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INTRODUCCIÓN
El crecimiento acelerado de la población trajo consigo el desarrollo de la acuicultura a escala mundial (Kasan et al., 2017), y el camarón blanco del Pacífico Penaeus vannamei es la especie de crustáceo más cultivada, nativo de la costa oeste del Pacífico de América Latina, e introducido desde 1996 en China y otros países de Asia (Wyban, 2019). La alta tolerancia a un amplio rango de salinidad, entre otros factores, hacen de esta especie un buen candidato para el cultivo. Sin embargo, altos niveles de las concentraciones de compuestos nitrogenados pueden afectar la salud de los animales cultivados e impactar negativamente sobre el crecimiento y la sobrevivencia (Valencia-Castañeda et al., 2019).
Numerosos investigadores reportan la toxicidad del amonio sobre el camarón (Valencia-Castañeda et al., 2018; Valencia-Castañeda et al., 2019; Thi et al., 2022), por lo que la conversión del amonio tóxico a la forma no tóxica de nitrógeno es una de las cuestiones más importantes en el manejo de calidad de agua en sistemas de cultivo intensivo (Ren et al., 2019). El incremento de la comunidad microbiana puede mejorar la calidad del agua mediante remoción de compuestos de nitrógeno tóxicos, mientras que las proteínas microbianas pueden ser usadas como alimento (Reis et al., 2019). Este es el fundamento de la tecnología Biofloc, ambientalmente amigable, que se basa en la producción in situ de microorganismos, donde los nutrientes pueden ser continuamente reciclados, y beneficiada por el mínimo o nulo recambio de agua (Gustavo et al., 2017).
Afortunadamente, dentro de las bacterias usadas como probiótico en acuicultura, el género Bacillus se encuentra entre las más estudiadas, además de la actividad floculante puede ofrecer otros beneficios como el reciclamiento de nitrógeno en el estanque de cultivo (Harun et al., 2018). No obstante, se hace necesario el aislamiento y caracterización de nuevas cepas de Bacillus biofloculantes que puedan ser usadas como inóculo en sistemas Biofloc de producción de P. vannamei. Así como, evaluar el efecto de los biofloculantes en el metabolismo y la respuesta inmune de Penaeus vannamei. El objetivo del presente trabajo es realizar una revisión sobre la aplicación de Bacillus en el cultivo del camarón, haciendo énfasis en su efecto biofloculante en Sistemas Biofloc.
DESARROLLO
La influencia de las comunidades bacterianas en la salud de los animales acuáticos es de crucial importancia. El intestino del camarón y su ambiente acuático son ecosistemas complejos donde conviven diversas comunidades bacterianas, en los cuales algunos microorganismos son probióticos mientas que otros son patógenos (Zheng et al., 2017).
Los microorganismos que forman el biofloc juegan tres roles principales en la tecnología Biofloc, mantenimiento de la calidad del agua mediante la utilización de compuestos nitrogenados, constituyen una fuente de alimento para los animales cultivados, y confieren propiedades probióticas y compiten con patógenos. Las bacterias heterótrofas (como Bacillus sp.) juegan un rol fundamental en los sitemas biofloc (Hossein y Mohammadi, 2022).
Género Bacillus, sus efectos en el cultivo de camarón
Dentro de las bacterias usadas como probiótico en acuicultura, el género Bacillus se encuentra entre las más estudiadas, es usado para mejorar el crecimiento de los animales cultivados y para el control de enfermedades (Kewcharoen y Srisapoome, 2019; Nimrat et al., 2020). Miembros del género Bacillus pertenecen al phylum Firmicutes, son clasificados como Gram-positivos y bacterias formadoras de esporas con estructura en forma de bastón (Abu Tawila et al., 2018). Pueden ser aerobios o anaerobios facultativos. Bacillus sp. produce un amplio rango de sustancias extracelulares y péptidos antimicrobianos contra una variedad de microorganismos y para mejorar la respuesta inmune de los animales cultivados (Niu et al., 2014).
