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INTRODUCCIÓN
La mastitis es una inflamación de la glándula mamaria que causa pérdidas económicas significativas en los rebaños bovinos (Ramírez et al., 2018). Se clasifica de acuerdo a su curso en clínica y subclínica. En la forma clínica se observan los signos de la enfermedad y cambios en la composición química de la leche. La forma subclínica es más común que la clínica, pero en este caso no se aprecian síntomas en los animales ni cambios en la apariencia de este producto (Benić et al., 2018).
Esta enfermedad se considera un problema importante de salud pública que provoca disminución de la cantidad y calidad de la leche producida (Andrade et al., 2017; Quevedo, 2018). Puede modificar su composición proteica y lipídica (Valdivia et al., 2020), favorecer la excreción de microorganismos a la leche y afectar la inocuidad de este alimento (Romero et al., 2018).
La mastitis bovina frecuentemente tiene un origen infeccioso y puede ser causada por cerca de 150 especies microbianas (Benić et al., 2018). Su prevención debe contemplar la higiene del ambiente donde se desarrollan los animales y del ordeño. La correcta desinfección del pezón post-ordeño o sellado, es una de las medidas más importantes para evitar su presentación. Consiste en la aplicación de una solución antiséptica a los pezones, después de retiradas las pezoneras. Esta práctica tiene el propósito de reducir la penetración y la multiplicación de patógenos infecciosos y ambientales que quedan en la piel y la punta del pezón al finalizar el ordeño, para evitar su entrada y multiplicación en el canal del pezón (Blanco y Montero, 2018). Con este objetivo, en la Empresa Pecuaria Genética de Matanzas (EPGM) se emplea la solución acuosa de tintura de Propolina®, elaborada a base de propóleos.
El propóleo es uno de los productos de la colmena que genera gran interés en la comunidad científica. Posee una compleja composición y un amplio espectro de actividades. Su acción antimicrobiana está descrita frente a cepas bacterianas Gram positivas y Gram negativas (Przybyłek et al., 2019). Sin embargo, su efectividad depende de la especie microbiana en cuestión, que a su vez puede variar en el tiempo por diversos factores ambientales, así como por la concentración del producto. Los resultados indican que la Propolina® constituye una alternativa recomendable para la prevención de la mastitis. El empleo de soluciones de propóleo para combatir microorganismos permite contar con productos naturales e inocuos para el enfrentamiento a microorganismos resistentes a los antibióticos (Fernández-León et al., 2022). A partir de estos resultados, esta investigación tuvo como objetivo determinar la actividad antimicrobiana de diferentes concentraciones de Propolina® frente a microorganismos causantes de mastitis subclínica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Toma de muestras de leche
El muestreo se realizó en una vaquería perteneciente a la EPGM, en el mes de mayo de 2019. En la unidad, el ordeño se realiza dos veces al día (4:00 am y 4:00 pm) con el empleo de un equipo mecanizado marca Eurolate. Las vacas corresponden a la raza Mambí y se alimentaban con pasto estrella [Cynodon nlemfuensis (Van-deryst)], forraje King grass CT-115 (Cenchrus purpureus Schumach Morrone), caña molida (Saccharum officinarum), pienso de vaca lechera y sales minerales ad libitum.
Se tomaron diez muestras de leche de vacas que no presentaban signos clínicos de mastitis ni alteraciones en la leche. Las muestras se obtuvieron por ordeño manual de cuartos que previamente se diagnosticaron como positivos a tres cruces de mastitis subclínica, mediante la prueba de California Mastitis Test (CMT). Para ello, las ubres se lavaron con agua corriente y posteriormente se desinfectaron con un algodón estéril humedecido en etanol al 70%. Se colectaron aproximadamente 5 ml de leche que se extrajeron después de realizar el despunte. Las muestras se conservaron en hielo y se trasladaron al Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Agronomía de la Universidad de Matanzas para su procesamiento.
