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Introduccion
La piel constituye una barrera fisiológica entre el organismo y el medio ambiente. Dada a su acción protectora frente a ambientes hostiles y la constante interacción con el medio externo, es posible la aparición de heridas o lesiones en este órgano, como consecuencia de traumas, úlceras, eventos quirúrgicos, entre otros. Ante la presencia de estos eventos traumáticos en la piel, el organismo genera una serie de complejas reacciones bioquímicas que suceden para la restauración y cicatrización de la piel dañada (Gurtner et al, 2008; Eming, 2014; Aarabi et al, 2007).
La cicatrización de heridas es un proceso dinámico caracterizado por la integración de cuatro fases secuenciales basadas en la hemostasia (0 a varias horas después de la lesión), inflamación, proliferación y remodelación. Éstas a su vez, involucran una compleja interacción celular y molecular que implica: migración y proliferación celular, deposición de la matriz extracelular y angiogénesis (Gurtner et al, 2008; Eming, 2014; Aarabi et al, 2007).
En el tratamiento para la cicatrización de las heridas se han aplicado agentes antimicrobianos, técnicas quirúrgicas y una amplia gama de enfoques terapéuticos basados en fármacos y dispositivos. (Wieman et al, 1998; Armstrong et al, 2004). Algunas intervenciones han mostrado un éxito clínico limitado, incluso cuando han estado incluidas en un programa de atención integral de la herida. Las recidivas, en algunos casos siguen siendo un problema que obstaculiza la eficacia clínica de las terapias actuales a corto plazo (Gregor et al, 2008). Por otro lado, la terapia con la mezcla Ozono/ Oxigeno, así como sus formulaciones a base de ello, han sido efectivas como tratamiento para la cicatrización de heridas (Valacchi et al, 2005).
Desarrollo
Mecanismos moleculares de la cicatrización.
Durante el proceso de cicatrización de heridas transcurren diferentes mecanismos, que incluyen: respuesta a la inflamación, formación de nuevos tejidos y remodelación de tejidos (Gurtner et al, 2008; Eming et al, 2014). En las primeras 48 h después de la lesión, se desencadenan mecanismos de hemostasia que comprenden la vasoconstricción local del vaso, agregación plaquetaria y se activan se activan diferentes células inmunes como neutrófilos, monocitos y linfocitos para detener el sangramiento y eliminar los tejidos muertos. Con ello, se logra regular el proceso de inflamación para posteriormente reparar el tejido dañado (Martin, 2005). Por lo que la inflamación juega un papel esencial dentro del proceso de cicatrización, dado que cumple ciertos propósitos en la desinfección de la herida e inducción de la fase de proliferación. Esta fase se caracteriza por la migración de células inflamatorias hacia el tejido lesionado, con la consecuente producción de citocinas pro-inflamatorias y factores de crecimiento. De modo que, si la inflamación se prolonga durante mucho tiempo puede producir daños severos a los tejidos. Por esta razón, los cuidados terapéuticos de las heridas se basan en el control y la reducción de la inflamación (Midwood et al, 2004; de la Torre & Sholar, 2006).
En los próximos 2 a 10 días de producirse la herida, se efectúa la formación del tejido nuevo a través de la proliferación celular y la migración de diferentes tipos de células, como fibroblastos, queratinocitos y células endoteliales. En este punto de formación de tejido nuevo, los fibroblastos juegan un papel muy importante (Eming et al, 2014; Schmidt & Horsley, 2013). Específicamente, los fibroblastos secretan una serie de factores entre ellos, la matriz metalopeptidasa-14 (MMP-14), factor básico de crecimiento de fibroblastos (FGF β) y el factor de crecimiento de fibroblastos-9 (FGF-9) para regular la homeostasis del colágeno, angiogénesis y otras funciones importantes que facilitan la cicatrización de las heridas (Upadhyay et al, 2014; Zheng et al, 2014).
En las próximas 2 a 3 semanas después de la lesión, ocurre el proceso de remodelación del tejido que puede durar un año o más. En este punto, todos los procesos activados a partir de la lesión se reducen y cesan, mientras que las células activadas sufrirán apoptosis. Diferentes células (fibroblastos, macrófagos y células endoteliales) se encargan de secretar metalopeptidasa de matriz para remodelar y fortalecer los tejidos reparados (Gurtner et al, 2008; Lovvorn, 1999).