Especies de Bacillus crecen eficientemente con fuentes de carbono y de nitrógeno de bajo costo. Han adquirido importancia comercial como productores de metabolitos secundarios como antibióticos, bioinsecticidas y enzimas. Las enzimas de Bacillus son muy eficientes para descomponer una gran variedad de carbohidratos, lípidos y proteínas en pequeñas unidades. Teniendo en cuenta estas características, Bacillus pueden ser considerados buenos candidatos como probióticos en la dieta del camarón, para mejorar la digestibilidad de los ingredientes de la dieta (Omont et al., 2021).
En su estudio, Ochoa-Solano y Olmos-Soto (2006) reportaron la actividad proteasa, α-glucosidasa y lipasa de cepas de Bacillus subtilis y Bacillus megaterium. Mientras que, Alsalman et al. (2022) reportaron la producción de la enzima quitinasa por Bacillus salmalaya. Los resultados de este estudio mostraron la capacidad de estas bacterias de producir gran cantidad de quitinasa en poco tiempo, por lo que podría degradar polisacáridos complejos presentes en los residuos orgánicos y contribuir a la conservación del medio ambiente (De Lourdes et al., 2014)
Varios investigadores describen el efecto de cepas de Bacillus en el mejoramiento de la respuesta inmune de los animales cultivados. El sistema inmune de crustáceos depende de la respuesta innata, y está constituido por la respuesta inmune celular y humoral. La respuesta celular involucra a los hemocitos que participan en reacciones como fagocitosis, apoptosis, nodulación y encapsulación. Mientras que la respuesta humoral depende de factores inmune tales como profenoloxidasa, lectinas, péptidos antimicrobianos, entre otros (Huang et al., 2020).
En su estudio, Niu et al. (2014) reportaron el potencial probiótico de la cepa de Bacillus sp. LT3 en larvas de camarón marino infectadas con Vibrio campbellii, donde mejoró la sobrevivencia por la disminución de la actividad in vivo del patógeno y por la estimulación de la respuesta inmune, con la activación del sistema pro-fenoloxidasa. Se ha reportado el aislamiento e identificación de cepas de Bacillus con la habilidad para degradar N-acil-homoserina lactonas (AHLs), una de las moléculas “quorum sensing” involucradas en la regulación de la producción del factor de virulencia en muchas bacterias patógenas.
Ramírez et al. (2022) evaluaron el potencial probiótico del consorcio microbiano que incluía tres cepas, Bacillus cereus sensu stricto (P64), Vibrio diabolicus (Ili) y Vibrio hepatarius (P62), usado para controlar la vibriosis. El probiótico mejoró la calidad de las larvas de camarón P. vannamei, que fueron expuestas previamente a Vibrio parahaemolyticus. Los resultados indican que el tratamiento previo de las larvas con el probiótico limitó la colonización del Vibrio patogénico.
Por otro lado, en estudio realizado por Luna-González et al. (2017), la adición de Bacillus licheniformis, melaza y la reducción de las tasas de alimentación no afectaron el crecimiento y la sobrevivencia del camarón. Los residuos nitrogenados se mantuvieron dentro del rango óptimo para el camarón. Cepas de Bacillus pueden jugar un rol importante en el proceso de nitrificación-desnitrificación. La reducción de la tasa de alimentación puede ayudar al mantenimiento de la calidad del agua y contribuir a la disminución de los costos en cultivo del camarón (Luna-González et al., 2017).
Clasificación de los floculantes
Existen tres tipos de floculantes: floculantes inorgánicos como sulfato de aluminio y cloruro de aluminio; floculantes orgánicos sintéticos como los derivados de poliacrilmadida y polietilenamina; y floculantes producidos naturalmente como los floculantes microbianos. Los floculantes inorgánicos y orgánicos antes mencionados son usados frecuentemente en los procesos industriales debido a su alta actividad y bajo costo. Sin embargo, estudios han mostrado que las sustancias floculantes orgánicas e inorgánicas pueden causar daños a la salud y al medio ambiente. En este sentido, los biopolímeros producidos por microorganismos son actualmente investigados, son biodegradables y seguros para la salud y el medio ambiente (Wandong et al., 2021).
