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Introducción
La búsqueda de nuevos compuestos químicos a partir de fuentes naturales, en especial las plantas medicinales, constituye una de las áreas de investigación importantes hoy en día en todo el mundo. Por tanto, encontrar nuevas entidades químicas en las especies vegetales medicinales, constituye una necesidad actual, ya que son objeto de investigación, tanto en el campo de la Fitoquímica, como en el de la Farmacología, para el tratamiento de una amplia variedad de patologías.1-2
Cuba, cuyos planes de salud abarcan las más distantes zonas del país, posee una valiosa tradición en la utilización de las plantas medicinales y una flora muy diversa que permite su explotación racional. Existen muchas especies vegetales desconocidas científicamente, que son usadas por la población cubana, sin conocer los riesgos que estas pueden ocasionar, cobrando gran importancia el estudio de las mismas.3-4
Basado en esto y teniendo en cuenta la riqueza florística y medicinal de nuestro país, se destaca la presencia de numerosas especies vegetales, algunas de ellas de carácter endémico y otras que se han adaptado a nuestro ecosistema. Todas constituyen en muchos casos, valiosos pero prácticamente desconocidos recursos naturales. Tal es el caso de la especie Dendropanax arboreus (L) Decne & Planch, conocida en Cuba popularmente como ramón de vaca, vibona o palo santo.5-6) La misma pertenece a un género de plantas con flores representante de la familia Araliaceae, consta de 92 especies de árboles perennes y arbustos, ubicados en los bosques húmedos.5-7
Son pocos los reportes de estudios realizados sobre la especie. Escasamente se conoce que la corteza mezclada con las hojas, sana los tumores de las mamas y alivia las inflamaciones. En forma de decocción, las hojas y raíces son empleadas para tratar fiebres exantemáticas y las quemaduras del guao.7-8) Además, éste árbol sirve como refugio para aves migratorias neárticas en México.9
Resulta interesante el uso de esta planta por los pobladores de las Minas, Baracoa, Guantánamo, los cuales refieren utilizar las hojas para el forraje vacuno, favoreciendo la producción de leche. Además de utilizar la savia del tronco, extraída manualmente de forma rudimentaria, para ser aplicada directamente en los ojos, observando una notable mejoría tras el desprendimiento del tejido anormal conjuntivo que crece sobre la córnea, conocida como carnosidad de los ojos.
Debido al amplio uso medicinal tradicional de esta especie vegetal y la no existencia de estudios fitoquímicos y farmacológicos, surge el interés de iniciar esta investigación siguiendo las pautas establecidas en la Ruta Crítica de Investigación con plantas medicianles y teniendo en cuenta los requisitos para el inico de una investigación fitoquímica.11-10 Por lo que el presente trabajo tiene como objetivo: evaluar la composición química cualitativa de extractos obtenidos a partir de la savia del tronco de la especie Dendropanax arboreus (L) Decne & Planch. empleando diferentes disolventes y métodos de extracción.
Materiales y métodos
Características generales de la investigación
Se realizó un estudio experimental, con el propósito de determinar la composición química cualitativa, por la técnica de tamizaje fitoquímico 12, de extractos obtenidos empleando diferentes métodos y disolventes de extracción, a partir de la savia del tronco de la especie Dendropanax arboreus (L) Decne & Planch. Esta investigación se llevó a cabo en los laboratorios del grupo de investigación de Productos Bioactivos y Química Sostenible y en el de Tecnología Farmacéutica, pertenecientes a los Departamentos de Química y Farmacia respectivamente, de la Facultad de Ciencias Naturales y Exactas, en la Universidad de Oriente, en el período de tiempo de Enero a Mayo.
Recolección y procesamiento del material vegetal
La especie vegetal se recolectó en Las Minas, Baracoa, Guantánamo. La identificación de la misma a través de la presentación de diferentes órganos de la planta (hojas y flores principalmente), corroboró que el material vegetal corresponde a Dendropanax arboreus (L) Decne & Planch. La especie fue identificada taxonómicamente por personal especializado en el Centro Oriental de Ecosistemas y Biodiversidad (BIOECO), del Museo Tomás Romay, de Santiago de Cuba.
Para la recolección de la savia, se procedió primeramente a quitar la corteza del tronco, este se raspó con un cuchillo hasta obtenerla, almacenándose a temperatura ambiente, en frasco de color ámbar para evitar la posible alteración por los efectos de la luz.
Para la determinación de la capacidad extractiva de los métodos propuestos (Maceración y Extracción continua con Soxhlet) se tuvieron en cuenta dos variables: valores de sólidos totales y composición química cualitativa de cada extracto. Ambos resultados determinaron la selección de la mejor combinación método/disolvente.
