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Introducción
Durante los últimos 50 años el número de individuos mayores de 65 años se ha triplicado en todo el mundo. Cuba exhibe una de las poblaciones más envejecidas de América Latina y se espera que para el año 2030 la población mayor de 60 años podría alcanzar el 30 %. 1,2
El envejecimiento se relaciona con cambios en ambas ramas del sistema inmune, innata y adquirida. Los cambios en el sistema inmune relacionados con la edad se han denominado inmunosenescencia. La existencia en esta etapa de la vida, de un entorno inflamatorio caracterizado por inflamación crónica de bajo grado, conocido por su nombre en inglés inflammaging, complementa el fenómeno de la inmunosenescencia. Los últimos veinte años de investigación han mostrado la estrecha relación entre estos fenómenos que acompañan al envejecimiento y las enfermedades relacionadas con la edad como las cardiovasculares, cerebrovasculares, degenerativas y el cáncer. 3
La inmunosenescencia afecta prácticamente todos los componentes del sistema inmune. Sin embargo, los cambios más descritos corresponden con la disminución de las células T vírgenes y el incremento de las células T de memoria, terminalmente diferenciadas, caracterizadas por la pérdida de marcadores de superficie como el CD28. 4,5 Estos cambios son en esencia atribuidos a la involución del timo, 6 a la estimulación antigénica crónica (principalmente el citomegalovirus [CMV]) 7 y la desregulación de algunas vías hormonales. 8,9
Al desarrollarse la mayor parte de las enfermedades neoplásicas en ancianos, resulta de alta relevancia conocer las características del sistema inmune en esta etapa de la vida y especialmente las relaciones que se establecen entre la respuesta inmune y el cáncer en el contexto del envejecimiento. La población cubana presenta la inusual combinación de larga expectativa de vida y alta carga antigénica, a la cual está sometida por encontrarse en el cinturón tropical. Por lo tanto, su estudio podría ayudar a comprender nuevos aspectos de la asociación entre enfermedades relacionadas con la edad, la inflamación crónica de bajo grado y la inmunosenescencia. 10
El presente trabajo describe los primeros resultados del estudio de la inmunosenescencia en Cuba. Hace referencia a las manifestaciones de este fenómeno en una población aparentemente sana, en pacientes con cáncer de pulmón y a los resultados de su tratamiento.
Métodos
Para la realización de este trabajo se estudiaron 209 pacientes y personas sanas, en tres etapas experimentales (figura 1).
Fig. 1 Descripción de los grupos experimentales y sus participantes. Leyenda: CPCNP, cáncer de pulmón de células no pequeñas; QT, quimioterapia.
Inicialmente se condujo el estudio de algunos marcadores de inmunosenescencia y subpoblaciones celulares en personas sanas de todas las edades. En otro momento experimental se evaluó la modificación de los marcadores de inmunosenescencia con la administración de un factor polipeptídico tímico desarrollado en Cuba (Biomodulina T). Por último, se estudiaron algunos marcadores de inmunosenescencia y subpoblaciones celulares en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas antes y después de recibir tratamiento de primera línea con quimioterapia basada en platinos, así como la relación entre los marcadores de inmunosenescencia y la supervivencia de pacientes con CPCNP, tratados con la vacuna terapéutica CIMAvax-EGF.
En todos los casos se realizó la determinación de las subpoblaciones celulares mediante la técnica de citometría de flujo.
La detección de anticuerpos anti-citomegalovirus de clase IgG, y la determinación de la concentración sérica de IL-6, se realizaron empleando el suero de los pacientes y personas sanas, mediante un ensayo inmunoenzimático con el empleo de estuches comerciales.
Se calcularon los estadígrafos descriptivos de las variables inmunológicas y se realizaron gráficos de datos agrupados. Todos los análisis se realizaron empleando los programas estadísticos SPSS para Windows, versión 19.0 y GraphPad Prism versión 6.0. Se compararon las variables inmunológicas utilizando prueba de Friedman cuando se compararon más de dos muestras relacionadas y la prueba de los rangos con signo de Wilcoxon cuando se compararon dos muestras relacionadas. En el caso del análisis de muestras no relacionadas, se utilizaron la prueba de Kruskal-Wallis o la prueba de Mann-Whitney, según fuera pertinente. Además, se emplearon pruebas de comparación a posteriori (prueba de Dunn).
En todos los casos se trabajó para un nivel de confianza de 95 %, a valores p <0,05, se consideró significación estadística.
