La rapidez en el calentamiento es la principal ventaja de las microondas frente a los métodos tradicionalmente empleados, también reduce los volúmenes de extracción, permite obtener altos recobrados de los compuestos de interés y no contamina el medio ambiente. Mediante la aplicación de esta tecnología más limpia y segura, se logran procesos extractivos de mayor factibilidad económica constituyendo aspectos deseables de alcanzar en todo proceso de extracción, su empleo es objeto de creciente interés en la extracción de fitoconstituyentes con probadas actividades farmacológicas. (Mandal et al., 2007; Chan et al., 2013; Chemat y Cravotto, 2013; Bagade et al., 2021)
La extracción asistida por microondas (EAM) está influenciada por varios factores como el tiempo de irradiación, potencia, naturaleza del disolvente, la relación disolvente/material vegetal, temperatura, así como la interacción de todos los factores, por lo que es necesario adoptar una optimización estadística para determinar las condiciones más favorables de funcionamiento. (Dahmoune et al., 2014)
La metodología de superficie respuesta (MSR) es un método estadístico que usa datos cuantitativos de un diseño experimental para determinar o resolver simultáneamente ecuaciones multivariadas. La MSR puede generar un modelo matemático y tener en cuenta las posibles interrelaciones de las variables a evaluar mientras se minimiza el número de experimentos (Song et al., 2011) siendo particularmente útil en un diseño con más de dos factores que permiten la reducción considerable de los costos de funcionamiento y tiempo (Cheok et al., 2012). Para la planificación experimental, la selección de un diseño Box-Behnken (BBD) tiene como ventajas que es uno de los diseños experimentales más eficientes, puesto que no contiene combinaciones por lo que de forma simultánea todos factores están en sus niveles más bajos o más altos, por tanto, es útil para evitar los experimentos bajo condiciones extremas donde a menudo se obtienen resultados insatisfactorios. (Dahmoune et al., 2014)
Hasta donde sabemos, no existe ningún reporte en la literatura científica sobre la optimización del procedimiento empleando la energía de las microondas para la extracción de coumarinas a partir de hojas de Justicia pectoralis Jacq. Por lo tanto, el objetivo del presente estudio es optimizar las condiciones de la EAM en la obtención de extracto hidroalcohólico de Justicia pectoralis Jacq. por un BBD de la MSR y comparar con el reflujo como proceso de extracción convencional.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material Vegetal
Se emplearon hojas desecadas y fragmentadas (3 - 5 mm de tamaño de partículas) de Justicia pectoralis Jacq., procedentes de la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig" de San Antonio de los Baños, e identificadas con el número de herbario 4636.
Estudio de la influencia de la potencia y el tiempo de extracción mediante la extracción asistida por microondas
El proceso de extracción se llevó a cabo en un horno de microondas doméstico modificado, SHARP-4A56M, con un nivel de potencia máxima de 900 W, acoplado a un condensador. Los parámetros estudiados fueron: potencia, tiempo de irradiación y relación disolvente/ material vegetal.
La evaluación los parámetros de operación se realizó mediante la MSR donde se empleó un diseño Box-Behnken de 15 experimentos incluyendo 3 puntos centrales, utilizando como disolvente etanol 30%. Los niveles de los factores estudiados fueron para el tiempo entre 2 y 5 min, para la potencia entre 540 y 900 W y para la relación disolvente/ material vegetal entre 10 y 20 mL/g.
Se emplearon 20 g de material vegetal en todos los casos. Los experimentos se realizaron en un reactor de cristal esférico de un litro de capacidad (conectado a un condensador de serpentín enchaquetado en posición de reflujo) dentro de la cavidad del horno, colocado en el sitio de mayor radiación determinado previamente (Pérez, 2012). Al finalizar el proceso se separó el extracto del residuo vegetal utilizando gasa, se filtró bajo presión reducida a través de telo filtrante.