Obtención de los extractos
Se llevó a cabo a través de los dos métodos antes mencionados y consistió en poner en contacto el material vegetal con disolventes de diferentes polaridades.12
Método de extracción con Soxhlet
Se colocan 10 g de materia vegetal (savia) en un dedal para Soxhlet. Luego se adicionan 100 mL del disolvente de extracción (éter dietílico, etanol 95% y agua, en orden sucesivo de polaridad creciente) en un balón de 200 mL. Se coloca en el Soxhlet un condensador y se aplica calor al balón. Se esperan 4 descargas del Soxhlet y se retira el balón. Se decanta el líquido a un recipiente ámbar preparado para almacenar el extracto.13
Método de maceración
Se pesan 30 g de la savia y se pone a macerar con 100 mL de cada uno de los disolventes empleados: éter dietílico, etanol 95% y agua, en orden sucesivo de polaridad creciente, durante 72 h, agitándose tres veces al día para facilitar la difusión de los constituyentes que están en la parte más interna, de las células. Luego el líquido es separado a través de la filtración a gravedad empleando papel de filtro.13-14 Se almacena en un frasco ámbar.
Determinación de los sólidos totales
Para la determinación de los sólidos totales se procedió según lo descrito en la Norma Ramal de Salud Pública # 312 15, donde se establecen los parámetros de calidad para los extractos vegetales.
Procedimiento
De la muestra de ensayo previamente homogenizada se transfirieron 5 mL a una cápsula de porcelana limpia, seca y previamente tarada; la cápsula se colocó en un baño de agua y se evaporó hasta que el residuo estuvo aparentemente seco; posteriormente se pasó a una estufa a una temperatura de 105 ± 2 °C durante 3 horas. Se retiró la cápsula de la estufa, se colocó en una desecadora hasta que alcanzó la temperatura ambiente y se pesó. Se repitió el proceso anterior, pero empleando solo 60 minutos de secado, las veces necesarias, hasta obtener una masa constante. El ensayo se realizó por triplicado.
Expresión de los resultados:
Los sólidos totales (St) se calcularon mediante la fórmula siguiente:
donde
Pr masa de la cápsula más el residuo (g), P masa de la cápsula vacía (g) y V volumen de la porción de ensayo (mL)
Determinación de la composición química de los extractos
La determinación de la composición química cualitativa de los extractos se realizó según la técnica de tamizaje fitoquímico, la cual es utilizada para identificar los metabolitos secundarios presentes en las especies vegetales, desde el punto de vista cualitativo. La misma se basa en la realización de reacciones químicas con diferentes reactivos, donde la aparición de una evidencia positiva, que puede ser un cambio de color, la formación de un precipitado, es indicativo de la presencia de un determinado metabolito. Para llevar a cabo esta técnica se usan varios esquemas de trabajo, ensayándose en cada extracto los metabolitos, que de acuerdo a su solubilidad, puedan ser extraídos en estos solventes, según describe la bibliografía.12
Resultados y discusión
Análisis estadístico de la determinación sólidos totales según la relación método-disolvente
La determinación de los sólidos totales resulta de gran importancia cuando de una planta se pretende extraer la mayor cantidad de metabolitos presentes en la misma.13,15 Esto da un criterio de la capacidad extractiva del método seleccionado, así como el disolvente utilizado, por lo que resulta interesante hacer una comparación estadística Anova multicomponentes (tabla 1).
Como se refleja en la tabla 1, los mejores resultados de determinación de sólidos totales se observan en el método de extracción continua con Soxhlet para todos los disolventes empleados, siendo mayor en el extracto acuoso. Estos resultados constituyen un indicativo de la capacidad de extracción de este método. También es notable que el disolvente que presuntamente muestra más capacidad extractiva sea el agua para ambos métodos.
Al analizar los resultados de sólidos totales a través de la variable disolvente (P-valor = 0,000), se observa que entre los mismos existen diferencias estadísticamente significativas dado al p-valor menor que 0,05 para un nivel de confianza del 95 %. Lo que se debe a la diferencia de polaridad de los disolventes empleados. Al comparar los métodos utilizados mediante esta prueba Anova multicomponente es posible notar que si existen diferencias significativas en cuanto al método extractivo utilizado. Sin embargo, el P-valor supera el 0,05 cuando se tiene en cuenta la combinación método-disolvente, indicando que el comportamiento para ambos métodos es semejante cuando se pasa de un disolvente a otro incrementando la polaridad.