Aislamiento de bacterias causantes de mastitis
Se sembraron 100 µl de cada muestra de leche en placas que contenían medio agar nutriente mediante diseminación con espátula de Drigalsky. Las placas se incubaron durante 24 h a 37 °C en condiciones de aerobiosis. Posteriormente, se seleccionaron las colonias que mostraron características culturales diferentes, las que se purificaron mediante siembra por estrías en placas con agar nutriente con el empleo de un asa de siembra de platino. Para la conservación de las cepas aisladas se utilizaron dos métodos: en cuñas de agar nutriente a 4 °C y en glicerol a -20 °C.
Pruebas bioquímicas e identificación de bacterias causantes de mastitis
Las cepas conservadas se inocularon en tubos que contenían 3 ml de caldo nutriente y se incubaron a 37 °C por 24 horas. Luego se sembraron en tubos con cuñas de agar nutriente y se colocaron en las condiciones descritas anteriormente. Las pruebas bioquímicas catalasa, manitol salado, hidrólisis del almidón y coagulasa se realizaron según el procedimiento descrito por MacFaddin (2006).
Se realizó la tinción de Gram a partir de los cultivos jóvenes de las cepas que se sembraron en agar nutriente por el método de Madigan et al. (2015). Se determinó la presencia de endospora por el mismo procedimiento.
Evaluación in vitro de la actividad antimicrobiana de diferentes concentraciones de Propolina ®
Para los estudios de actividad antimicrobiana se utilizó la Propolina® procedente de la Empresa Productora y Comercializadora de Productos Biofarmaceúticos de Matanzas GENIX®, LABIOFAM que contenía 60 mg·ml-1 de sustancias bioactivas. Se prepararon diluciones acuosas de este producto con las concentraciones siguientes: 2,5; 5,0; 7,5; 20,0 y 30,0 mg·ml-1.
La evaluación de la actividad antimicrobiana de las cinco diluciones preparadas y la Propolina® en su forma de presentación (60,0 mg·ml-1) se efectuó en placas mediante el método de difusión en agar por pocillos (Pérez et al., 2020). Se utilizó como control una solución hidroalcohólica al 10%. La evaluación se realizó frente a los microorganismos aislados de las muestras de leche procedentes de vacas diagnosticadas con mastitis subclínica y a una cepa Gram negativa de Escherichia coli ATCC 25922. Esta última cepa se incluye en el estudio para comprobar la efectividad del producto ante microorganismos que muestran este patrón frente a la tinción de Gram.
Los microorganismos que se emplearon en este ensayo crecieron a 37°C durante 24h en medio agar Müeller-Hinton. Posteriormente, se tomaron colonias aisladas que se inocularon en tubos que contenían 9 ml de caldo Müeller-Hinton y se dejaron crecer hasta que alcanzaron una concentración equivalente al tubo 0,5 de la escala de Mc Farland. Luego se sembraron por diseminación en placas que contenían agar Müeller-Hinton con el empleo de un hisopo estéril. Los pocillos se realizaron con un horadador estéril y se le añadieron 200 µl de cada solución a evaluar. Las placas se colocaron a 4 °C durante 15 minutos y después se incubaron a 37 °C durante 18h (Pérez, 1990). Se realizaron tres réplicas por cada cepa.
La inhibición del crecimiento se calculó mediante la fórmula: I = DZI - DP
Dónde: DZI es el diámetro de la zona de inhibición y DP el diámetro del pocillo, ambas mediciones se realizaron con un pie de rey.
Para realizar la evaluación cualitativa de la inhibición se empleó la escala de Duraffourd (Duraffourd et al., 1987) que establece los criterios siguientes:
Nula (-) cuando el diámetro del halo de inhibición es inferior a 8 mm.
Sensibilidad límite (sensible = +) cuando el halo de inhibición comprende entre 8 y 14 mm.
Medio (muy sensible = ++): para un diámetro entre 14-20 mm.
Sumamente sensible (+++) para un diámetro superior a 20mm.
