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INTRODUCCIÓN
El género Bacillus se destaca por su empleo en el biocontrol de fitopatógenos, aunque se ha ampliado la utilización de cepas promisorias en la promoción del crecimiento vegetal. Además, estas bacterias presentan ventajas en este sentido como la formación de endosporas que le proporcionan mayor sobrevivencia en el suelo, elevada velocidad de crecimiento y amplia versatilidad en la producción de metabolitos. Los inoculantes microbianos basados en las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB) reducen la dependencia de productos químicos de alto riesgo en la agricultura y constituyen alternativas económica y ambientalmente viables. En particular, la prospección y el estudio de la biodiversidad de las especies de Bacillus pueden tener especial interés, teniendo en cuenta las amplias potencialidades de este género para la producción sostenible de alimentos, aspecto vital en el desarrollo actual de nuestro país. La mayor parte de los estudios nacionales e internacionales de este género bacteriano, analizan el control de plagas por Bacillus thuringiensis; en otros casos se han hecho aislamientos y caracterizaciones parciales relacionadas con sus atributos como promotor del crecimiento de las plantas o antagonista de patógenos. Por estas razones el objetivo de esta investigación fue caracterizar integralmente aislados de la clase Bacilli para la selección de cepas potencialmente eficientes para su uso en la agricultura sostenible.
MÉTODOS
Aislamientos de Bacilli
Se tomaron muestras de rizosfera y plantas de arroz, maíz y cafeto de diferentes localidades, en zonas que no habían sido biofertilizadas. Se calentaron las muestras diluidas a 80 ºC durante 30 minutos y se sembró en medio de cultivo Agar Triptona Soya o Agar Nutriente. Se realizó tinción de Gram. Se seleccionaron como Bacilli los bacilos Gram positivos con crecimiento aerobio formadores de endosporas.
Determinación de los atributos como promotores del crecimiento
La determinación de la producción de indoles tipo ácido indolacético (AIA), de la capacidad de crecer en medio libre de nitrógeno, de solubilización de fosfatos se realizaron según Rojas et al. 1 Se determinó la producción de enzimas fosfatasas utilizando el p-nitrofenil fosfato de sodio, a diferentes pH según fuera ácidas o alcalinas, y midiendo por espectrofotometría la producción de p-nitrofenol, producción de amonio empleando el reactivo de Nessler y de 1-amino 1-ciclopropano carboxilato (ACC) desaminasa mediante la siembra en un medio mínimo con ACC como única fuente de nitrógeno.
La obtención, validación de los antisueros policlonales y de la técnica inmunoquímica para su empleo en la detección del AIA se describen en Rojas et al. 2 Además, se llevó a cabo la caracterización de los indoles producidos por cromatografía en capa delgada y el efecto del AIA en el crecimiento de las plantas in vitro, 3 así como el efecto de esta hormona en el crecimiento de cepas de Bacillus. 4
Determinación de la actividad antagonista in vitro y posibles mecanismos involucrados
Para determinar el efecto antagonista de los aislados obtenidos frente a 11 hongos fitopatógenos que afectan diferentes cultivos de interés económico se empleó la metodología de cultivo dual. 5,6 La determinación de biosurfactantes se realizó por el método del colapso de la gota y de cianuro de hidrógeno (HCN), mediante la reacción de este con carbonato de calcio en ácido pícrico. Se determinó la actividad de diferentes enzimas líticas (glucanasas, proteasas, lipasas, quitinasas y amilasas) midiendo el halo de hidrólisis producido en un medio con el sustrato adecuado según la enzima (celulosa, leche descremada, tween 80, quitinasa coloidal y almidón) y en los casos necesarios un revelador (rojo congo para glucanasas y lugol para amilasas).
Identificación de aislados seleccionados por sus potencialidades
Se secuenció el gen que codifica el ARN ribosómico 16S (ADNr16S) y se comparó con las bases de datos del Genbank. 5 Se trabajó en la búsqueda in silico de un fragmento de la subunidad A del gen de la girasa (gyrA) a partir de 32 secuencias diferentes de Bacillus obtenidas del GenBank y alineadas usando el programa ClustalW, para diseñar una pareja de nuevos cebadores para la amplificación de este fragmento, y se realizó la secuenciación para su identificación a nivel de especie.
Colonización y atributos que lo permiten
Se cuantificó la producción de biopelículas por el método de violeta cristal. 1 Se probó la capacidad de movimiento, tanto de tipo superficial mediado por flagelo (swarming) como natatorio (swiming), mediante la inoculación superficial o por punción en el medio de cultivo con 0,6 % y 0,3 % de agar, respectivamente. Se estudió la dinámica de colonización por la inoculación de semillas de arroz con cepas dobles mutantes a los antibióticos rifampicina y acido nalidíxico (RP27 y EAI5), y se cuantificaron en medio selectivos con los antibióticos una semana postinoculación. Además, se visualizó mediante microscopía de fluorescencia, la presencia de la bacteria en las raíces y los tallos de las plantas de arroz, empleando estas cepas marcadas con proteína verde fluorescente.