Tabla 1 - Resultados de sólidos totales expresados en porciento
Método extracción/disolvente
Éter dietílico
Alcohol 95 %
Agua
P-valor
V ± DS
V ± DS
V ± DS
Soxhlet
0,034 ± 0,005
0,110 ± 0,001
0,121 ± 0,002
0,0046
Maceración
0,013 ± 0,001
0,082 ± 0,001
0,102 ± 0,002
P-valor
0,00
0,0604
Leyenda: V ± DS: significa valor obtenido de sólidos totales ± desviación estándar
Una prueba de rangos múltiples realizada aporta criterios respecto a la variabilidad introducida por el cambio de disolvente. Existen diferencias estadísticamente significativas, siendo remarcadas entre éter -agua y éter-etanol, no así entre etanol - agua, donde existe homogeneidad entre ellos, lo que significa que se puede escoger uno u otro, para ser empleado en la extracción de los metabolitos secundarios, por ambos métodos. Un gráfico de interacción ilustra que el método de extracción contínua es mas eficiente (figura 1).
Fig. 1 - Gráfico de interacción método-disolvente obtenido en el programa Statgraphics Plus
La extracción con Soxhlet resulta ser la que produce mayores sólidos totales en todos los casos. Esto se debe a que al utilizar una fuente de calor, el factor temperatura es una variable que influye en el proceso de extracción, pudiendo romper algunas barreras biológicas naturales, como las paredes celulares, garantizando así una mayor salida de sustancias hacia el disolvente.14 Además del evidente efecto de la temperatura en el aumento de la solubilidad de los metabolitos. Por otra parte la maceración consiste desde el punto de vista químico-físico, en la interacción del disolvente con la materia a temperatura ambiente, esto reduce el proceso de extracción a la difusión lenta y gradual de los metabolitos al seno del líquido empleado.16
Esta observación está en correspondencia con los resultados obtenidos en la determinación de la composición química cualitativa, pues en los extractos obtenidos por el método de Soxhlet se evidencia la presencia de metabolitos identificados en los extractos obtenidos por maceración. La selección del disolvente de extracción es un criterio fundamental a tener en cuenta en todo proceso extractivo.13
Determinación de la composición química cualitativa de los extractos
Una identificación cualitativa se realizó a los extractos para comparar cualitativamente la capacidad extractiva de los métodos empleados. En la tabla 2 se muestran los resultados.
Tabla 2 - Tamizaje fitoquímico a los extractos obtenidos por el método de maceración
Metabolitos
Ensayos
Extracto etéreo
Extracto etanólico
Extracto acuoso
Evidencia
Observaciones
Evidencia
Observaciones
Evidencia
Observaciones
Alcaloides
Dragendorf
+++
Precipitado color rojo ladrillo
++
Turbidez definida o
++
Turbidez definida
Mayer
+++
Precipitado coposo color amarillo
Opalescencia
++
Turbidez color crema
Wagner
Opalescencia
Opalescencia
Opalescencia
Triterpenos y esteroides
Solkowski
Color amarillo rojizo
Color amarillo rojizo
Color amarillo rojizo
Flavonoides
H 2 SO 4
Color marrón
Color marrón
Color marrón
Shinoda
Color amarillo tenue
Color amarillo tenue
Color amarillo tenue
Saponinas
Espuma
NR
-Espuma en la superficie de 3mm por 2,5 min
Resina
Agua destilada.
NR
-No precipitado
No precipitado
Azúcares reductores
Felhing
NR
-Precipitado amarillo
No cambio de color
Benedict
No precipitado
No precipitado
No precipitado
Cumarinas
Baljet
Toma color del reactivo
Toma color del reactivo
Toma olor del reactivo
Aceites esenciales
Sudan III
No gotas oleosas
NR
NR
Aminoáci-dos y aminas
Ninhidrina
NR
NR
Color azul violáceo
Quinonas
Borntrager
Transparente
Color amarillo
Transparente
Fenoles y taninos
Cloruro férrico
Color amarillo naranja
Color amarillo naranja
Color rojo vino
Mucílagos
Mucílagos
NR
NR
No gelatinoso
Poliurónidos
Poliurónidos
NR
NR
No precipitado
Leyenda: (+++) indica evidencia positiva clara; (++) indica evidencia positiva, (+) indica evidencia positiva con posibilidades de interferencias o no definida, (-) indica resultado negativo; (NR) ensayos no realizados.
Los metabolitos identificados en el extracto etanólico coinciden con los del extracto etéreo. En el extracto acuoso se identificó además la presencia de fenoles, taninos, saponinas, aminas y aminoácidos, cuyas estructuras químicas permiten la formación de enlaces por puentes de hidrógeno y así solubilizarse en este disolvente. Estos resultados muestran la afinidad de los diferentes grupos de metabolitos para extraerse en uno u otro disolvente, según sus características estructurales y polaridad.