Análisis estadístico
Los datos se procesaron con el programa estadístico Statgraphics Plus 5.0 sobre Windows. Se analizó primeramente el ajuste de los datos a una distribución normal y la homogeneidad de varianza mediante la prueba de bondad de ajuste (Chi cuadrado) y la prueba de Bartlett, respectivamente. Se realizó un Análisis de Varianza de clasificación simple y la Prueba de Rangos Múltiples de Duncan (P˂0,05) para la comparación entre las medias.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Aislamiento de bacterias causantes de mastitis
Se aislaron 15 cepas bacterianas Gram positivas de las muestras de leche tomadas de vacas previamente diagnosticadas con tres cruces de mastitis subclínica. Se seleccionaron tres de ellas, de acuerdo a las características morfológicas de sus colonias y a la respuesta a la tinción de Gram para su identificación. Como resultado se aislaron los microorganismos: Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. Coagulasa negativo y Corynebacterium sp.
Staphylococcus aureus es uno de los principales patógenos relacionados con la presencia de mastitis subclínica de tipo contagioso en los rebaños (Jurado-Gámez et al., 2019). Este microorganismo y Enterobacter spp. se identificaron como agentes causantes de esta enfermedad en una lechería de la Empresa Pecuaria Genética Los Naranjos, en el municipio Caimito provincia Artemisa, Cuba (García-Sánchez et al., 2018). Su aislamiento en la leche implica el riesgo de la presencia de enterotoxinas en este y otros productos lácteos que pueden causar gastroenteritis e infecciones en la piel en los humanos (Benić et al., 2018; NiolaToasa et al., 2020).
Las cepas de Staphylococcus sp. Coagulasa negativo y Corynebacterium sp. aisladas en el presente trabajo también son descritas como causantes de infecciones leves o de tipo subclínico (Sánchez Bonilla et al., 2018). Estos autores consideran a Staphylococcus sp.Coagulasa negativo como un patógeno emergente en mastitis a nivel mundial.
Corynebacterium spp. se encuentra entre los patógenos contagiosos y ambientales causantes de mastitis (Andrade et al., 2017; Hahne et al., 2018). Su presencia en un rebaño puede indicar la desinfección inadecuada de los pezones (Callejo, 2010). Este género bacteriano también se diagnosticó en casos de la enfermedad en cabras por Nabih et al. (2018).
Los tres microorganismos aislados en la presente investigación se clasifican como Gram positivos. Sin embargo, en la literatura consultada se plantea que esta enfermedad también pude ser causada por microorganismos Gram negativos. Entre estos Escherichia coli constituye uno de los aislamientos más frecuentes (Fiordalisi et al., 2016; Andrade et al.,2017).
Evaluación de la actividad antimicrobiana in vitro de diferentes concentraciones de Propolina ® frente a bacterias Gram positivas y negativas
Teniendo en cuenta los resultados obtenidos en el experimento anterior se determinó la actividad antimicrobiana in vitro de concentraciones de Propolina® entre 2,5 -60,0 mg·ml-1 frente a las cepas salvajes aisladas de vacas con mastitis subclínica y a la cepa de E. coli ATCC 25922 y los datos se procesaron estadísticamente. A partir del análisis estadístico se aceptó la normalidad de los datos ya que se obtuvo un p-valor igual a 0,0808. De manera similar, se aceptó la homogeneidad de la varianza de los datos (hipótesis nula), ya que el p-valor calculado fue de 0,163.
En la Tabla 1 se muestran los resultados estadísticos del Análisis de Varianza Simple realizado a cada grupo microbiano. Como se puede observar, el p-valor calculado para cada grupo microbiano fue menor que 0,05, por lo cual se obtuvieron diferencias significativas entre las distintas dosis evaluadas para cada microorganismo en estudio.
Tabla 1 Resultados estadísticos del Análisis de Varianza Simple realizado a cada grupo microbiano estudiado.
| Grupo microbiano | N | gl | Cuadrado medio | F | Sig. |
|---|---|---|---|---|---|
| 21 | 6 | 66,08 | 173,46 | 0,0000 | |
|
|
21 | 6 | 110,38 | 193,17 | 0,0000 |
| 21 | 6 | 40,60 | 1107,36 | 0,0000 |
La tabla 2 muestra los resultados del efecto antibacteriano de las concentraciones de Propolina® estudiadas frente a las cepas salvajes de Staphylococcus sp. Coagulasa negativo y a Staphylococcus aureus. En el caso de la primera cepa, la mayor inhibición se alcanzó con la concentración de 60,0 mg·ml-1, seguida por las concentraciones de 30,0, 20,0 y 7,5 mg·ml-1 respectivamente; mientras que las dosis de 5,0 y 2,5 mg·ml-1, no evidenciaron actividad inhibitoria con valores similares estadísticamente a la solución hidroalcohólica utilizada como control.