Las bacterias son el principal componente del Biofloc, reportadas como microorganismos biofloculantes que producen biopolímeros, sustancias que pueden flocular sólidos suspendidos. Estos biopolímeros son conocidos como sustancias poliméricas extracelulares (SPE) producidos por microorganismos durante su crecimiento, que juegan un papel importante en el proceso de floculación (Kasan et al., 2017). Cada bacteria produce diferentes SPE, los cuales difieren en su habilidad en el proceso de floculación. Por lo que, las bacterias con alta actividad de floculación son potencialmente usadas como inóculo para incrementar el proceso de biofloculación en sistemas Biofloc de producción de P. vannamei (Harun et al., 2018).
Entre las bacterias reportadas como productoras de biofloculantes se encuentran Bacillus sp., Pseudomonas alcaligenes, Citrobactor sp., Enterobacter cloacae, Halomonas sp. y Klebsiella pneumoniae. Los biofloculantes microbianos incluyen polímeros como celulosa, proteínas, glucoproteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos (Gosai y Narolkar, 2022). El peso molecular y los grupos funcionales en las cadenas moleculares son determinantes en la actividad de floculación de los biofloculantes. Los grupos funcionales determinan el tipo de carga, su distribución y, en consecuencia, el tipo de interacción (Kushwaha et al., 2020).
Bacillus sp. como bacterias biofloculantes
Especies de Bacillus producen diferentes SPE, B. subtilis producen polisacáridos, B. consortium producen glicoproteínas, B. safensis producen proteínas funcionales, y algunas otras especies producen varias SPE. Afortunadamente, dentro de las bacterias usadas como probiótico en acuicultura, el género Bacillus, además de la actividad floculante puede ofrecer otros beneficios como el reciclamiento de nitrógeno en el estanque de cultivo (Harun et al., 2018).
Varios autores han reportado el potencial biofloculante de bacterias del género Bacillus. En el estudio realizado por Abu Tawila et al. (2018) reportaron la producción, optimización, y caracterización del biofloculante QZ-7 sintetizado por la cepa de Bacillus salmalaya 139SI aislada del suelo de una granja en Malasia. La máxima actividad floculante fue 92,6%; las condiciones óptimas para la producción del biofloculante fueron, temperatura superior a 35,5 ºC, pH 7±0.2, usando sacarosa y extracto de levadura como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente. Los análisis químicos revelaron que el biofloculante consistió de 79.08% de carbohidratos y 15.4% de proteínas. El biofloculante QZ-7 fue térmicamente estable, y mantuvo más del 80% de actividad después de ser calentado a 80 °C durante 30 min. Además, se demostró el efecto de la cepa de Bacillus salmalaya 139SI en la remoción de la materia orgánica, por lo que el biofloculante QZ-7 puede ser usado promisoriamente en el tratamiento de aguas residuales.
Otros resultados informaron los parámetros óptimos para la biofloculación por Gosai y Narolkar (2022), quienes usaron glucosa y cloruro de amonio como fuente de carbono y nitrógeno, presencia del catión cloruro férrico y pH 8. El análisis químico del biofloculante mostró el contenido proteico una concentración de 2,81 mg/ml y el contenido de carbohidratos una concentración de 1.86 mg/ml. En su estudio, aislaron Bacillus biofloculantes del agua de estaques de cultivo de camarón y otras fuentes, donde tres aislados mostraron actividad biofloculante; el aislado BF9 mostró la actividad biofloculante más alta.
