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Introducción
Uno de los grandes retos de la comunidad internacional en el siglo XXI, es convertir los procesos productivos en sostenibles, desempeñando la biotecnología un papel importante en esta transformación tecnológica, al dirigir sus investigaciones en el campo del aprovechamiento de los residuos, hacia la utilización de nuevas herramientas que prevengan, controlen y remedien la contaminación ambiental. 1,2
Grandes cantidades de materiales lignocelulósicos son generados en industrias de diversos tipos tales como las del papel, la forestal, cafetalera, azucarera, entre otras.(1) Los residuos lignocelulósicos de dichas industrias podrían transformarse en productos utilizables tales como proteína fúngica y forraje para el ganado, combustibles líquidos, ácidos orgánicos, glucosa y alcoholes, 3,4 sin embargo, la mayoría se convierten en fuente de problemas ambientales, pues son vertidos indiscriminadamente al medio sin tratamiento alguno, ocupando mucho espacio; su degradación natural es lenta y casi imposible en los volúmenes que se genera. 1
De acuerdo con (5 estos residuos aún no han sido aprovechados eficientemente por la falta de conocimiento sobre los métodos apropiados para la preparación y caracterización de sustancias de mayor valor agregado con la suficiente calidad e inocuidad.
Los hongos se encuentran entre los microorganismos responsables del reciclaje del carbono proveniente de la lignina, tanto por su capacidad hidrolítica como por su distribución, o potencialidad como degradadores de lignina, valorándose como organismos lignocelulolíticos por excelencia. (5,6
Entre ellos existen algunos con mayor capacidad degradativa de lignina, como los que producen la llamada “pudrición blanca” que presentan un sistema enzimático con un uso potencial en la transformación de compuestos contaminantes y xenobióticos,7 desempeñando un importante papel en el proceso de bioconversión,8 ya que son capaces de reducir grandes cantidades de residuos, minimizar la contaminación y formar productos de interés para la industria de los alimentos, papel, fármacos, la agricultura, entre otras.
El cultivo de setas comestibles es una industria Biotecnológica en continuo proceso de expansión y que va cobrando mayor importancia en el ámbito económico de muchos países. Entre los principales países productores de setas comestibles se encuentran China, Estados Unidos, Países Bajos, Francia, España, Polonia, Italia, Canadá, Irlanda y Reino Unido. 7
La definición de pudrición blanca se basa por el tipo de pudrición que causan en la madera, contiene cientos de especies de Basidiomicetos, capaces todas de degradar la lignina, celulosa y hemicelulosa de la madera, pero la velocidad y extensión de la degradación de cada componente de la pared celular varía considerablemente en función de la especie, condiciones de fermentación y tipo de material lignocelulósico. 9
En la actualidad distintos grupos de trabajo en el mundo, se dedican al estudio del aprovechamiento de residuos agroindustriales asociados a alimentos y relacionados con la transformación de los productos lignocelulósicos, los que proveen soporte y algunos nutrientes para el desarrollo de estos hongos que convierten la celulosa y lignina en abonos para la agricultura, alimento humano y alimento para rumiantes. 4,10
Con estos fines se ha cultivado e investigado el hongo Pleurotus spp., el cual es uno de los hongos de pudrición blanca más estudiado 11 y se cultiva como seta comestible. En nivel mundial está entre los cuatro más expandidos; por sus facilidades para crecer sobre una gran diversidad de residuos agroindustriales, por lo simple de su tecnología de cultivo y la calidad nutritiva y organoléptica de su cuerpo fructífero. (6