La Propolina® también fue efectiva frente a la cepa aislada de S. aureus. Todas las concentraciones evaluadas evidenciaron un efecto antibacteriano al comparar los resultados con la disolución hidroalcohólica control. Los valores de inhibición más altos se observaron con la concentración 60,0 mg·ml-1, seguida de 30,0 y 20,0 mg·ml-1, respectivamente. Las concentraciones entre 7,5 y 2,5 mg.ml-1 mostraron valores similares entre sí, inferiores a 20,0 mg.ml-1 del producto, pero superiores al control.
Según la escala de Duraffourd la cepa de S. aureus aislada fue sensible a las concentraciones de Propolina® superiores a 7,5 mg·ml-1 y muy sensible a la dosis máxima evaluada de 60 mg·ml-1 y la cepa de Staphylococcus spp Coagulasa negativo resultó sensible a la concentración 30 mg·ml-1 y muy sensible a 60 mg·ml-1.
Tabla 2 Actividad antibacteriana de diferentes concentraciones de Propolina® frente a Staphylococcusaureus, Staphylococcusspp. Coagulasa negativa y a Corynebacteriumsp.
| Propolina® (mg·ml-1) | |||||||||
| I (mm) | ± EE | S | I (mm) | ± EE | S | I (mm) | ± EE | S | |
| 2,5 mg·ml-1 | 6,33d | 0,33 | - | 0,00f | 0,00 | - | 1,9b | 0,22 | - |
| 5 mg·ml-1 | 7,33d | 0,33 | - | 0,66ef | 0,33 | - | 1,7b | 0,22 | - |
| 7,5 mg·ml-1 | 6,66d | 0,33 | - | 3,33d | 0,33 | - | 0,86c | 0,22 | - |
| 20 mg·ml-1 | 8,66c | 0,33 | + | 5,66c | 0,88 | - | 0,86 c | 0,22 | - |
| 30 mg·ml-1 | 11,0b | 0,00 | + | 8,33b | 0,33 | + | 0,86 c | 0,22 | - |
| 60 mg·ml-1 | 15,33ª | 0,66 | ++ | 17,66a | 0,33 | ++ | 10,83a | 0,22 | + |
| Alcohol (10%) Control | 0,00e | 0,00 | - | 1,66e | 0,33 | - | 0,83c | 0,22 | - |
I: diámetro de la zona de inhibición. Los datos representan medias de tres réplicas. Letras diferentes indican diferencia significativa según Duncan (P≤0,05). La sensibilidad (S) se indica según la escala de Duraffourd (-): nula, (+): sensible, (++): muy sensible. ± EE: error estándar.
Los resultados obtenidos concuerdan con los referidos por otros autores donde se observó un efecto antibacteriano del propóleo frente a Staphylococcus spp. Fiordalisi et al. (2016) estudiaron el efecto antibacteriano de diferentes concentraciones de propóleo frente a S.aureus. Estos investigadores observaron una reducción del crecimiento bacteriano en concentraciones entre 750-1,000 μg·ml-1, lo cual se relacionó con diversos componentes presentes en el propóleo, principalmente flavonoides, ésteres y compuestos terpenoides. Navarro López et al. (2018), también vinculan la acción antibacteriana del propóleo a la presencia de flavonoides, ésteres, sesquiterpenos, ácidos grasos, hidroxiácidos, además de otros compuestos como la acacetina y la galangina que establecen un sinergismo significativo para favorecer la actividad biológica.