Resultados y discusión
El incremento de las células T terminalmente diferenciadas en cubanos “sanos” está influenciado por la edad y el sexo
Este estudio, realizado en cubanos aparentemente sanos de todas las edades, confirmó la alta prevalencia de anticuerpos contra CMV en Cuba y demostró el efecto de la edad y el sexo en la dinámica de las poblaciones de células T durante el envejecimiento. De este modo, aunque las poblaciones de células T terminalmente diferenciadas CD8+CD28- y CD8+CD57+ se incrementaron con la edad, este incremento fue estadísticamente significativo solamente en los hombres. Las mujeres conservaron la frecuencia de estas poblaciones prácticamente constate con el paso de los años (figura 2A, 2B). Las células T terminalmente diferenciadas CD8+CD45RA+CD28- se incrementaron con la edad solo en las mujeres, pues los hombres exhibían una alta frecuencia de esta subpoblación desde edades tempranas (figura 2D, 2E). Los linfocitos T terminalmente diferenciados CD4+CD45RA+CD28- mostraron un incremento relacionado con la edad en ambos sexos (figura 2C, 2E), aunque los hombres exhibían altas proporciones de esta subpoblación desde la juventud. 10,11
Fig. 2 Frecuencia de células T terminalmente diferenciadas en personas sanas de todas las edades. A) Regresión lineal de la frecuencia de células T CD8+CD57+ en toda la población estudiada (línea negra, p = 0,03), en los hombres (línea azul, p=0,02) y en las mujeres (línea roja). B) Regresión lineal de la frecuencia de células T CD8+CD28- en toda la población estudiada (línea negra, p = 0,057), en los hombres (línea azul, p = 0,014) y en las mujeres (línea roja, p=0,997). C) Regresión lineal de la frecuencia de células T CD4+CD45RA+CD28- en toda la población estudiada (línea negra, p = 0,0046), en los hombres (línea azul, p = 0,0488) y en las mujeres (línea roja, p=0,0179). D) Regresión lineal de la frecuencia de células T CD8+CD45RA+CD28- en toda la población estudiada (línea negra, p = 0,123), en los hombres (línea azul, p = 0,569) y en las mujeres (línea roja, p = 0,02). E) Frecuencia de las células CD45RA+CD28- en linfocitos T CD4+ y CD8+ según grupo de edad y sexo (mujeres (barra gris clara) y hombres (barra gris oscura). Los asteriscos indican diferencias significativas, (*) p <0,05. El gráfico C representa la media y el intervalo de confianza 95 %, prueba de Mann Whitney.
Las células T de diferenciación terminal juegan un importante papel en varias enfermedades o condiciones relacionadas con la inflamación crónica, asociadas con la estimulación sostenida del sistema inmune como en el caso del cáncer, las infecciones crónicas de curso intracelular, las enfermedades pulmonares crónicas y las enfermedades autoinmunes. 10
La diferencia de comportamiento entre los sexos que se manifestó en los resultados de este estudio, justifican las diferencias en la respuesta inmune entre mujeres y hombres descritas en la literatura, fundamentalmente sustentadas en la existencia de diferencias genéticas y hormonales. 12 El predominio de células T terminalmente diferenciadas CD45RA+CD28- en los hombres cubanos desde su juventud, podría deberse a la exposición a altas cargas antigénicas (entre otros al CMV) desde edades tempranas, unido a la disminución de la salida de linfocitos del timo, apoyado por la involución más marcada de este órgano en los hombres. 13 Además, como los andrógenos se relacionan con involución del timo y con menor activación de la respuesta inmune, los hombres podrían tener un sistema inmune menos protector que el de las mujeres y podrían aparecer rasgos de inmunosenescencia desde la juventud.
La Biomodulina T restaura transitoriamente poblaciones de células T CD4+ y CD8+
Generar un microambiente tímico funcional es de suma importancia para el mantenimiento del compartimiento de células T con adecuada diversidad de repertorio. 14,15 El restablecimiento del microambiente tímico pudiera resultar un enfoque prometedor para evitar la disminución del número de células T vírgenes y desacelerar la acumulación de células T terminalmente diferenciadas, durante el envejecimiento. Por lo tanto, podría contribuir con la preservación o el restablecimiento de la protección inmunológica y potenciar la calidad de la respuesta inmune contra infecciones y contra el cáncer, 15,16 lo que resultaría de una alta relevancia para la población que envejece.