A su vez, en estas etapas se ponen de manifiesto los factores de crecimiento ya que desempeñan una función esencial en los procesos de reparación y regeneración de los tejidos. Entre los factores de crecimiento involucrados en la cicatrización de heridas se encuentra, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), factor de crecimiento de fibroblastos (FCF) (Ornitz & Itoh, 2001), el factor transformador del crecimiento-betta (FTC-β) (Werner & Grose, 2003) y el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF). Dichos factores de crecimiento son proteínas que estimulan el crecimiento, diferenciación y proliferación celular en el tejido dañado. Además, en el proceso de cicatrización interviene el factor de crecimiento endotelial vascular(FCEV), cuya proteína induce el crecimiento de vasos sanguíneos para la oxigenación del tejido lesionado, y a su vez, ello facilita la restauración de la piel traumática.
Estudios recientes han demostrado que el PDGF es un mediador importante en la cicatrización de heridas que juega un papel primordial en casi todas las etapas, ya que estimula el crecimiento, la diferenciación, proliferación, quimiotaxis y supervivencia de las células. El PDGF se almacena principalmente en los gránulos de plaquetas y puede ser sintetizado por células de diferentes tipos. Los efectos biológicos de los PDGF se muestran activando los receptores PDGF-a y PDGF-b que son dos receptores tirosinas quinasas estructuralmente relacionados (Midwood et al, 2004).
Factores que afectan la cicatrizacion
El oxígeno es esencial para la actividad de las células y de la ocurrencia de eventos oxidativos durante el curso del proceso de cicatrización. Sin embargo, durante la cicatrización de heridas se producen especies reactivas de oxígeno (ERO) en grandes cantidades por medio de las células inflamatorias. La producción excesiva de ERO conlleva a un daño celular (denominado "estrés oxidativo") caracterizado por la peroxidación de lípidos de membrana, la inactivación de enzimas sulfhidrilo, la reticulación de proteínas y la descomposición del ADN. A su vez, la acción de estas sustancias mediatiza la actividad de la familia de enzimas antioxidantes superóxido dismutasa-SOD, catalasa-CAT y de las no enzimáticas glutatión-GSH, ácido ascórbico-AA). El equilibrio entre oxidantes y antioxidantes es crucial durante la cicatrización de heridas, ya que de esta manera se imposibilita el daño a los componentes vitales de la célula y la contaminación de las heridas por microorganismos (Kalay & Coskun, 2012).
Existen procesos infecciosos secundarios que afectan la cicatrización debido a la introducción o proliferación de microorganismos en el sitio abierto de la herida. Ello sin duda agudiza y prolonga los eventos inflamatorios, a través de la migración y proliferación de células inflamatorias, producción de citocinas y liberación de ERO. De modo que la eliminación y/o prevención del ataque bacteriano es un eslabón fundamental, para la obtención de una rápida y efectiva cicatrización de las heridas (Scales & Huffnagle, 2013).
Por otra parte, la cicatrización de heridas puede estar afectada por la Diabetes Mellitus, enfermedad crónica que afecta al 9,3% de la población mundial (International Diabetes Federation, 2015).El proceso de cicatrización de heridas en pacientes diabéticos no está completamente dilucidado, pero se considera que estas afectaciones están dadas por la presencia de diversos factores, entre ellos, anomalías en las producciones de citocinas de las células inflamatorias, deteriorada neovascularización, niveles reducidos de factores de crecimiento, síntesis de colágeno, e incrementados niveles de proteinasas. Fundamentalmente, se plantea que entre los mecanismos que conllevan al retraso y deterioro de la cicatrización de heridas en pacientes diabéticos se encuentran, la escasa producción de citoquinas por células inflamatorias locales y fibroblastos y la reducida angiogénesis. Existen evidencias que han demostrado que los pacientes diabéticos tienen una reducción tisular de las concentraciones de factores de crecimiento, notablemente. Esta disminución afecta la cicatrización natural de las heridas y conduce a heridas crónicas que no cicatrizan y a úlceras del pie diabético (UPD), que posteriormente pueden llevar a la amputación de las extremidades. Más de la mitad de los pacientes con UPD tienen también una enfermedad vascular periférica, caracterizada por la alteración de la circulación de la sangre en las extremidades inferiores, que conlleva a una falta de oxigenación del pie (conocido como pie isquémico). Las UPD isquémicas son las más difíciles de tratar y tienen un mayor riesgo de amputación (Berlanga et al, 2013).
