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INTRODUCCIÓN
Los estudios histopatológicos realizados en cerdos seropositivos a Leptospira por MAT (Prueba de Microaglutinación) y corroborados por otros métodos de diagnóstico como el aislamiento microbiológico e Inmunofluorescencia, Inmunohistoquímica indirecta y PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) convencional, muestran resultados imprecisos y contradictorios (Boqvist et al. 2003; Radaelli et al. 2009).
En investigaciones realizadas en cerdos destinados al sacrificio, la nefritis intersticial, no siempre se corresponde con la presencia de Leptospira spp. (Boqvist et al. 2003, Martínez et al. 2007) y la nefritis intersticial multifocal en cerdos se ha asociado con varios agentes infecciosos (Martínez et al. 2007), las pautas patomorfológicas de esta lesión no muestran uniformidad en los estudios realizados en diferentes países, debido a que se han documentado varios patrones histológicos de nefritis intersticial en la leptospirosis porcina (Pezzolato et al. 2012).
El objetivo de este estudio fue identificar los patrones histopatológicos en el riñón y su asociación con la seroprevalencia a Leptospira spp. en cerdos aparentemente sanos destinados a sacrificio en el matadero municipal del cantón Portoviejo.
MATERIALES Y MÉTODOS
Localización y duración: La investigación se efectuó en el cantón Portoviejo, ubicado a 80°29,296´O de longitud oeste; 0°53,864´S latitud sur; a 18 m sobre el nivel del mar, capital de la provincia de Manabí, Ecuador, esta se desarrolló durante el periodo comprendido de diciembre de 2018 a marzo de 2019 (periodo lluvioso) y de mayo - agosto de 2019 (periodo poco lluvioso).
Animales: Se emplearon cerdos; provenientes de traspatios, sacrificados en el Matadero municipal del cantón Portoviejo, pertenecientes a la provincia de Manabí y a dos provincias cercanas (Santa Elena y Santo Domingo de los Tsáchilas).
El sacrificio de los cerdos se efectuó según las normas contempladas por la Ley de Sanidad Animal de AGROCALIDAD (Agencia Ecuatoriana para la Calidad del Agro) y el Código sanitario para los animales terrestres, Capítulo 7: Ley de Bienestar Animal de la Oficina Internacional de Epizootias. Se escogieron animales al azar (muestreo aleatorio simple), asintomáticos y con características fenotípicas tanto del cerdo criollo ecuatoriano como de razas especializadas representativas de la crianza de traspatio y tecnificada respectivamente.
Muestreo: Se realizó un muestreo al azar (aleatorio simple) de sangre y riñones; la población total de los animales destinados al sacrificio se estimó con 1 200 cerdos que fueron faenados como promedio mensual y que, por un período de seis meses del muestreo, representaban 7 200 cerdos a sacrificar. El tamaño de la muestra se determinó aplicando la fórmula para poblaciones finitas de acuerdo con la prevalencia esperada (Thrusfield, 2018) y aunque el resultado obtenido de la n calculada fue de 173, se tomaron 200 muestras.
Recolección de las muestras de sangre para MAT: Se tomaron 200 muestras de sangre que se colectaron al momento del sacrificio, mediante el corte de los vasos de la región del cuello, en tubos de plástico estériles de 10 cm de largo x 1,4 cm de diámetro, sin anticoagulante, marca ITC. Las muestras obtenidas se mantuvieron a una temperatura de 20 o C, tras la formación del coagulo de fibrina se procedió a la extracción del suero sanguíneo por centrifugación de la sangre a 453 fuerza centrífuga durante 10 minutos, en una centrifuga marca MedicLife, modelo 800 B, China. El suero se distribuyó en alícuotas de 2 mL y se conservó a -20 o C hasta el momento de procesarse.
Recolección de las muestras de riñón para histopatología: Luego del faenamiento de los cerdos, se procedió a la revisión de los riñones para tomar las muestras histopatológicas, una por cada animal (420 muestras del total de animales de este estudio); en estos mismos animales previamente se colectaron 200 muestras de sangre para estudio serológico. Las muestras renales fueron obtenidas mediante cortes de 1cm2 y de 0,5 cm de profundidad, con hoja de bisturí número 23, cumpliendo las normas de asepsia requeridas (guantes y bisturí estériles utilizando uno por cada animal). En lo referente a la muestra para histopatología, estas se conservaron en formol al 10 %, (Abreu et al., 2017) en tubos plásticos estériles de fondo plano con tapas enroscadas con capacidad para 20 mL en una proporción de 1:3 (muestra / formol) y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta su procesamiento.