La administración de la fracción polipéptidica Biomodulina T a personas entre 65 y 85 años, con historia de infecciones respiratorias recurrentes y no otra enfermedad crónica diagnosticada, indujo la expansión temporal de linfocitos T CD4+ vírgenes (figura 3A), de linfocitos T CD4+ recientemente emigrados del timo (figura 3b) y de células T CD8+ de memoria con caracteres de células madre (figura 3C). También disminuyó la expresión de células T CD4+PD1+ y T CD8+PD1+ (figura 3D), lo que resalta el valor anti-agotamiento de este polipéptido tímico cubano. La expresión de Ki67, evaluada como marcador de proliferación celular (figura 3E), y de interferón gamma (IFN-γ) intracelular (figura 3F) fue significativamente superior después del tratamiento con Biomodulina T en las células T CD4+. Todos estos beneficios al sistema inmune, con el empleo de Biomodulina T, ocurrieron en un contexto de no modificación de las células T reguladoras (figura 3G), por lo tanto, dada la importancia de restablecer la competencia inmunológica en pacientes con cáncer avanzado que han recibido tratamiento con terapias convencionales y que pudieran ser tributarios de inmunoterapia, podría sugerirse a la Biomodulina T como una estrategia potencial para la inmunomodulación en ancianos con cáncer. 17
Fig. 3 Valores relativos de células T CD4+ y T CD8+ en pacientes tratados con Biomodulina T. A) Frecuencia de células T CD4+ vírgenes. B) Frecuencia de células T CD4+ recientemente emigradas del timo (RTE). C) Frecuencia de células T CD8+ de memoria con características de células madre (SCM). D) Frecuencia de células T CD4+ y T CD8+ que expresan PD1. E. Frecuencia de células T CD4+Ki67+. F) Frecuencia de células T CD4+ productoras de IFN-γ. G) Frecuencia de células T reguladoras. Se representa la media y el intervalo de confianza 95 %. Los asteriscos indican diferencias significativas, (*) p <0,05, prueba de Wilcoxon, prueba de Friedman, prueba de Dunn a posteriori. (Antes BT) antes del tratamiento, (Fin BT) al finalizar el tratamiento, (4 semanas post-BT) 4 semanas después de concluido el tratamiento con Biomodulina T.
La aplicación de estrategias terapéuticas para revertir los cambios del sistema inmune con la edad, debe ser cuidadosamente analizada 3,14. No obstante, como no es esperable que la evolución pueda fijar rasgos en la etapa post reproductiva, las estrategias de intervención sobre la inmunosenescencia pudieran contribuir positivamente con la restauración inmune para potenciar la respuesta contra agresores. Asimismo, pudieran preparar el escenario inmunológico para mejorar la eficacia de la inmunoterapia en pacientes con cáncer.
La quimioterapia basada en platinos induce el incremento de poblaciones T CD4+ y CD8+ terminalmente diferenciadas
La edad es el factor de riesgo más importante de la carcinogénesis. 18 El elemento más importante pudiera ser simplemente el paso del tiempo que permite la acumulación de daños por radicales libres, virus, carcinógenos u otros agentes que pueden causar mutaciones y favorecer el desarrollo de procesos oncoproliferativos. 18,19 El conocimiento de la contribución de la inmunosenescencia al desarrollo y la progresión del cáncer, podría propiciar mejores intervenciones terapéuticas contra esta enfermedad en los ancianos. 20
En nuestra investigación realizada en pacientes diagnosticados con cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) avanzado se demostró disminución de los linfocitos B (figura 4A) y del índice CD4/CD8 (figura 4B) en los pacientes con cáncer, vírgenes de tratamiento. Así como, incremento de la concentración sérica de interleuquina 6 (IL-6) (figura 4E) y de las células T terminalmente diferenciadas CD4+CD28- y CD8+CD28- (figura 4C y 4D) en los pacientes que habían recibido tratamiento de primera línea con quimioterapia basada en platinos. Lo que sugiere el efecto del cáncer y la quimioterapia sobre los marcadores de inmunosenescencia evaluados. La reducción de las células B y del índice CD4/CD8 en los pacientes con cáncer, vírgenes de tratamiento, apunta hacia un efecto de la enfermedad tumoral. Por otra parte, los niveles elevados de IL-6 en suero y el incremento de las poblaciones CD28 al emplearse quimioterapia basada en platinos, apuntan a un efecto de la quimioterapia y a la observación de que la quimioterapia basada en platinos pudiera generar la inducción de rasgos de inmunosenescencia en los pacientes que la reciben. 10,21
Fig. 4 Linfocitos T (CD4+ y CD8+) y células B (CD19+) en pacientes con CPCNP y personas sanas y concentración sérica de IL-6 en pacientes y personas sanas. A) Conteo absoluto de células B. B) Índice CD4/CD8. C) Frecuencia de células T CD4+CD28-. D) Frecuencia de células T CD8+CD28-. E) Concentración en suero de IL-6 en pacientes y personas sanas. Se representa la media y el intervalo de confianza 95 %. Los asteriscos indican diferencias significativas, (**) p <0,01, ANOVA, prueba de Dunn a posteriori. Vol. Sanos: personas sanas; Pac.Can: pacientes con CPCNP; Pac.Can+QT: pacientes con CPCNP tratados con quimioterapia; CPCNP: cáncer de pulmón de células no pequeñas; QT: quimioterapia.