Estudio molecular de poblaciones de Bacillus provenientes de arroz
Se caracterizó la diversidad de 17 cepas de Bacillus spp. a través del análisis combinado de cuatro marcadores RAPD (por sus siglas en inglés: Random amplified polymorphic DNA), para estudiar la diversidad dentro de la población de Bacillus asociados al cultivo del arroz. Además, estas cepas se caracterizaron mediante PCR en cuanto a la presencia de ocho determinantes de virulencia para humanos empleando cebadores específicos para cada caso.
Efecto de cepas seleccionadas en el crecimiento de las plantas en condiciones semicontroladas
Los bioensayos de inoculación en maíz, tomate y zanahoria en condiciones semicontroladas se describen en Rojas et al. 7
Análisis biométricos
Para todos los ensayos se realizaron diseños experimentales según el caso. Los experimentos in vitro se realizaron por triplicado y los in vivo, con 10 repeticiones cada uno. Se analizaron la normalidad y homogenidad de varianza para determinar el cumplimiento de las premisas para análisis paramétricos. Según el caso se seleccionaron las pruebas paramétricas o no para las comparaciones de los resultados. Se empleó el paquete estadístico STATISTICA versión 8,0 para Windows.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A partir de los aislamientos realizados de arroz, maíz y cafeto, se obtuvieron 145 aislados nativos de la rizosfera y endófitos de la raíz y la parte aérea, presentando la mayor frecuencia de aparición en la rizosfera (Tabla 1). Estos aislados son bacilos Gram positivos formadores de endosporas con crecimiento aerobio, lo que permitió clasificarlos como pertenecientes a la clase Bacilli.
Tabla 1 Distribución de los aislados obtenidos a partir de diferentes cultivos
| Cultivo | Cultivar | Localidad | Rizoféricos | Endófitos | Total |
|---|---|---|---|---|---|
| Arroz ( |
Iacuba 30 | Instituto de Investigaciones de Granos (IIG), Bauta, Artemisa | 11 | 13 | 24 |
| Perla de Cuba | 27 | 7 | 34 | ||
| J-104 | 7 | - | 7 | ||
| INCA-LP5 | 6 | - | 6 | ||
| Maíz ( |
Híbrido P-7928 | Instituto de Investigaciones Fundamentales de Agricultura Tropical “Alejandro de Humboldt” (INIFAT), La Habana | 9 | 10 | 19 |
| Jibara | 14 | 4 | 18 | ||
| Francisco Mejorado | 6 | 5 | 11 | ||
| Cafeto ( |
Caturra amarillo | Finca El Dorado, Granma | 10 | - | 10 |
| Caturra | Finca de pequeño agricultor, Quivicán, Artemisa | 8 | - | 8 | |
| Caturra rojo | Colección de Germoplasma de la Estación Café y Cacao, Baracoa, Guantánamo | 8 | - | 8 |
Fuente: elaboración propia
Caracterización de atributos para la promoción del crecimiento
Las cepas estudiadas solubilizan fosfato de calcio, hierro y aluminio, mineralizan fósforo orgánico a través de fosfatasas ácidas y alcalinas, producen indoles tipo ácido 3-indolacético, amonio, la enzima 1-aminocicloproano a carboxilato desaminasa (ACCd) y fijan nitrógeno atmosférico en diferente medida. 5,1,8 Todos estos estudios permitieron seleccionar las cepas que muestran la mayoría de estos atributos (Tabla 2).
Por otra parte, se obtuvieron antisueros en conejo utilizando como antígeno el AIA adherido a membranas de nitrocelulosa, que mostraron un elevado título y especificidad. Mediante la técnica de inmunoadsorción se detectó la producción de esta auxina, lo que se corresponde con su cuantificación por espectrofotometría. Esto permitió la validación de este ensayo para la detección rápida y eficiente de este metabolito. 2 Además, se demostró que el AIA es mayoritario entre los indoles producidos por las cepas analizadas mediante cromatografía en capa delgada 3 y cómo este puede influir en el crecimiento de cepas del género de interés. 4
Caracterización de atributos para el antagonismo de patógenos
Se probó el antagonismo de 15 cepas de arroz, 5,9 dos de maíz y 20 de cafeto 6 frente a diferentes hongos fitopatógenos, según el caso: Pyricularia oryzae, Alternaria solani, Curvularia sp., Fusarium sp., F. chlamydosporum, F. oxysporum, F. moniliforme, F. incarnatum, Corynespora cassicola, A. brassicicola, Cladosporium fulvum, lo que contribuiría a establecer medidas integrales para el mejoramiento de la salud de la planta. Se demostró la producción de enzimas líticas (glucanasas, proteasas, quitinasas, lipasas y amilasas), HCN y biosurfactantes, lo que sustenta la actividad antagonista de estas cepas. Se seleccionaron las cepas más promisorias para el control biológico de los hongos evaluados (Tabla 2).