Harun et al. (2018) evaluaron el potencial biofloculante de diferentes bacterias usando el método de suspensión de caolín Clay, donde seis especies mostraron actividad floculante. Fueron identificadas como Bacillus infantis, B. cereus, B. safensis, Halomonas venusta, Nitratireductor aquamarinus y Pseudoalteromonas. La mayor actividad biofloculante fue mostrada por Bacillus infantis (93%), lo que indica la más alta producción de SPE que favorecen el proceso de floculación. En esta investigación, reportaron baja actividad biofloculante en Pseudoalteromonas, mientras que Wandong et al. (2021) aseveran el elevado poder biofloculante de Pseudoalteromonas sp. NUM8. La producción óptima del biofloculante por la bacteria fue usando sacarosa y nitrato de sodio como fuente de carbono y nitrógeno, respectivamente; así como, la presencia del catión divalente (Ca) y pH 5.
Fakriah et al. (2019) reportaron el contenido proteico en SPE de bacterias biofloculantes aisladas de estanques de cultivo de Penaeus vannamei. Cada especie mostró diferentes concentraciones proteicas en SPE, desde 1.377 µg/mL hasta 1.455 µg/mL. En su estudio, Bacillus cereus y Bacillus pumilus mostraron la más alta actividad biofloculante, en comparación con otras bacterias de los géneros Nitratireductor, Pseudoalteromonas y Halomonas. Coincidentemente, Kasan et al. (2017) aislaron e identificaron bacterias productoras de biofloculantes, fundamentalmente de los géneros Bacillus y Halomonas, que constituyen candidatos para ser usadas como inóculo en la formación de Biofloc. Otros géneros fueron identificados como Providencia sp., Nitratireductor sp. y Pseudoalteromonas sp..
Aunque los biofloculantes microbianos incluyen polímeros como celulosa, proteínas, glucoproteínas, polisacáridos y ácidos nucleicos (Gosai y Narolkar, 2022), la composición química reportada de los biofloculantes producidos por Bacillus fue polisacáridos y proteínas. Según Budi et al. (2023), el biofloculante producido por Serratia marcescens en su composición química consistió de varios ácidos carboxílicos y enzimas intermediarias, indicando la presencia de polisacáridos y proteínas, lo que sugiere sean los principales constituyentes de biofloculantes bacterianos. A pH 7 su contenido proteico fue de 1,3 μg/mL y el contenido total de carbohidratos fue de 0,53 mg/L.
La preparación de los estanques es una etapa crucial en la acuicultura, que influye en la sobrevivencia y el crecimiento de los animales cultivados. Las postlarvas de crustáceos, por ejemplo, son susceptibles a los cambios abruptos en la calidad de agua. En estudio realizado por Fakriah et al. (2022), añadieron a la bacteria Bacillus infantis, reportada por su alto potencial biofloculante, como inóculo en la preparación de estanque en un sistema Biofloc. La cepa B. infantis BF3, aislada de muestras Biofloc de estaques de cultivo de camarón, fue usada para evaluar su efecto en la calidad del agua y en las comunidades bacterianas. La aplicación del biofloculante demostró sustancialmente su efecto en el desarrollo del Biofloc, ya que durante el periodo de estudio (10 días) el volumen de Biofloc fue significativamente superior en el tratamiento en comparación con el grupo control. El tratamiento con Bacillus infantis en el sistema Biofloc resultó en el incremento de bacterias heterótrofas viables, y en el mantenimiento de los nutrientes inorgánicos (amonio, nitrito, oxígeno disuelto) en niveles subletales (Widanarni et al., 2010).