Estudios similares de actividad antimicrobiana in vitro con un propóleo chileno frente a la cepa Staphylococcus aureus (ATCC 33862) evidenció una sensibilidad a concentraciones superiores a 1 mg.ml-1 (Balboa et al., 2018). En trabajos realizados por Rodríguez et al. (2020), se evaluó la efectividad de propóleos de diferentes regiones de México frente a esta especie bacteriana. Estos autores determinaron valores de Concentración Mínima Inhibitoria entre 0,19 y 15,0 mg·ml-1 y de Concentración Mínima Bactericida entre 0,37 y 30,0 mg·ml-1. Suran et al. (2015) obtuvieron valores de concentración mínima inhibitoria frente a Staphylococcus aureus entre 16 y 64 mg·ml-1, con el uso de soluciones no alcohólicas de propóleo.
Un estudio sobre el efecto de extractos etanólicos de propóleo frente a aislamientos de Staphylococcus spp. procedentes de cabras con mastitis, demostró la efectividad de estos extractos con una eficacia de 72,67% (Santos et al., 2020). En la presente investigación, se comprobó que la cepa Staphylococcus aureus fue sensible a concentraciones de 20, 30 y 60 mg·ml-1de Propolina®, mientras que la cepa Staphylococcus sp. Coagulasa negativo mostró sensibilidad ante 30 y 60 mg·ml-1 del producto.
En la tabla 2 se muestra además el efecto de la Propolina® frente a Corynebacterium sp. Como se puede observar, frente a este microorganismo solo se obtuvo un efecto inhibitorio en la máxima concentración evaluada (60 mg.ml-1). En el caso de la cepa Escherichia coli ATCC 25922 se consideró resistente ya que no mostró sensibilidad a ninguna de las dosis estudiadas.
La actividad antibacteriana observada en la presente investigación con el uso de la Propolina®, concuerda con los resultados obtenidos por otros investigadores. Klhar et al. (2019) enfrentaron un extracto etanólico de propóleo con una concentración de 300 mg·ml-1 a bacterias Gram positivas y Gram negativas y comprobaron que los niveles más altos de inhibición se alcanzaron frente a las Gram positivas.
Los resultados obtenidos en el enfrentamiento de las disoluciones de propolina ante Corynebacterium sp. pueden estar relacionados con las características estructurales de la pared celular, la cual tiene una arquitectura compleja debido a que estas bacterias están cubiertas por una capa de peptidoglicano a la que se une covalentemente una de arabinogalactanos. Unido a esto se encuentra una capa de ácidos micólicos, la cual es funcionalmente equivalente a la capa LPS de las bacterias Gram negativas. Adicionalmente, se encuentra una capa más externa compuesta de polisacáridos, glicolípidos y proteínas (Burkovski, 2013).Se ha descrito que uno de los mecanismos de resistencia intrínseca por los cuales las bacterias se hacen menos susceptibles a los desinfectantes es la formación de biopelículas, característica presente en este género (Rozman et al., 2021; Souza et al., 2020).
Fiordalisi et al., (2016) también estudiaron las propiedades antimicrobianas de propóleos brasileños de diferentes orígenes geográficos frente a cepas de Staphylococcus aureus y E. coli. En el caso de este último microorganismo, encontraron una eficacia limitada que se asoció con la complejidad química que poseen las paredes celulares de las bacterias Gram negativas. Resultados similares se encontraron al evaluar extractos etanólicos de propóleos mexicanos frente a estos dos microorganismos (Rodríguez et al., 2020). Estos autores lograron inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus, pero no se apreció efectividad frente a Escherichia coli.
CONCLUSIONES
Se aislaron e identificaron diferentes géneros microbianos causantes de mastitis subclínica que incluyen Staphylococcus aureus, Staphylococcus sp. Coagulasa negativo y Corynebacterium sp. Las soluciones de Propolina® mostraron una mayor efectividad frente a los microorganismos Gram positivos Staphylococcus aureus y Staphylococcus sp. Coagulasa negativo los cuales resultaron sensibles a las concentraciones 20, 30 y 60 mg·ml-1 y 30 y 60 mg·ml-1 de Propolina®, respectivamente