En el extracto etéreo se identificó la presencia de alcaloides, flavonoides, triterpenos y esteroides; que además, están presentes en los extractos etanólico y acuoso. Nótese que la presencia de alcaloides en ellos se hace más evidente cuando se realizan los ensayos de Dragendorff y Mayer. Los ensayos de alcaloides indican que su presencia es importante y significativa en esta parte de la planta, ya que éstos son notables en todos los extractos analizados. Los alcaloides por sí solos son compuestos que presentan una gran variedad estructural y a su vez, una amplia gama de aplicaciones y actividades biológicas, entre las que se destacan la antinflamatoria, antibacteriana, antioxidante, entre otras.16 Por las propiedades terapéuticas atribuidas pudieran ser los posibles responsables de las propiedades curativas descritas por los campesinos, que usan esta savia para la cura del Pterigion. O bien pudiera suceder que ocurriera un sinergismo farmacológico, dado a la acción de varios metabolitos en conjunto, como sería la combinación de los alcaloides con los flavonoides, los cuales también son reportados como antiinflamatorios y antioxidantes.17
En la tabla 3 se muestran los resultados de los ensayos realizados a los extractos que se obtuvieron mediante extracción con Soxhlet. En este caso fue posible evidenciar, al igual que en la maceración, la presencia de alcaloides, flavonoides, triperpenos y esteroides, en los tres extractos (etéreo, etanólico y acuoso). Otros metabolitos identificados en el extracto acuoso corresponden a resinas, azúcares reductores, aminoácidos libres, fenoles y taninos, poliurónidos, que por sus caraterísticas estructurales se obtienen en éste.
En ambos métodos se identifican mayor variedad de metabolitos en el extracto acuoso. Al parecer las diferencias más notables entre los dos métodos de extracción radican en la diversidad de metabolitos extraídos, siendo el método de Soxhlet el que logra extraer metabolitos secundarios no separados a partir de la tradicional maceración. En este caso, solo es posible extraer por Soxhlet y no por maceración resinas, poliurónidos y azúcares reductores (positivos a Felhing).
Hasta este punto, parece ser que la extracción con Soxhlet resulta más eficiente. Sin embargo, hay que tener en cuenta la influencia de las altas temperaturas en la naturaleza de los metabolitos, ya que un incremento de la misma puede traer como desventaja la degradación de compuestos termolábiles, así como la ocurrencia de reacciones indeseadas entre metabolitos, como aminas libres y compuestos con grupos carboxílicos, provocando interferencias o falsos negativos, cuando el resultado podría ser positivo Los metabolitos identificados en el extracto etanólico coinciden con los del etéreo. En el acuoso se identificó además la presencia de fenoles, taninos, saponinas, aminas y aminoácidos, cuyas estructuras químicas permiten la formación de enlaces por puentes de hidrógeno y así solubilizarse en este disolvente. Estos resultados muestran la afinidad de los diferentes grupos de metabolitos para extraerse en uno u otro disolvente, según sus características estructurales y polaridad.
En el extracto etéreo se identificó la presencia de alcaloides, flavonoides, triterpenos y esteroides; que además, están presentes en los extractos etanólico y acuoso. Nótese que la presencia de alcaloides en los tres extractos se hace más evidente cuando se realizan los ensayos de Dragendorff y Mayer, como se muestra en la tabla 3.
Tabla 3 - Resultados de los ensayos realizados a los extractos obtenidos por extracción con Soxhlet
Metabolitos
Ensayos
Extracto etéreo
Extracto etanólico
Extracto acuoso
Evidencia
Observación
Evidencia
Observación
Evidencia
Observación
Alcaloides
Dragendorf
+++
Precipitado color rojo ladrillo
++
Turbidez definida color rojo ladrillo
++
Turbidez definida color rojo ladrillo
Mayer
+++
Precipitado coposo color amarillo
++
Turbidez color crema
++
Turbidez color crema
Wagner
Opalescencia
Opalescencia
+++
Precipitado carmelita
Triterpenos y esteroides
Solkowski
Color amarillo rojizo
Coloración amarilla rojiza
Coloración amarilla rojiza
Flavonoides
H2SO4
Color marrón
Color marrón
Color marrón
Shinoda
Color amarillo tenue
Color amarillo tenue
Color amarillo tenue
Saponinas
Espuma
NR
-No espuma en la superficie
Resina
Agua destil.