Metodología empleada para el diagnóstico serológico: El diagnóstico serológico se realizó en el laboratorio de AGROCALIDAD de Tumbaco, mediante la prueba de aglutinación microscópica (MAT), considerada la prueba de referencia para el diagnóstico serológico de leptospirosis y recomendada por la OIE (2014b). Para la pesquisa en los cerdos destinados al sacrificio, se utilizó un panel de ocho serovariedades de Leptospira con antígenos representativos de los serogrupos conocidos que existen en la región, según lo recomienda la OIE (2018) y que estaban establecidos para Ecuador, por AGROCALIDAD: L. borgpetersenii Tarassovi, L. interrogans Canicola, L. interrogans Icterohaemorrhagiae, L. interrogans Australis, L. interrogans Bratislava, L. interrogans Pomona, L. interrogans Pyrogenes, L. interrogans Grippotyphosa. El panel de serovares estaba constituido por cepas certificadas por el Servicio Nacional de Laboratorios Veterinarios del Departamento de Agricultura de Estados Unidos y que procedían del Laboratorio de Referencia de la OIE, ubicado en Argentina. Las cepas microbianas fueron resembradas cada semana en los medios de cultivos y condiciones recomendadas por la OMS (2008) a fin de obtener un cultivo de cuatro a siete días.
Se consideraron positivos los títulos serológicos en la dilución más alta donde se observó el 50% de leptospiras aglutinadas vs el 50 % de leptospiras libres, comparado el campo en estudio con el control de cepa (100 % de leptospiras libres). La dilución inicial fue de 1: 50 y a partir de esta se obtuvieron diluciones seriadas (logaritmo base 2), de 1: 100, 1: 200, 1: 400, 1: 800, 1: 1600, 1: 3200, 1: 6400. Títulos iguales o mayores a 100 hacia una o más serovariedades de Leptospira se consideraron positivos según recomendaciones de la (OIE, 2014b). Se consideró reacción cruzada cuando una misma muestra presentó aglutinaciones con dos o más serovariedades por el mismo título, los que se reportaron cuando eran títulos ≥ 100.
Metodología empleada para el diagnóstico histopatológico: Las muestras de riñón obtenidas según procedimiento descrito, procedentes de 420 cerdos faenados, se conservaron (fijaron) en envases individuales (tubos con tapa enroscada de 10 mL con formol al 10 %) y se mantuvieron a una temperatura ambiente (28 ° C) hasta procesarse. Luego se deshidrataron y se incluyeron en bloques de parafina, que se cortaron con micrótomo a 5 μm y las secciones de tejido se tiñeron con hematoxilina y eosina. Las placas obtenidas se observaron en microscopio Olympus CX30 con objetivo de 40x.
Procesamiento estadístico: Se creó una base de datos empleando el tabulador Microsoft Excel y los resultados obtenidos se procesaron mediante el paquete estadístico STATGRAPHICS CENTURION ver. XV. II. Se emplearon estadígrafos descriptivos como frecuencia absoluta y relativa en la seroprevalencia de anticuerpos contra Leptospira spp. y las lesiones histopatológicas en riñones. Se aplicaron pruebas de comparación de proporciones binomial y múltiples para las lesiones presentes en cerdos positivos y no a Leptospira, según MAT y para comparar las proporciones de seropositividad de cada serovar con la proporción media respectivamente. Además, se utilizó la prueba de Chi-cuadrado para evaluar la asociación entre lesiones renales y la positividad a la Leptospira.
Para determinar la asociación entre la nefritis intersticial y la seroprevalencia a Leptospira, se realizó un análisis de riesgo en el cual se aplicó un estudio analítico observacional de tipo transversal mediante la conformación de tablas de contingencia 2 x 2 con el programa para análisis epidemiológico de datos tabulados EPIDAT versión 3.1.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Seroprevalencia de anticuerpos contra Leptospira spp. en cerdos destinados al sacrificio.