A los resultados del diseño se les realizó un análisis de varianza (ANOVA) para determinar las variables con diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos. Además, se realizó un análisis de regresión múltiple para determinar a partir del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (Adj. R2) si existe buena correlación entre los resultados obtenidos. Para el cálculo del punto óptimo, se ajustó un polinomio de segundo orden para la correlación entre las variables independientes y la variable respuesta (rendimiento de polisacáridos totales).
Extracción por el método tradicional
La extracción por el método tradicional de reflujo se llevó a cabo en un reactor de cristal de fondo esférico de 1 L de capacidad donde se utilizó 20 g de material vegetal, con una relación 20 mL/g de etanol al 30 %, durante 2 h a reflujo. Después se separó el extracto del residuo vegetal utilizando gasa, se filtró bajo presión reducida a través de telo filtrante. El ensayo se realizó por duplicado.
Determinación del contenido de coumarinas totales
El contenido de cumarina se determinó en los extractos por cromatogragía líquida de alta resolución (CLAR) en un cromatógrafo KNAUER, modelo Smarline (Berlín, Alemania) bajo las siguientes condiciones cromatográficas: Columna: columna Lichrospher® 100, RP 18 (5 μm, 250 mm × 4 mm, Merck, Alemania). Temperatura de la columna: 25°C, Flujo: 1 mL/min, Detector: UV, Longitud de onda: 274 nm, Volumen de inyección de 20 μL, Fase móvil: metanol: agua (40:60). (Rodríguez et al., 2008)
Rendimiento de coumarinas totales
El rendimiento de coumarinas expresados en porcentaje (%) se calculó por la siguiente fórmula: (Paulucci et al., 2013)
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Optimización de la potencia y el tiempo de extracción
Para lograr la máxima eficiencia de extracción de coumarinas, fue necesario crear un diseño de experimento (DoE) para encontrar los parámetros de operación apropiados, donde se optimizaron los siguientes tres factores, temperatura, tiempo de extracción y relación disolvente/ material vegetal. Esto se realizó bajo un diseño Box- Behenken de la metodología de superficie respuesta. En la tabla 1, se muestran las corridas experimentales del diseño en forma aleatoria con los resultados de la variable respuesta, donde se evidencia que los rendimientos de coumarinas varían desde 0.023% hasta 0.047%.
Mediante la aplicación del análisis de regresión múltiple a los datos experimentales, las variables respuestas y las variables independientes se correlacionan a un polinomio de segundo orden como se muestra en la siguiente ecuación:
Rendimiento de coumarinas = 0.0531944 + 0.0471667* Relación disolvente/material vegetal - 0.0169444*time - 0.00000694444*Potencia - 0.0017*Relación disolvente/material vegetal ^2 + 0.00466667* Relación disolvente/material vegetal *Tiempo - 0.00888889*Tiempo^2
El análisis de variancia (ANOVA) del modelo de regresión cuadrático muestra que los valores del coeficiente de determinación (R2) y del coeficiente de determinación ajustado (Adj. R2) fueron 83 y 70 % de manera respectiva, lo que sugiere un alto grado de correlación entre los valores observados y predichos, indicativo de un buen ajuste para este tipo de sistema. De igual modo se evidenció que el parámetro que tiene influencia estadísticamente significativa sobre la variable respuesta es la relación disolvente /material vegetal y su interacción cuadrática (p≤0,005).
Un factor crítico es el volumen del disolvente a emplear en los procesos de extracción. La cantidad debe ser suficiente para asegurar que el vegetal el material se sumerja por completo en el disolvente durante todo el tiempo de extracción. En el intervalo estudiado, el rendimiento de coumarinas se incrementa rápidamente al aumentar la relación disolvente/ material vegetal hasta un máximo, lo que se corroboró mediante el diagrama de Pareto (figura 1) donde se puede observar que su influencia es en forma positiva.