Marcadores de inmunosenescencia como predictores de la eficacia clínica de CIMAvax-EGF
La frecuencia de células T CD8+CD28-, de células T CD4+ y el índice CD4/CD8 evaluados después de concluir la primera línea de quimioterapia y antes del inicio del tratamiento con la vacuna terapéutica CIMAvax-EGF, impactaron en el beneficio clínico de los pacientes con CPCNP vacunados. Los pacientes vacunados con células T CD4+ mayor de 40 %, índice CD4/CD8 mayor que 2 y frecuencia de células T CD8+CD28- por debajo de 24, alcanzaron supervivencias superiores en 20 meses en comparación con los pacientes no vacunados (figura 5). Estos resultados sugieren la utilidad de los marcadores de inmunosenescencia como predictores de la eficacia clínica de la vacuna terapéutica CIMAvax-EGF. 10,21
Fig. 5 Funciones de supervivencia con relación a marcadores de inmunosenescencia en pacientes con CPCNP vacunados con CIMAvax-EGF y no vacunados. A) Función de supervivencia para pacientes vacunados y no vacunados con frecuencia de células T CD4+>40 % (p = 0,01). B) Función de supervivencia para pacientes vacunados y no vacunados con frecuencia de células T CD4+<40 %. C) Función de supervivencia para pacientes vacunados y no vacunados con índice CD4/CD8 >2 (p = 0,04). D) Función de supervivencia para pacientes vacunados y no vacunados con índice CD4/CD8 <2. E) Función de supervivencia para pacientes vacunados y no vacunados con frecuencia de células T CD8+CD28-<24 % (p = 0,03). F) Función de supervivencia para pacientes vacunados y no vacunados con frecuencia de células T CD8+CD28->24 %. CPCNP: cáncer de pulmón de células no pequeñas
La vacuna terapéutica CIMAvax-EGF, creada y desarrollada en nuestro país, sobresale entre las alternativas inmunoterapéuticas para tratar pacientes con CPCNP. Diseñada para inducir anticuerpos capaces de neutralizar el factor de crecimiento epidérmico (EGF) circulante, ha mostrado su seguridad y eficacia durante más de 20 años de investigación clínica 22.
Conclusiones
Una mirada de conjunto a los resultados contenidos en este artículo, permite identificar que en los cubanos ocurren cambios en el sistema inmune dependientes de la edad, del sexo, del cáncer, de la quimioterapia y que los cambios que se generan por la edad son susceptibles de intervención. Este es el primer estudio del fenómeno de la inmunosenescencia en Cuba, y como todo camino que se inicia, contiene todavía más preguntas que respuestas.
Los resultados de este trabajo sugieren que, en los cubanos, en un contexto de alta prevalencia de anticuerpos contra CMV, varias subpoblaciones linfocitarias y marcadores de inmunosenescencia se modifican por la edad y el sexo en sujetos sanos; así como por la enfermedad tumoral y el empleo de quimioterapia de primera línea en pacientes con cáncer de pulmón. La recomendación del uso de marcadores de inmunosenescencia como posibles biomarcadores predictivos de la eficacia clínica de la vacuna terapéutica CIMAvax-EGF, evidencia su utilidad para personalizar el tratamiento de los pacientes y administrar la inmunoterapia a aquellos pacientes que recibirán un mayor beneficio clínico.
Finalmente, este estudio sugiere la posibilidad de revertir rasgos de inmunosenescencia a partir de la intervención con el factor tímico Biomodulina T y orienta el camino hacia la posible utilización de este medicamento en combinación con otras inmunoterapias como la propia vacuna terapéutica CIMAvax-EGF, con el fin de incrementar el potencial del sistema inmune como parte de la terapéutica contra el cáncer. No obstante, la descripción y clasificación de los cambios del sistema inmune relacionados con la edad dista mucho de estar completa. En los próximos años asistiremos a la ampliación de la cantidad de marcadores y su categorización según su significación biológica y su valor pronóstico. De este modo, la evaluación de nuevas intervenciones terapéuticas, tendrá que irse amoldando al nuevo panorama que surja de los estudios básicos sobre la inmunosenescencia.