El Centro de Estudios de Biotecnología Industrial (CEBI), de la Universidad de Oriente, ha estudiado y profundizado en varios aspectos sobre la valorización de diferentes residuos agroindustriales secundarios en el cultivo de setas comestibles-medicinales Pleurotus spp. para la obtención de productos de valor añadido, así como aplicaciones del sustrato remanente, producto de la biodegradación como consecuencia del proceso fermentativo que ocurre para la producción de las setas comestibles. 12,13
El presente trabajo está dirigido a la evaluación de la biodegradación que produce el hongo Pleurotus spp sobre residuales lignocelulósicos secundarios ya que, mientras más conocimiento se tenga acerca del proceso de biodegradación, mayores aplicaciones se pueden alcanzar en la obtención de productos de alto valor agregado, para el desarrollo de procesos sostenibles, aportando de manera prominente, aplicaciones en la economía circular. 14,15
Materiales y métodos
Biodegradación por Pleurotus
Las fermentaciones en estado sólido han sido utilizadas ampliamente en el reciclaje de materiales voluminosos a través de tecnologías sencillas, con la que se logran incrementar los valores proteicos, mejorando el balance de aminoácidos y la digestibilidad de las materias primas empleadas 5,10 brindando la posibilidad de producir, por vía biotecnológica y de forma combinada, setas comestibles Pleurotus spp. y forraje beneficiado; siendo la única tecnología que permite obtener mediante la bioconversión de residuales lignocelulósicos agroindustriales, alimento humano y alimento animal. 16
La lignocelulosa es el componente principal de la biomasa vegetal y es el más abundante de los recursos renovables. Se compone de tres tipos de polímeros: celulosa (principal componente), hemicelulosa y lignina, que están fuertemente entrelazados y unidos químicamente por fuerzas no covalentes y reticulaciones covalentes, 17 formando un sello físico en la pared celular de las plantas que es una barrera impenetrable. La composición y las proporciones de estos tres compuestos varían entre cada planta. (18 La celulosa y la hemicelulosa son macromoléculas construidas a partir de diferentes azúcares.
Muchos microorganismos son capaces de degradar la celulosa y la hemicelulosa para utilizarlos como fuente de carbono y energía. Sin embargo, los hongos conocidos como los de pudrición blanca, entre los cuales se encuentran los del género Pleurotus, son los que poseen la capacidad única de degradar de manera eficiente la lignina a CO2 y agua, 18 descomponiendo este componente que es el más recalcitrante de la pared celular de varios residuales secundarios (tabla 1).
Tabla 1 Composición química (%) de algunos residuales secundarios empleados en la producción de setas comestibles y/o enzimas ligninolíticas, por FES. (8,13)
Durante el crecimiento y el desarrollo del micelio, los cambios bioquímicos tienen lugar como consecuencia de la producción de enzimas extracelulares. Estas enzimas degradan los componentes insolubles y gran cantidad de material lignocelulósico en compuestos solubles y de bajo peso molecular, que son tomados posteriormente por las enzimas intracelulares del hongo para su nutrición. Por lo tanto, las enzimas tienen un papel significativo en el crecimiento y desarrollo de hongos. 19
Los hongos Pleurotus tienen dos tipos de sistemas enzimáticos extracelulares: el sistema de hidrólisis, que produce hidrolasas que son responsables de la degradación de polisacáridos, y un sistema ligninolítico oxidativo único, que degrada lignina y abre los anillos de fenilo. (18 El sistema enzimático ligninolítico es poco específico, ya que las peroxidasas y oxidasas actúan al azar sobre la molécula de lignina, generando radicales libres que son inestables y tienden a polimerizarse.