De los cerdos sacrificados, a los que se le realizó el diagnóstico serológico de leptospirosis, 33 / 200 (16,5 %) IC: 95 % ENT#091;11,35 - 21,64ENT#093; resultaron seropositivos y se detectó seropositividad para los ocho serovares analizados lo que demuestra una seroprevalencia intermedia en estos animales.
En la Fig. 1, se observa que el serovar identificado con mayor frecuencia fue Canicola 6,5 % (13 / 200) y Pyrogenes 6 % (12 / 200) pero no hubo diferencias significativas entre cada serovar y la proporción media (3,81 %).
Fig. 1: Serovares de Leptospira presentes en los sueros de los cerdos de matadero del cantón Portoviejo, período 2018-2019
Se evidencia la presencia de los serovares Australis, Bratislava, Icterohaemorrhagiae y Canicola circulantes en cerdos de matadero del cantón Portoviejo, factores que pueden ser un peligro potencial latente para los humanos susceptibles. La inclusión de serovares como Hardjo, Bratislava, Sejroe y Grippotyphosa para las pesquisas serológicas en porcino, contribuiría a una mejor comprensión del rol de esta especie como reservorio de Leptospira en el territorio donde se estudien (Rodríguez et al. 2017).
Pedersen et al. (2017), en un estudio realizado en cerdos de matadero encontraron anticuerpos contra varios patógenos zoonóticos probados, no hallaron diferencias significativas en lo que respecta a la prevalencia de ningún patógeno entre la edad, el sexo o la instalación; los serovares Bratislava y Pomona fueron los más detectados, así como, los serotipos con los títulos más altos, indicativos de infección activa. Resultados que difieren con los de este estudio, pues el mayor porcentaje de seropositivos fue frente a los serovares Canicola y Pyrogenes.
Hallazgos histopatológicos en riñones de cerdos destinados al sacrificio
Los principales cambios histopatológicos hallados en riñones de los cerdos aparentemente sanos destinados al sacrificio (Fig. 2), estuvieron relacionados con trastornos circulatorios, degenerativos, procesos inflamatorios y otros. El grado severo de nefritis estuvo ausente en todos los casos. Por lo general la inflamación no afectó a todo el riñón, sino principalmente a los glomérulos, los túbulos y los tejidos que lo circundan (tejido tubulointersticial).
Fig. 2. Lesiones renales de cerdos positivos a Leptospira spp. por MAT, corte histológico. (A) Nefritis intersticial con infiltrado inflamatorio rico en linfocitos y macrófagos restringido a zonas perivasculares. (B-C) Nefritis túbulointersticial, presencia de células linforeticulares extendiéndose a otras zonas del parénquima cortical. H-E 40x
La seroprevalencia detectada en los cerdos destinados al sacrificio del cantón Portoviejo, avala el alto porcentaje de lesiones por Leptospira spp. encontrada en los riñones de estos animales, evidencias que constituyen una alerta significativa de riesgo para los trabajadores que manipulan y trabajan con cerdos sacrificados en esta localidad. Los resultados obtenidos; concuerdan con los criterios de otros autores, que señalan a los cerdos como un riesgo potencial de infección para los humanos y otros animales domésticos; especialmente aquellos que viven cerca de granjas porcinas (Benacer, Thong y Sourist, 2017).
La enfermedad afecta a diferentes grupos de riesgo como pescadores, trabajadores de minas y drenajes, recolectores de basura, personal que labora en cultivos de arroz, trabajadores de mataderos (Tocora et al, 2018) y otros grupos en riesgo; los cuales realizan actividades en entornos altamente húmedos que favorecen la transmisión de patógenos (Meny et al., 2019).
Las lesiones histopatológicas halladas en cortes de riñón positivos a Leptospira por MAT están en correspondencia con los criterios de Yang (2017) quien señala que la infección renal crónica por Leptospira puede presentarse con nefritis tubulointersticial crónica característica y fibrosis intersticial. En los cerdos positivos a MAT, se observaron lesiones dominantes como la nefritis intersticial multifocal, la glomerulitis, y la nefritis intersticial focal (Fig. 3).