En el gráfico de efectos principales (figura 2) se observa que el rendimiento aumenta al aumentar la relación disolvente/material vegetal hasta un punto máximo donde subsiguientemente comienza a declinar. En general, una mayor relación del volumen de disolvente al material vegetal puede ser muy eficaz en los métodos de extracción convencionales. Por el contrario, en MAE una relación más alta puede disminuir el rendimiento de la recuperación. Cuando la cantidad de disolvente es demasiado alta, el disolvente absorbe más energía de microondas y la absorción de energía de microondas por parte de la materia prima disminuye, lo que provoca una disminución en la capacidad de las microondas para romper las células de la materia prima y el rendimiento de los metabolitos de interés. (Wang y Weller, 2006; Mason et al., 2011; Salomon S et al., 2016; Zhang et al., 2021)
Al analizar el tiempo no se evidenció un efecto estadísticamente significativo sobre el rendimiento de coumarinas bajo las condiciones de estudio (figura 1), sin embargo, a medida que se incrementa se observa que aumenta el rendimiento hasta un máximo (figura 2) lo cual podría explicarse debido a que el aumento del tiempo de extracción incrementa la efectividad del proceso debido a que la acción de las microondas favorece la penetración del disolvente dentro de la matriz sólida. Esta penetración se lleva a cabo de forma rápida al inicio del proceso de extracción debido a la ruptura celular provocando la desabsorción de las coumarinas, difundiéndolos al medio circundante (Prakash y Manikandan, 2012;Aourach et alet al., 2021). Ulterior a ese máximo el rendimiento decae, lo cual presupone que una exposición de tiempo excesiva pudiera provocar la degradación de los polisacáridos debido la alta temperatura interna que se genera por la acción de las microondas. (Prakash et al., 2016; Zhao et al., 2013)
Los resultados del gráfico de superficie respuesta (figura 3) muestra que existe un máximo global el cual corresponde a las condiciones más favorables para la extracción de coumarinas siendo un tiempo de irradiación de 4 min, relación disolvente material vegetal de 20 mL/g y la potencia de 540 W, para una concentración de coumarinas de 0,048 %.
Comparación de la EAM con el método convencional de extracción
En la tabla 2 se muestran los tiempos de extracción y el rendimiento de extracción de coumarinas que se tuvo en cuenta para el análisis de los métodos de extracción.
Existe una gran diferencia en el tiempo en que se lleva a cabo la extracción de coumarinas contenidos en las hojas. Al emplear el método de extracción por microondas el tiempo de extracción fue de 4 min, resultando un tiempo 30 veces más rápido en comparación con el método tradicional.
Mediante el proceso tradicional el rendimiento de la extracción fue de 0,042 ± 0,0018 %, existiendo diferencias estadísticamente significativas entre ambos métodos (p=0,0232), donde el rendimiento obtenido empleando las microondas es 1,14 veces mayor que el obtenido por el método tradicional (figura 4).
Con la extracción asistida por microondas se logran mejores resultados desde el punto de vista del rendimiento y la velocidad de extracción respecto al método de obtención tradicional por reflujo en la obtención del extracto hidroalcohólico a partir de hojas secas de Justicia pectoralis Jacq.
CONCLUSIONES
En este trabajo se utilizó con éxito un diseño Box-Behnken de la metodología de superficie de respuesta para optimizar los parámetros de operación. Los resultados mostraron que la potencia de microondas de 540 W, el tiempo de extracción de 4 min y la relación de disolvente a materia prima de 20:1 fueron las mejores condiciones para la extracción. En comparación con el método tradicional por reflujo, la extracción asistida por microondas demostró superioridad en términos de ahorro significativo de tiempo, con una mayor recuperación de coumarinas. Los resultados mostraron que la extracción asistida por microondas puede ser utilizada como un método eficiente para obtener un extracto hidroalcohólico al 30% de Justicia pectoralis Jacq.