La desregulación de cualquiera de las reacciones bioquímicas que propician el crecimiento del tejido dañado y la inactividad del sistema antioxidante, origina una curación deteriorada, por ejemplo, úlceras crónicas difíciles de curar o cicatrización excesiva, que conlleva al incremento del uso de medicamentos, limitaciones en la calidad de vida del paciente y a la imposibilidad de su incorporación a la sociedad, lo que ocasiona pérdidas económicas importantes (Chávez et al, 2018; Villacrés, 2016).
Tratamientos
Las terapias empleadas para tratar las heridas de la piel, son muy amplias y varían, según la magnitud de la lesión. Uno de los remedios naturales más antiguos para la curación de heridas es el azúcar (sacarosa), debido a su índice de osmolaridad que contribuye a la reducción rápida del edema local, y a su vez, permite el paso de elementos plasmáticos y aporta calorías al organismo(Vizcaíno et al, 2013).Así mismo, se emplean formulaciones a base de miel de abejas (alto contenido de sacarosa), por sus propiedades antibacteriana, antiinflamatoria, antioxidante; además estas formulaciones contribuyen a la granulación, la epitelización y la angiogénesis(Chirife et al, 1983). Diversas investigaciones han reportado las evidencias que justifican el uso de plantas medicinales, como la Psidiumguajava L. (Okamoto, 2010) y la Morindacitrifolia L. (Nayak et al, 2009) dado su efecto antimicrobiano que favorece a la cicatrización de heridas. Por otro lado, existen terapias encaminadas a la creación del tejido de granulación, que incluyen: la utilización de factores de crecimiento, células madre y más recientemente la terapia génica (Berlanga et al, 2013).
Actualmente, el medicamento Heberprot-P constituye una de las terapias más empleadas y certeras para el tratamiento de la cicatrización de heridas del pie diabético, dado los resultados novedosos que ha aportado para la ciencia. Dicho producto contiene factor de crecimiento epidérmico humano recombinante, el cual es administrado mediante infiltración perilesional e intralesional. Específicamente, en pacientes diabéticos se requieren tratamientos que mejoren la cicatrización de estas heridas, con énfasis en la capacidad regenerativa para estimular la actividad de citoquinas y la angiogénesis. (Berlanga et al, 2013; Fernández et al, 2009). En Cuba, desde hace ya 20 años se dispone del Hebermin, formulación farmacéutica semisólida basada en EGF, útil para estimular la cicatrización de lesiones cutáneas agudas. (Berlanga, 2010).
Otro de los tratamientos ampliamente utilizados en la actualidad, para la cicatrización de heridas tanto del pie diabético, heridas quirúrgicas y otras que cierran por segunda intención, es la ozonoterapia, tanto en forma gaseosa como Mezcla Ozono/Oxígeno (MOO), como en aceites ozonizados (AO) de diferentes orígenes.
Uso de la mezcla ozono/oxígeno en la cicatrización de heridas
La ozonoterapia se ha utilizado como tratamiento adyuvante en heridas de la piel, especialmente en pacientes diabéticos (Zhang et al, 2014) debido a su actividad antimicrobiana y antioxidante (Valacchi et al, 2005). El ozono ha sido empleado en la clínica como agente terapéutico en enfermedades inflamatorias agudas y crónicas, así como en quemaduras y úlceras diabéticas. A pesar de sus beneficios, pocos estudios se han centrado en la comprensión de su mecanismo de acción (Elvis &Ekta, 2011), sin embargo, dicho producto se ha utilizado empíricamente durante décadas. Diversos estudios han demostrado que la ozonoterapia incrementa la expresión de varios factores de crecimiento, incluyendo FCEV, TGF-β y PDGF (Zhang et al, 2014). Además, se ha demostrado que la ozonoterapia favorece la oxigenación y el metabolismo de los tejidos, interfiriendo en el equilibrio oxidante / antioxidante (Travagli et al, 2010; Viebahn et al, 2012).