La observación de los cortes histológicos demostró que las 420 (100 %) muestras observadas presentaron al menos una lesión renal detectable por microscopía óptica, aunque no todas se relacionan con Leptospira (glomerulitis, lipidosis, hiperemia, nefroesclerosis, la atrofia tubular y la nefrosis quística) y pueden obedecer a otros procesos.
Las lesiones pudieron identificarse como diez cambios histopatológicos diferentes: la glomerulitis, la nefritis intersticial, la nefrosis, la nefritis tubular, glomerulonefritis y en menor cuantía, la lipidosis, la hiperemia, la nefroesclerosis, la atrofia tubular y la nefrosis quística (Tabla 2).
Tabla 2. Frecuencias observadas de las lesiones histopatológicas en riñones.
| Tipo de trastorno | N° | % | IC: 95 % |
|---|---|---|---|
| Trastornos circulatorios | |||
| Hiperemia | 3 | 0,71 | -0,09 - 1,51 |
| Trastornos degenerativos | |||
| Atrofia tubular | 10 | 2,38 | 0,92 - 3,84 |
| Nefrosis | 18 | 4,29 | 2,35 - 6,23 |
| Nefroesclerosis | 5 | 1,19 | 0,15 - 2,23 |
| Inflamación | |||
| Glomerulitis | 105 | 25,00 | 20,86 - 29,14 |
| Nefritis intersticial | 145 | 34,52 | 29,97 - 39,07 |
| Nefritis tubular | 80 | 19,05 | 15,29 - 22,81 |
| Nefritis quística | 1 | 0,24 | -0,23 - 0,71 |
| Glomerulonefritis | 46 | 10,95 | 7,96 - 13,94 |
| Otros hallazgos | |||
| Lipidosis | 7 | 1,67 | 0,44 - 2,90 |
| Total | 420 | 100 | |
El porcentaje de cada lesión va en aumento y sigue en el siguiente orden: la glomerulonefritis, la nefritis tubular, la glomerulitis, la nefritis intersticial, esto sugiere un progreso del proceso infeccioso que transita por la fase incipiente, la activa, y la crónica; con excepción de la glomerulitis que indica un menor daño al tejido. La nefritis intersticial reveló un patrón lesional linfohistiocítico caracterizado por nefritis tubulointersticial, presencia de infiltrado inflamatorio y degeneración del tejido tubular en las muestras positivas a leptospirosis por MAT.
Estos resultados concuerdan con los de Pan y Yang (2019), quienes encontraron que las endotoxinas Leptospirales desencadenan respuestas inmunológicas del hospedero y conducen a la nefritis tubulointersticial, que es el hallazgo histológico más común en animales con leptospirosis. Si la infección Leptospiral crónica persiste y causa nefritis tubulointersticial persistente, eventualmente se desarrollará fibrosis tubulointersticial en animales con leptospirosis crónica.
Seroprevalencia de Leptospira spp. y su asociación con lesiones en riñones de cerdos destinados al sacrificio
De un total de 33 cerdos seropositivos (títulos de 100) por MAT; 16 (48,48 %) manifestaron nefritis intersticial y se halló asociación estadística y significativa entre esta lesión y la seropositividad a Leptospira. El resto de las lesiones inflamatorias encontradas no mostraron asociación con la seropositividad a Leptospira (Tabla 3).
Tabla 3 Asociación entre lesiones renales y positividad a leptospiras, en cerdos de matadero del cantón Portoviejo, período 2018-2019.
| Lesiones anatomopatológicas | Leptospirosis | χ² | p-value | ||
| % Positivos | % Negativos | ||||
| Glomerulitis | 30, 30 (10 / 33) | 38, 92 (65 / 167) | 0,87 | 0,35 | |
| Nefritis intersticial | 48, 48 (16 / 33) | 20, 95 (35 / 167) | 10,99 | 0,00 | |
| Nefrosis | 6, 06 (2 / 33) | 5, 98 (10 / 167) | 0,00 | 0,98 | |
| Nefritis Tubular | 42, 42 (14 / 33) | 43, 11 (72 / 167) | 0,00 | 0,94 | |
| Glomerulonefritis | 18, 18 (6 / 33) | 22, 15 (37 / 167) | 0,25 | 0,61 | |
P ≤ 0,01 indican diferencias significativas mediante Prueba χ².