Otros microorganismos con potencial biofloculante
Además de las bacterias, otros microorganismos como hongos y levaduras se reportan como productores de biofloculantes (Gosai y Narolkar, 2022). Los hongos son heterótrofos y compiten con las bacterias por fuentes como azúcares hexosas (fructosa y glucosa) en sistemas Biofloc. La presencia de filamentos fúngicos puede contribuir a la formación de grandes partículas de Biofloc. Algunas especies como Aspergillus sp. y Penicillium sp. han demostrado ser microorganismos biofloculantes con alta actividad de floculación. La interacción y la asociación de los hongos con otros microorganismos dentro del Biofloc, puede estimular el crecimiento y la sobrevivencia del camarón, así como incrementar la resistencia a enfermedades (Hossein y Mohammadi, 2022).
Hongos filamentosos tales como Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Spicaria y Hyaloflorea han sido reportados en su habilidad de atrapar sólidos suspendidos y garantizar la floculación debido a sus propiedades filamentosas. Los filamentos fúngicos compuestos por hifas favorecen la bioagregación y absorción de las células de microalgas, que pueden ser removidas del agua circundante (Tang et al., 2014). Las hifas y micelios fúngicos contienen polisacáridos con sitios activos que son responsables de la capacidad de bioabsorción; estos polisacáridos también le confieren carga a las células fúngicas (Kushwaha et al., 2020).
En su estudio, Mohd et al. (2019) usaron Aspergillus niger como biofloculante de microalgas en un sistema acuícola. El biofloculante mostró la habilidad para adaptarse a un amplio rango de pH de 3.0 a 9.0 y a un rango de 100-150 rpm, logrando una eficiencia de floculación mayor que 90%. El agua tratada mostró baja concentración de clorofila y baja densidad celular, lo que indica que Aspergillus niger es un biofloculante promisorio para ser usado en la floculación de microalgas en el tratamiento de aguas residuales en la acuicultura (Cardona et al., 2016).
Las microalgas juegan un importante rol en sistemas Biofloc, usan los compuestos nitrogenados para proteínas y azúcares, así como proveen de oxígeno en presencia de luz. Microalgas como las diatomeas y Chlorella sp. son buenas fuentes de aminoácidos esenciales y ácidos grasos insaturados para el camarón. En sistemas Biofloc la inoculación con diatomeas en el agua del cultivo mejora el rendimiento y el contenido de ácidos grasos de postlarvas de P. vannamei. La relación entre algas y comunidades bacterianas en sistemas Biofloc puede ser de mutualismo o antagonismo. Por ejemplo, algunas bacterias pueden contribuir al crecimiento de las algas, y las sustancias extracelulares secretadas por diatomeas pueden ser usadas por las bacterias como fuente de energía. Tales interacciones pueden contribuir al control de bacterias patógenas en sistemas Biofloc (Hossein y Mohammadi, 2022).
Las microalgas se unen a la SPE bacteriana y forman grandes flóculos que promueven la biofloculación. En este sentido, el ácido glutámico de Bacillus subtilis es usado para la colecta de biomasa de microalgas como Nanochlropsis occulata LICME 002, Phaeodactylum tricornutum, C. vulgaris LICME 001 y Botryococcus braunii LICME 003; y Bacillus licheniformis CGMCC 2876 es usado para la colecta de microalga Desmodesmus sp. F51 con una eficiencia de floculación de 92% (Kushwaha et al., 2020).
Por otro lado, la implementación de sustratos artificiales para proveer sitios para el desarrollo de comunidades microbianas, ha mostrado beneficios en el cultivo. En este sentido, Viau et al. (2014) evaluaron el efecto de biopelículas en postlarvas de camarón Farfantepenaeus brasiliensis, usando láminas de polietileno como sustratos artificiales. Para el desarrollo del medio heterotrófico los tanques fueron inoculados con diatomeas Thalassiosira weissflogii, alimento artificial, melaza y salvado de trigo; la relación Carbono: Nitrógeno (C/N) fue de 20:1. La sobrevivencia de las postlarvas fue más alta y los niveles de nitrito más bajos en los tratamientos donde hubo presencia de biopelículas estuvo presente. Estos resultados indican que el uso de biopelículas puede ser una buena alternativa para mejorar la sobrevivencia de las postlarvas mediante el mantenimiento de la calidad de agua.