Las principales enzimas que actúan directa o indirectamente sobre la lignina son: lignina peroxidasas (LiP), manganeso peroxidasas (MnP) y lacasas.20 Los hongos de pudrición blanca, secretan una o más de las tres enzimas extracelulares oxidativas esenciales en la mineralización de lignina: la LiP que, por síntesis endógena de H2O2, oxida el veratril alcohol y compuestos aromáticos no fenólicos, en una reacción que genera radicales arilo y alquilo que se anabolizan intracelularmente; la MnP, que oxida componentes fenólicos de la lignina, mediante la reacción deoxidación del Mn2+ a Mn3+, la cual es dependiente del H2O2; y la lacasa, una fenol oxidasa con cobre, que oxida anillos de la lignina. 17
Todas estas enzimas participan en la degradación bajo condiciones de fermentación en estado sólido, y se ha detectado que ayudan tanto a la infestación del micelio sobre el sustrato como a la degradación del mismo.21 Dentro de los residuales secundarios lignocelulósicos de origen agroindustrial susceptibles de ser utilizados como sustratos en la FES, empleando Pleurotus spp, se destacan: pulpa de café, la paja de caña, la paja de arroz, hojas de plátano, aserrín, paja de maíz, la cáscara de cacao, cáscara de coco y cáscara de maní y otras. 8
En la mayoría de los estudios al utilizar el Pleurotus, seta comestible-medicinal, el interés es obtener una alta producción de setas comestibles y hacia ello es que se dirigen las condiciones de los experimentos, pero también hay investigadores que utilizan los sustratos biodegradados con diferentes fines: biodegradación de compuestos recalcitrantes y xenobióticos,22 rompimiento de enlaces diversos, y por tanto, compuestos orgánicos, obtención de alimento animal, biorremediación de suelos, obtención de fertilizantes y otros, por ello es importante conocer el grado de biodegradación ocurrida.
Pleurotus tiene la capacidad de degradar la lignina en las paredes celulares y descomponer y mineralizar componentes celulares de las plantas, debido a que, durante la colonización del sustrato por el hongo, éste tiene la potencialidad de llevar los carbohidratos a azúcares más simples, por el proceso de metabolismo fúngico o primario.
Los azúcares son consumidos totalmente por el hongo y entonces llegan al metabolismo secundario, el cual consiste en la ruptura de los carbohidratos estructurales y la lignina por las enzimas extracelulares: lacasas, manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa. Empleando el Pleurotus puede evaluarse el efecto sobre la composición química de los diferentes residuos. 6
Criterios en la evaluación de la biodegradación
Los cuerpos fructíferos fueron obtenidos por FES, empleando como biorreactores bolsas de polietileno, utilizando como sustrato los residuos secundarios lignocelulósicos: pulpa de café, cáscara de cacao y cáscara de coco. Las respuestas a obtener fueron: eficiencia biológica, producción de residuo remanente post cosecha, bioconversión, cambios en la composición del sustrato inicial y post cosecha, así como la relación C/N.
Eficiencia Biológica
Se considera que la eficiencia biológica es directamente proporcional a la biodegradación del residuo, en la tabla 2, se presentan resultados para los residuos secundarios: pulpa de café, cascara de cacao, cascara de coco y cascara de maní.
Tabla 2 Valores de eficiencia biológica de la cepa CCEBI 3024 de Pleurotus cultivada sobre diferentes residuos secundarios puros y mezclados
*Con la cepa CCEBI 3023 **Con la cepa CCEBI 3021 *** Con la cepa CCEBI 3027
Los residuos tuvieron diferencias en su composición química, particularmente en la relación C/N y las cenizas. La pulpa de café mostró la menor relación C/N, 16 y el mayor contenido de cenizas, 12.82 %, mientras que, lo opuesto fue la viruta de cedro, con mayor relación C/N, 524 y menor contenido de cenizas, 1.23 %.
La pulpa de café fue el sustrato con el que se obtuvieron las mejores eficiencias biológicas de setas comestibles, incluso cuando se utilizó en mezclas (tabla 2). Estas mezclas optimizan la relación C/N, mejorando la estructura, la porosidad de los sustratos. 26
Resultados del cultivo con mezclas de diferentes residuos (aserrín + residuos de café + residuos de coco) 27 muestran que no influyen en las características morfológicas del Pleurotus ostreatus y además, los que se cultivan solo con el aserrín se contaminan menos. Resultado similar obtuvo 24 con mezclas de pulpa de café y virutas de cedro.