La nefritis intersticial es una causa frecuente de decomisos en cerdos de matadero (Lazo et al., 2017; Hurtado et al., 2018; Hurtado et al., 2019) y varios investigadores la asocian con la infección por Leptospira y otros agentes bacterianos y virales (Boqvist et al., 2003; Martínez et al., 2007; Radaelli et al., 2009; Pezzolato et al., 2012; Strutzberg et al., 2018; Yang, Pan y Yang, 2019; Carrillo et al., 2019). Sin embargo, en cerdos los resultados son ambiguos, debido a que la nefritis intersticial multifocal no siempre se ha corroborado con la presencia de Leptospira spp., los patrones inflamatorios hallados son múltiples y en cerdos portadores asintomáticos son escasos los estudios que demuestran la interrelación entre la identificación de Leptospira spp. por métodos serológicos (MAT) con los patrones histopatológicos de las lesiones renales producto de la infección.
Otro análisis que evidencia claramente la asociación entre la nefritis intersticial y la seropositividad a Leptospira es un análisis de riesgo (Fig. 4). Se demuestra que de los 51 cerdos cuyos riñones presentaban nefritis intersticial, 16 (31,37 %) resultaron positivos a leptospirosis por MAT versus 17 de 149 (solo 11,40 % de positivos por MAT) en los cerdos cuyos riñones no presentaron esta lesión. Los cerdos que manifestaron nefritis intersticial tuvieron 3,5 veces más probabilidad de resultar positivos por MAT que los que no mostraban esta lesión. Por lo que es evidente la asociación entre la nefritis intersticial y la positividad por MAT (OR ═ 3,54). Esta asociación es significativa IC: 95 % (1,63 - 7,72) y estadística p ≤ 0,001.
Fig. 4: Análisis de riesgo y asociación entre la nefritis intersticial y la seropositividad a Leptospira por MAT
Estos resultados demuestran que los cerdos aparentemente sanos que arriban al matadero y, que como resultado de la inspección posmortem; manifiestan nefritis intersticial, tienen mayor probabilidad de haber estado infectados por Leptospira. Por ende, el registro ordenado y sistemático de los decomisos, puede contribuir a los sistemas de alerta temprana y vigilancia epidemiológica, que, con una adecuada trazabilidad y retroalimentación con las unidades de procedencia, se puede contribuir a la prevención y control de la leptospirosis porcina en el territorio.
Por otra parte, la corroboración del diagnóstico microbiológico de la leptospirosis por aislamiento de la bacteria resulta difícil y trabajoso. El diagnóstico serológico por MAT requiere del mantenimiento de cepas vivas no contaminadas, y es también laborioso. En los laboratorios de diagnóstico veterinario, el hallazgo de nefritis intersticial en el examen anatomopatológico macro y micro, con el conjunto de los datos de la anamnesis, la exploración clínica, el diagnóstico epidemiológico y otros exámenes complementarios se puede corroborar un diagnóstico presuntivo de leptospirosis, además de alertar tempranamente y facilitar las medidas preventivas y de control en las granjas afectadas.
Estos resultados concuerdan con Baker et al. (1989), quienes llevaron a cabo una encuesta en el matadero para determinar la prevalencia de la leptospirosis y su asociación con lesiones de nefritis intersticial multifocal en los cerdos en el momento del sacrificio y hallaron una asociación significativa (p = 0,046) y fuerte (OR = 8,10) entre la nefritis intersticial multifocal (MFIN, por sus siglas en inglés) y la presencia de leptospiras renales detectadas por cultivo, además la asociación entre el título de leptospiras y las lesiones de MFIN en el grupo de animales de la encuesta de prevalencia fue también estadísticamente significativa (p = 0,031) y difieren de los obtenidos por Boqvist et al. (2003) que estudiaron 32 cerdos de engorde en un matadero en el sur de Vietnam y no hallaron asociación entre la presencia de leptospiras y nefritis (p = 0,19).