Así mismo, Thompson y Abreu (2002) demostraron la efectividad de biopelículas compuesto principalmente por diatomeas (Amphora, Campylopyxis, Navícula, Sinedra, Hantschia y Cilindrotheca) en el mantenimiento de la calidad del agua por la reducción de los niveles de amonio y fósforo, y como fuente de alimento para el camarón. Las biopelículas asociado a sustratos sumergidos constituyó una fuente complementaria importante de alimento para el camarón, mejorando su crecimiento.
Relación carbono: nitrógeno (C/N)
En la tecnología de biofloc, los microorganismos muestran diferentes características funcionales y realizan tres funciones principales: (i) ayudar a mejorar la calidad del agua mediante la eliminación de compuestos inorgánicos de nitrógeno (bioacumulación, bioasimilación, nitrificación y desnitrificación); (ii) actuar como fuente de alimento complementario y (iii) crear propiedades probióticas; funciones clave para cualquier sistema de cultivo acuático (Khanjani et al., 2022).
La adición de fuentes de carbono a los sistemas acuícolas estimula el crecimiento de microorganismos heterótrofos, donde el nitrógeno se utiliza para generar proteínas microbianas. Entre estas fuentes de carbono se encuentran, la melaza, salvado de arroz, tapioca, entre otras (Azhar et al., 2016). La relación C/N es otro factor que afecta la densidad de bacterias heterótrofas y otros microorganismos en sistemas Biofloc. Esta relación es manejada para el control del nitrógeno amoniacal, por lo que tiene influencia en el crecimiento y el bienestar de los organismos cultivados en la acuicultura (Hossein y Mohammadi, 2022).
El manejo de la relación C/N en un sistema de cultivo puede promover una comunidad bacteriana dominada por bacterias heterótrofas, las que utilizan carbohidratos orgánicos para generar energía y crecer, para síntesis de proteínas y nuevas células. Una relación óptima C:N es clave para controlar el nitrógeno inorgánico, puede mejorar la producción y el reciclamiento de nutrientes (Avnimelech, 1999). El análisis metagenómico reveló que Vibrio constituía el 90% de la población de biofloc, mientras que también se detectaron Pseualteromonas, Photobacterium, Shewanella, Alteromonas, Bacillus, Lactobacillus, Acinetobacter, Clostridium, Marinifilum and Pseudomonas (Tepaamorndech et al., 2020). La densidad de Vibrio, patógenos oportunistas, disminuye con un aumento en las relaciones C/N, confirmando así la densidad de bacterias heterótrofas en tratamientos con alta relación C/N. Esto explica que las tasas de supervivencia mejoran al aumentar las tasas de C/N (Panigrahi et al., 2019).
Recientemente, en un cultivo de biofloc con P. vannamei aislaron seis especies de bacterias marinas conocidas como Halomonas venusta, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Nitratireductor aquimarinus y Pseudoalteromonas sp. Las cuales eran productoras de biofloculantes. La mayor actividad floculante la presentó Bacillus cereus con un 93% (Minaz y Kubilay, 2021). Hay una tendencia del empleo de Bacillus spp., entre ellas Bacillus infantis y Bacillus eclensis, como bioflocalantes para la mejora de la calidad del biofloc (Che Hashim et al., 2022).
CONCLUSIONES
Bacterias del género Bacillus son usadas por sus efectos benéficos en el cultivo del camarón. Aunque el potencial biofloculante de varias especies de Bacillus ha sido demostrado, es necesario aislar nuevas cepas y realizar futuras investigaciones para caracterizar sus biofloculantes, así como, evaluar el efecto en el metabolismo y el sistema inmune de Penaeus vannamei. Sería conveniente realizar otros estudios de optimización de las condiciones de cultivo para la producción de biofloculantes, usando nuevas fuentes de carbono y nitrógeno.