Bioconversión
La pérdida de la materia orgánica es el criterio más simple adoptado para evaluar la extensión de la biodegradación del sustrato, ya que concomitante con el crecimiento y fructificación de las setas sobre residuales lignocelulósicos, se presenta un decremento en el contenido de materia orgánica. 25 Esto es debido a las pérdidas de CO2 y H2O durante el metabolismo de los hongos y también a la remoción de materiales del sustrato por la formación de cuerpos fructíferos (tabla 3).
Los mayores niveles de bioconversión en setas se obtienen con pulpa de café, 31.3 % y con cáscara de cacao, 20.6 %, superiores a los valores publicados por otros autores (tabla 3), reflejan la eficiencia del proceso fermentativo, aunque se debe señalar que el resultado reportado por 25 se obtuvo en condiciones rurales y se realizó el cálculo teniendo en cuenta la cosecha, solamente hasta la segunda oleada de setas.
Composición al inicio y post cosecha de los residuos
La medida de la biodegradación deseada, puede valorarse con el empleo de diferentes parámetros, los más empleados son los que utilizan la determinación de la composición inicial y post cosecha de los sustratos, que permiten explicar y profundizar en las biotransformaciones ocurridas. Se realizaron las siguientes determinaciones: pH, materia orgánica, cafeína, polifenoles, cenizas, humedad, minerales, nitrógeno, fósforo, potasio, fibra bruta, carbohidratos y lignina. 28,29
Los métodos empleados son reportados en 23 y los residuales fueron la pulpa de café y la cascara de cacao. Los análisis se realizaron en los laboratorios del CEBI, de la Estación Territorial de Investigaciones de la Caña de Azúcar y en el Laboratorio Regional de Suelos.
Al realizar una comparación de la composición porcentual de los sustratos al inicio y post cosecha (tabla 4) se aprecia que existen variaciones en los parámetros evaluados luego de ser biodegradados por el hongo, encontrándose diferencias estadísticamente significativas en todos.
Tabla 4 Comparación entre la composición al inicio y post cosecha de los sustratos.
Letras iguales indican que no existen diferencias estadísticamente significativas.
Los valores de fibra bruta en pulpa de café disminuyen de 17.66 % hasta 13.82 % existiendo una diferencia estadísticamente significativa entre ambos sustratos, situación similar ocurre con la cáscara de cacao que los valores descienden 23 % a 19.22 % (tabla 4), evidenciando la actividad biodegradadora del hongo. Se considera que la fibra bruta es la materia recalcitrante más difícil de ser degradada y constituye una barrera de acceso del hongo al sustrato. 30
Las enzimas hidrofóbicas que son producidas por el micelio del hongo, catalizan la degradación de las moléculas en unidades más pequeñas, las cuales son utilizadas por el hongo como nutrientes, 31 por lo que se reportan muchos trabajos donde se evalúa la degradación en función de la disminución de la fibra bruta.
Al evaluar la variación de la concentración de lignina que ocurre en la pulpa de café inicial y post cosecha, se observan diferencias estadísticamente significativas, al encontrarse los niveles de concentración en la pulpa en 12.79 % y luego del proceso de fermentación alcanzan un valor de 9.79 %, complementándose con los resultados anteriormente evaluados los criterios sobre la capacidad del Pleurotus de degradar estos polímeros tan complejos; situación similar se reporta para la cáscara de cacao, inicial 10.80 % y el sustrato post cosecha 6.87 %.
Muchos autores dan seguimiento a la biodegradación de los sustratos lignocelulósicos por la variación en la concentración de los carbohidratos, durante el proceso de fermentación, el hongo consume primeramente los compuestos más simples 32 como las pectinas, hemicelulosa y los sacáridos simples en la fase de crecimiento micelial, mientras que, la lignina es degradada en la fase de fructificación. 8 Si comparamos los resultados de la concentración de carbohidratos (tabla 4), se observa una disminución de los contenidos de los mismos, en los dos residuos estudiados.
Por otra parte, dada la importancia que tiene el carbono para la célula, este elemento es el que más se utiliza durante el crecimiento y desarrollo de Pleurotus spp., y puede ser asimilado a partir de diferentes fuentes como polímeros, carbohidratos y lípidos, encontrándose dentro de los parámetros más empleados, la relación C/N.