Basado en este mecanismo, el ozono es capaz de regular los niveles de H2O2 mediante la estimulación del sistema antioxidante, lo cual genera un escenario favorable a la recuperación del tejido dañado (Viebahn et al, 2012).
Por otro lado, la mezcla ozono/oxígeno (MOO) ha sido ampliamente reconocida como uno de los mejores agentes, bactericidas, antiviral y antifúngico (Valacchi et al, 2005), por lo que ha sido ampliamente utilizado como agente terapéutico en heridas crónicas, úlceras isquémicas y lesiones en pacientes diabéticos (Martínez et al, 2005; Bocci et al, 2005). Hasta entonces, se conocía que el efecto beneficioso de la MOO sobre la cicatrización de heridas era debido a la reducción de la infección bacteriana o por el incremento de la oxigenación del tejido del área dañada (Lim et al, 2006; Gajen draredd y et al, 2005). Sin embargo, es conocido que las exposiciones a la MOO se encuentran asociadas a la activación del factor de trascripción NF-κB; este es un importante regulador de la respuesta inflamatoria y eventualmente de todo el proceso de cicatrización de las heridas (Valacchi et al,2002; Valacchi et al, 2005; Janic et al, 2005). Se demostró que, grandes cantidades del y el FTC-β, fueron liberados de las plaquetas del plasma heparinizado de pacientes con miembros isquémicos, después del tratamiento con la MOO (Valacchi & Bocci., 1999). Posteriormente, en otros estudios realizado por Sen et al, 2002, se demostró que el peróxido de hidrógeno (H2O2) indujo potencialmente la expresión del FCEV en queratinocitos humanos, los cuales pueden estimular la cicatrización de heridas.
La acción cicatrizante del ozono fue demostrada en un modelo experimental de heridas punzante en ratas, en el cual se administró dicho producto por vía subcutánea. En este caso se afirmó que a los 7 días de tratamiento hubo formación del tejido de granulación con un número reducido de células inflamatorias, un incremento de fibroblastos y células endoteliales y deposición de colágeno. A su vez se obtuvo que el factor de crecimiento de fibroblasto (FGF2) se sobreexpresó en macrófagos y miofibroblastos, lo que podría indicar una mejora en la cicatrización de heridas mediante la neocolagénesis y reepitelización del tejido. Dicho resultado indica un posible mecanismo de acción, por el cual el ozono podría aumentar la proliferación miofibroblástica, mejorando el proceso de curación de heridas (Soares et al, 2019).
Mediante un estudio in vitro, se evaluó la citotoxicidad del ozono en líneas celulares fibroblastos (L929) y keratinocitos (HaCat), e igualmente se evaluó su efecto sobre la migración y su actividad antimicrobial. Los cultivos celulares fueron tratados con salina buffer fosfato (PBS) y tratado con ozono a las concentraciones de 8, 4, 2, 1, 0,5 y 0,25 µg/ml. El Ozono, no fue citotóxico a ninguna de las concentraciones evaluadas, sin embargo, se demostró un incremento significativo de la migración de fibroblastos a la concentración de 8 µg/ml de ozono, actividad importante dentro del proceso de cicatrización (Borges et al, 2017).
La migración de células es un evento fundamental dentro del proceso de cicatrización, y la migración de fibroblastos es específicamente esencial durante la segunda fase de la cicatrización, cuando el tejido de granulación es formado, y los fibroblastos son reclutados mediante los factores de crecimientos producidos por los macrófagos (Zielins et al, 2014). Zhang et al 2014, estudiaron la expresión de factores de crecimiento en la biopsia de tejido de pacientes con úlceras de pie diabético tratados con ozonoterapia y detectaron un aumento significativo en la expresión de factor de crecimiento transformador β (TGF- β), FCEV y factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), con respecto al grupo control, así como el acrecentamiento en la reducción del tamaño de la úlcera. Por tanto, un incremento en la migración de fibroblastos, justificada mediante la sobreexpresión de los factores de crecimiento, puede explicar en parte el efecto aditivo de la ozonoterapia en la cicatrización de heridas, los cuales han sido descritos en estudio tanto clínicos como experimentales (Patel et al 2011; Zhang et al, 2014; Buyuk et al, 2015).