NR
No precipitado
Precipitado
Azúcares reductores
Felhing
NR
Precipitado amarillo
Precipitado rojizo
Benedict
No precipitado
No precipitado
No precipitado
Cumarinas
Baljet
Toma color del reactivo
Toma color del reactivo
Toma color del reactivo
Aceites esenciales
Sudán III
No gotas oleosas
NR
NR
Aminoácidos y aminas
Ninhidrina
NR
NR
Color azul violáceo
Quinonas
Borntrager
Transparente
Color amarillo
Fenoles y taninos
Cloruro
férrico
NR
Color amarillo naranja
Color rojo vino
Mucílagos
Mucílagos
NR
NR
No gelatinoso
Poliurónidos
Poliurónidos
NR
NR
Precipitado
Principios amargos y astringentes
Prueba de sabor.
NR
NR
NR
-
Leyenda: (+++) indica evidencia positiva clara; (++) indica evidencia positiva, (+) indica evidencia positiva con posibilidades de interferencias o no definida, (-) indica resultado negativo; (NR) corresponde a ensayos no realizados.
Los alcaloides por sí solos son compuestos que presentan una gran variedad estructural y a su vez, una amplia gama de aplicaciones y actividades biológicas, entre las que se destacan la antinflamatoria, antibacteriana, antioxidante, entre otras.16 Por las propiedades terapéuticas atribuidas pudieran ser los posibles responsables de las propiedades curativas descritas por los campesinos que usan esta savia para la cura del Pterigion. O bien pudiera suceder que ocurriera un sinergismo farmacológico, dado a la acción de varios metabolitos en conjunto, como sería la combinación de los alcaloides con los flavonoides, los cuales también son reportados como antiinflamatorios y antioxidantes.18 Tal vez la explicación a la no detección de saponinas en los extractos obtenidos mediante soxhlet, mientras sí aparencen al realizar la maceración, sea resultado de reacciones indeseadas con otros metabolitos al utilizar calor en el proceso.
Cabe destacar que algunos de los tipos de metabolitos determinados en esta investigación han sido reportados con anterioridad para otras especies del género Araliaceae, como la Dendropanax chevalieri, de cuyas raíces se han aislado: triterpenos, glicósidos, alcoholes de cadena larga, derivados del fenilpropanol, entre otros.19
Otras especies como la Dendropanax morbiferus H. Lév han sido estudiadas encontrándose en ese caso 28 compuestos conocidos: 4 alcaloides, 1 piranoglucósido, ácido benzoico y 5 derivados, 10 fenilpropanoides, 4 glucósidos derivados de flavonas, 1 neolignano y 2 sesquiterpenos.20 Otros autores coreanos, encontraron una relación entre la actividad antiinflamatoria de extractos de hojas de la Dendropanax morbífera y la presencia de fenoles.21 Todo esto indica que el género al que pertenece la especie en estudio posee una gran variedad de metabolitos, que a su vez coinciden con varios de los encontrados en esta investigación.
Finalmente, teniendo en cuenta los resultados de la composición química cualitativa obtenida para cada método de extracción, en los tres extractos ensayados y la capacidad extractiva, en función del por ciento de sólidos totales, se puede inferir que el método de extracción con Soxhlet empleando como disolvente el agua, es la combinación que muestra una mayor capacidad extractiva, dado a la variedad de metabolitos identificados. Sin embargo, se sugiere que la elección del método de maceración, empleando el disolvente agua por varias razones:
Se obtienen los mismos metabolitos secundarios que por Soxhlet, como los flavonoides, alcaloides, triterpenos y esteroides, siendo los alcaloides, metabolitos de interés, por las propiedades farmacológicas atribuibles, y posibles responsables de la acción reportada por pobladores que la usan.
Resulta ser un método más fácil y económico.
Constituye uno de los métodos tradicionales más utilizados en la extracción de productos naturales.
Conclusiones
A parttir del análisis integral de los resultados se puede concluir que es en el extracto acuoso donde se obtiene mayor diversidad de metabolitos secundarios, lo que hace pensar que sería el disolvente ideal para la preparación de una futura forma farmacéutica. El método de mayor capacidad extractiva resultó ser el de extracción con Soxhlet y el agua el disolvente de elección. Sin embargo, por razones prácticas, energéticas y tradicionales, incluidas las reacciones indeseadas del método de extracción contínua, se sugiere el uso de la maceración. La composición química cualitativa de extractos obtenidos de la savia del tronco de la especie Dendropanax arboreus (L) Decne & Planch, por la técnica de tamizaje fitoquímico, denotó la presencia de alcaloides, flavonoides, triterpenos y esteroides, fenoles y taninos, saponinas, aminas y aminoácidos, resinas, azúcares reductores, aminoácidos libres y poliurónidos