Tabla 2 Resumen de los atributos como promotoras del crecimiento y antagonistas de patógenos fúngicos de las cepas seleccionadas de Bacilli aisladas de diferentes cultivos
Cc: Corynespora cassicola, Fc: F. chlamydosporum, Fi: F. incarnatum, Ab: A. brassicicola, Cf: Cladosporium fulvum, HCN: cianuro de hidrógeno, ND: no determinado.
Fuente: elaboración propia.
Estudios de colonización
La capacidad de formar biopelículas y la motilidad ofrecen ventajas para la colonización de la rizosfera y el interior de las plantas, lo que contribuye al efecto positivo sobre estas. Al medir la producción de biopelículas en 19 cepas de arroz, 19 de maíz y dos de cafeto, se determinó que los máximos de producción coinciden con las 48 h y 72 h en todas las cepas. Tanto el movimiento de tipo superficial mediado por flagelo (swarming) como el natatorio (swiming), en ocho cepas de arroz, dos de maíz y dos de cafeto alcanzan los mayores valores a partir de las 48 h. Se demostró en la inoculación de plántulas de arroz con cepas dobles mutantes a los antibióticos rifampicina y acido nalidíxico (RP27 y EAI5), que estas aparecían en concentraciones superiores a 103 UFC.planta-1 después de una semana. Sin embargo, la cepa RP27 coloniza mejor la planta de arroz independientemente de la variedad de que se trate. Además, se demostró mediante microscopía de fluorescencia, empleando estas cepas marcadas con proteína verde fluorescente, que una semana después de la inoculación la bacteria se encuentra diseminada en las raíces y tallos de las plantas de arroz.
Estudios de diversidad en la población de Bacillus proveniente del cultivo del arroz
La caracterización de la diversidad de 17 cepas de Bacillus spp. a través de marcadores RAPD, demostró que se forman grupos de dos y tres cepas con más del 70 % de similitud y las demás quedan aisladas. Las cepas de B. thuringiensis forman un grupo separado del resto de las cepas, que en sentido general muestran un alto grado de diversidad dentro de la población de Bacillus asociados al cultivo del arroz. Además, estas en las cepas de B. thuringiensis se demostró la presencia de cuatro determinantes de virulencia, cyt K2, clo, nheA y hbl, y hemólisis tipo ß, lo que excluye a estas cepas de su posible uso en la agricultura considerando el riesgo potencial para la salud humana.
Identificación de aislados promisorios
La secuenciación del gen que codifica el ARN ribosómico 16S (ADNr16S) y su comparación con las bases de datos permitió ubicar dentro del género Bacillus a 21 cepas de arroz y seis de cafeto. Por la complejidad taxonómica de este género es necesario para la identificación a nivel de especie emplear más de un gen. Se diseñó una pareja de nuevos cebadores para la amplificación de un fragmento del gen gyrA de este género, y se secuenciaron e identificaron a nivel de especie de cuatro cepas aisladas de cafeto.
Efecto de la aplicación de cepas seleccionadas en condiciones semicontroladas
Con el objetivo de probar la posible acción de las auxinas producidas por las bacterias, se determinó el efecto biológico de la concentración del AIA producido por dos cepas de Bacillus en semillas de arroz. Se observó un mayor crecimiento de las raíces secundarias con el tratamiento con las cepas RC9 y RCQ7 y la menor concentración de AIA (2 (g.mL-1), lo que beneficia mucho más a la planta debido a que aumenta la superficie de absorción de nutrientes y la raíz puede explorar un mayor volumen de suelo. 3
Se realizaron bioensayos en condiciones semicontroladas en cultivos de maíz, tomate y zanahoria como plantas modelo, lo que demostró a nivel de invernadero que las cepas ejercen efecto estimulador del crecimiento de las plantas de maíz y tomate. En estos dos cultivos se obtuvieron los mayores efectos a nivel de la raíz, en la cual se muestran modificaciones en su arquitectura, resultado alentador por la función de esta en la toma de agua y nutrientes. 7 Estos resultados validan las potencialidades de las cepas para ser utilizadas en diversas plantas, lo que amplía la posible utilización del futuro bioproducto.
Propuesta de una metodología para la prospección, selección y caracterización de Bacillus de interés para la sostenibilidad agrícola
Este trabajo ha permitido proponer una metodología integral desde el aislamiento de las cepas, incluyendo su caracterización integral que permite la selección de las más promisorias, hasta los estudios de interacción planta-bacteria en condiciones semicontroladas para proponer cepas eficientes a este nivel y continuar los estudios de escalado y ensayos en campo (Anexo).
Este trabajo permite disponer de una colección microbiana nativa, caracterizada integralmente, eficiente en la promoción del crecimiento vegetal y con actividad antagonista de patógenos que afectan a cultivos de importancia económica, que constituyen la base para la obtención de nuevos bioproductos, cuyo uso permitiría disminuir la aplicación de químicos en la agricultura, con un impacto positivo en la producción de alimentos y la protección del medio ambiente.