La Fig. 5 muestra las lesiones morfopatológicas presentes en cerdos positivos y negativos a Leptospira con la prueba diagnóstica empleada. Las lesiones predominantes en cerdos positivos por MAT correspondieron con la glomerulonefritis, nefritis tubular y nefritis intersticial lo que representa el 55,10 % (27 / 49) versus el comportamiento observado en los cerdos negativos por MAT, donde la lesión significativa fue la glomerulitis lo que representó el 31,91 % (15 / 47). Resultado que difiere significativamente para p ≤ 0,05.
En este estudio la identificación de las pautas morfopatológicas predominantes según los resultados de la MAT y la histopatología, permitió dilucidar que la glomerulonefritis y la nefritis tubulointersticial, se asocian a la seropositividad por Leptospira, además se ha encontrado que la glomerulitis puede estar relacionada con otras posibles infecciones o procesos patológicos no infecciosos.
En los casos de infecciones incipientes y con ausencia de anticuerpos contra Leptospira superiores a un título de 100, el patrón lesional sobresaliente fue la glomerulonefritis, y hubo un 68,18 % (15 / 22) que mostraron títulos de 50 (serorreaccionantes) que también manifestaban esta lesión. En esta fase de la infección por Leptospira se desarrolla una respuesta patológica poco marcada a nivel renal, solo existe la glomerulonefritis sin presencia significativa de otras lesiones. Esto se sustenta en que la ausencia de cualquier cambio microscópico ante una colonización renal por Leptospira es probable que suceda cuando la llegada de la bacteria al epitelio renal sea tan temprana que aún no se provoque una adecuada estimulación de la respuesta inmune celular local (Monahan, Callanan y Nally, 2009).
En los casos activos con presencia de anticuerpos contra Leptospira superiores a un título de 100, el patrón lesional se caracterizó por nefritis tubular. El 50 % (4 / 8) manifestaron sendos títulos de 100 y 200 respectivamente a los serovares Canicola, Pomona, Icteroahemorrhagiae y Grypothyposa, en este orden.
En los casos crónicos con presencia de anticuerpos contra Leptospira superiores a un título de 100, el patrón lesional se caracterizó por nefritis intersticial. El 57,89 % (11 / 19) mostraron títulos de 100, el 36,84 % (7 / 19) revelaron títulos de 200 y un 5,26 % (1 / 19) manifestó un título de 600; a los serovares Australis, Pomona, Canicola, Tarasovi, Pyrogenes e Icteroahemorrhagiae, en este orden. Esta lesión es un hallazgo tardío de infección por leptospiras en animales portadores crónicos.
En los cerdos seronegativos o enfermos por causas ajenas a la leptospirosis, como otras infecciones asintomáticas o procesos no infecciosos, el patrón lesional se caracterizó por glomerulitis; proceso que puede ser el inicio de otras alteraciones renales de mayor intensidad. Estas aseveraciones están en correspondencia con las de Martínez et al. (2007); quienes indican que, además de Leptospira spp., existen otros agentes etiológicos que pueden ocasionar nefritis intersticial, como el virus del Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRSV), el Circovirus Porcino (PCV2) y el Parvovirus Porcino (PPV) y otras bacterias como Streptococcus suis, Staphylococcus aureus y Eschericha coli que intervienen en las nefritis intersticiales purulentas.
En este estudio fue posible corroborar los hallazgos anatomopatológicos con el diagnóstico serológico, y en lo que respecta a tinciones argénticas (Warthin-Starry) es necesario mencionar que a pesar de que la tinción con plata es útil, hay poca información disponible sobre la sensibilidad y especificidad de la técnica (Azizi, Kheirandish y Rahimi, 2014) además la visualización de las leptospiras suele verse dificultada por la importante coloración del fondo y los artefactos, lo cual puede dar lugar a falsos positivos (Brihuega, 2010).
CONCLUSIONES
La glomerulonefritis, la nefritis tubular, la nefritis intersticial y la glomerulitis, aparecen en los riñones de cerdos asintomáticos seropositivos o no aLeptospiraspp., lo que muestra la fisiopatología y el amplio patrón de lesiones por la infección en estos animales.
Los cerdos que manifestaron nefritis intersticial tuvieron 3,5 veces más probabilidad de resultar positivos por MAT que los que no mostraban esta lesión