Aceites ozonizados, evidencias de su accion cicatrizante
Otros productos naturales transformados químicamente, utilizados como cicatrizantes de heridas, son los aceites ozonizados (AOs), actividad cicatrizante que ha sido demostrada tanto clínica como experimentalmente. La estimulación del proceso de cicatrización por parte de los AOs, se basa fundamentalmente en la activación local de la expresión de factores de crecimiento, la reducción de la infiltración de neutrófilos en el tejido y la estimulación entonces de la formación del tejido de granulación. (Pai et al, 2014)
El aceite de girasol ozonizado (AGO) registrado con el nombre comercial (OLEOZON()tópico) constituye una mezcla de principios activos (hidroperóxidos, peróxidos, aldehídos, ozónidos) obtenidos a partir de la ozonización parcial del aceite de girasol (Díaz M et al, 2001; 2005; 2008; Ledea 2004; 2005). Dicho producto ha mostrado su acción germicida como efecto farmacológico principal mediante diversos estudios (Sechi et al, 2001, Curtiellas et al,2005; 2008) y como acciones pleiotrópicas presenta actividad antiinflamatoria tanto en modelo agudo (Zamora et al, 2006) como crónico (Zamora et al, 2018). La acción cicatrizante del AGO fue demostrada en la herida punzante en el pabellón de la oreja de ratones como modelo experimental, mediante la reducción de los indicadores morfométricos (diámetro y área de la herida), acompañado de una mayor intensidad en la migración de células inflamatorias hacia el sitio de la lesión (Sánchez et al, 1997; Barroetabeña et al, 2002). De esta forma se confirmó que el AGO, en una fase inicial de la cicatrización caracterizada por la migración células inflamatorias (respuesta inflamatoria inicial), favoreció dicha fase. En este caso, se puede inferir que el AGO, tiene una acción pro-inflamatoria, tal como demostró Hiromi et al, 2009, al aplicar el aceite de oliva ozonizado (AOO) en la piel de ratones, acción reversible que favorece la fase inicial inflamatoria de la cicatrización, lo cual contribuye al proceso de reparación y regeneración tisular.
Otro de los aceites ozonizados ampliamente estudiado en cuanto a su acción cicatrizante, ha sido el AOO. Las aplicaciones de AOO en un modelo de úlceras en piel de ratones inducidas por presión, inhibió la purulencia y la hemorragia, pero no suprimió la reacción inflamatoria por completo y de esta forma promovió la infiltración de células e indujo la formación del tejido de granulación (Sakazaki et al,2007). Adicionalmente, otra de las acciones descritas para el AOO, fue que redujo la fase supurativa de la herida, sin afectar las fases de la cicatrización.
Otro aspecto importante, del mecanismo de acción mediante el cual los aceites ozonizados reducen el tiempo de cicatrización, es mediante el incremento en la síntesis de colágenos unido a la actividad de la superóxido dismutasa (SOD) (Pai et al, 2014).Si se considera en este caso, que durante la etapa inflamatoria del proceso de cicatrización se favorece el estrés oxidativo, por la generación de H2O2 (quien se encuentra vinculado con la inducción potencial de FCEV en los keratinocitos) (Sen et al, 2002), a partir de los tejidos dañados isquémicos y la infiltración de neutrófilos; el incremento de la actividad de la SOD, favorece de forma indirecta la restauración del tejido dañado. Si bien, el H2O2, actúa como un inductor fisiológico de la expresión de factores de crecimiento, en este caso, se describe que el mecanismo de acción cicatrizante del aceite de sésamo ozonizado (ASO), se encontró asociado al incremento de la expresión del FCEV, los niveles del antígeno nuclear de la proliferación celular (ANPC), el factor de transcripción nuclear NF-κB (Valacchi et al, 2011).