La relación C/N para la pulpa de café es de 17.00 % y la cáscara de cacao de 53.10 %, mientras que, los sustratos post cosecha presentan valores de 13.67 y 19.57 %, respectivamente (tabla 4), este resultado se explica por el incremento relativo de la concentración de nitrógeno total, como consecuencia de la disminución del contenido de carbono en forma de desprendimiento de dióxido de carbono.
Esto último está asociado a la actividad microbiológica desarrollada en el interior del sustrato, y principalmente por el uso de fuentes de carbono presentes en el mismo para el desarrollo y producción del hongo, 33 encuentran relación entre la disminución de C/N y el aumento en la eficiencia biológica en cepas de P. ostreatus (CCMC H-041 e IE-8) y P. pulmonarius (IE-115) en mezclas con altos contenidos de madera de vid.
Estos autores también reportan una disminución en la relación C/N en los residuales post cosecha después de incubar por 25 días P. sajor-caju en paja de cebada (25.6 %), bagazo de caña de azúcar (61.9 %) y hojas de plátano (57.1 %), en estas variaciones pueden influir a la cepa empleada y el tipo de sustrato.
Simultáneamente al crecimiento y fructificación de las setas sobre residuales lignocelulósicos se presenta un decremento en el contenido de materia orgánica, evidenciado en la pulpa de café, de 82.52 hasta 78.15 % y en la cáscara de cacao, que disminuyó de 80.50 a 75.03 % (tabla 4).
La disminución de la concentración de los fenoles totales y la cafeína de la pulpa de café (0,04 para la cafeína y 0,09 para los fenoles) está asociada con la producción de la enzima lacasa, la cual puede ser responsable de esta transformación, 22 junto a otras enzimas, que se expresan en menor actividad; se conoce que la pulpa de café está compuesta, entre otros, por lignina y compuestos aromáticos con estructura química semejante a esta, los cuales son inductores de enzimas lacasas. Resultados similares se obtuvieron para la cáscara de cacao post cosecha con una disminución en su concentración.
Investigaciones realizadas con el empleo de columnas de Rimbault conteniendo pulpa de café, 13) por FES con dos cepas de Pleurotus, muestran que existe una disminución del contenido de fenoles totales del sustrato por las dos cepas estudiadas, siendo evidente desde las primeras 24 horas la disminución de la concentración de estos compuestos tóxicos y luego durante el resto de los días de fermentación a un nivel casi constante de la concentración. La cepa CCEBI 3023 presentó mayores niveles de biotransformación (53,07 % de fenoles totales trasformados a las 24 horas) que la cepa CCEBI 3024 (45,51 %, a las 48 horas). La disminución máxima de concentración de cafeína se observó al séptimo (último) día estudiado, los valores de remoción de cafeína, independientemente de la escala de fermentación, oscilaron entre 15-24 %. 13
En cuanto a la composición de macro y micro elementos (datos no presentados), ocurre una disminución en la concentración de sodio, hierro, fosforo y potasio, reportándose diferencias estadísticamente significativas para estos elementos evaluados en sustrato post cosecha con respecto al sustrato inicial.
Conclusiones
Se evidencia la importancia que tiene la composición química y las características físicas de los residuales, para el desarrollo y crecimiento de Pleurotus spp. y por tanto para la biodegradación de los mismos.
Pleurotus el más importante protagonista en la biodegradación de los residuales lignocelulósicos, por producir enzimas hidrolíticas, responsables de la degradación de los polisacáridos y enzimas oxidativas (ligninasas), responsables de la modificación y la degradación de la lignina.
El cultivo de setas puede ser considerado como un proceso biotecnológico prominente para la reducción y valorización de residuos. Estos residuos son generados como resultado de la conversión amigable de subproductos de bajo valor en nuevos recursos, los cuales pueden usarse para producir productos de valor añadido y por tanto, aportar a la economía circular.