A su vez, se demostró en un modelo experimental de heridas punzante en ratones diabéticos, que el aceite de semilla de uva ozonizado contribuye a la cicatrización de heridas a través de la inhibición de los mecanismos inflamatorios mediados por el incremento en la actividad antioxidante de las enzimas glutatión y tiorredoxina. De esta forma se confirmó que la hipótesis del mecanismo de acción de los AOs basada en la activación del NFκB como marcador de estrés oxidativo, estimula el efecto antinflamatorio durante la cicatrización de heridas. Dicha fase antiinflamatoria primaria da lugar a la formación de la matriz extracelular mediante la activación y proliferación de fibroblastos y queratinocitos (Valacchi et al. 2011; Guerra et al, 2017)
Tal como se ha evidenciado, también sustancias ozonizadas como la formulación de crema a base de teobroma ozonizado, incrementó la actividad antioxidante endógeno en la piel de ratas dañada por radiaciones UV (Sánchez et al,2011).
Estudios clínicos realizados en diferentes especies de animales, han demostrado la acción cicatrizante del AGO, tal es el caso de heridas causadas por la castración de crías porcinas (Camps et al, 2006a) y en caballos de tiro con lesiones causadas por fricción (Camps et al, 2006b). Por otra parte, la acción cicatrizante del AGO también se acreditó en heridas realizadas de forma experimental en aves domésticas, aseverando la efectividad del producto, incluso en dicha especie (Camps et al, 2007)
Otro estudio realizado demostró la efectividad del aceite de andiroba ozonizado (AOA) como cicatrizante de heridas inducidas experimentalmente en piel de caballos. Macroscópicamente se evidenció que el 69,84 % de la lesión fue recuperada con el tratamiento con el AOA. La evaluación histopatológica reveló que el uso del AOA tuvó una avanzada repitelizaciόn del tejido lesionado, como consecuencia de la proliferación de fibroblastos, la deposición de colágeno, moderada proliferación vascular y la presencia de infiltrado de células polimorfonucleares (PMN) y discreta presencia de células mononucleares (MN) (Araujo et al, 2017).
Otro estudio experimental sobre la acción cicatrizante del aceite de camelia ozonizado (ACO), demostró que la aplicación de ACO redujo el diámetro de la herida, mediante el incremento de la expresión de colágeno tipo I, α-actina del músculo liso (α SMA), factor de crecimiento transformante-β (TGF-β),RNAm, los niveles de proteínas y la migración de fibroblastos. Por otra parte, el ACO incrementó el proceso de transición mesinquimal-epitelial (TME) en los fibroblastos por vía del acrecentamiento de la fibrinectina, v imectin N cadherin, metalopeptidasa de matriz (MMP)-2, MMP-9, insulina como proteína de unión con el factor de crecimiento y decremento de la proteína E-cadherin y la expresión del marcador celular de senescencia p16. El mecanismo molecular, reveló que el ACO, incrementó la fosforilaciόn de fosfatidilinositol 3-quinasa (P13K), proteína quinasa B (Akt) y la diana rapamicina en células de mamífero (mTOR) para regular el proceso de transición epitelial-mesenquimal (TME). Por último, el ACO indicó una reducción significativa de la respuesta de fibroblastos activados con lipopolizacarido (LPS), mediante la reducción de la expresión de factor de necrosis tumoral (FNT) e interleucina 6 (IL6). Resultados que sugieren la acción cicatrizante del AO, mediante el incremento de la migración de fibroblastos y el proceso de TME mediante la vía de señalización P13K/Akt/mTOR in vivo e in vitro (Xiaoet al, 2017).
Otras formulaciones a base de AOs, como los geles, han evidenciado también su acción cicatrizante de hueso mandibular después de la extracción de dientes en conejos con diabetes mellitus inducido por aloxano. Histológicamente, se evidenció que el grupo tratado con el producto (gel de ozono) incrementó la nueva formación de trabéculas del hueso y la vascularización (Aya et al, 2019).
Conclusiones
El tratamiento con la mezcla Ozono/Oxígeno y las formulaciones de los aceites ozonizados demostraron efectividad para la cicatrización de las heridas de la piel, a través de diferentes mecanismos moleculares, basados en la inhibición de la respuesta inflamatoria, incremento de angiogénesis y activación del sistema antioxidante que contribuye con la restauración de la piel dañada.
