Servicios personalizados
Español (pdf)
Articulo en XML
Referencias del artículo
Enviar articulo por email
Citado por SciELO 
Similares en
SciELO 
Permalink
INTRODUCCIÓN
La leishmaniasis es causada por la transmisión zoonótica o antroponótica de parásitos protozoarios del género Leishmania (Trypanosomatidae). Estas enfermedades siguen siendo enfermedades tropicales desatendidas, reportándose cerca de 20 especies de parásitos de Leishmania que alternan su ciclo de vida en 2 formas: a) el promastigote extracelular y b) el amastigote intracelular. 1
Históricamente, la leishmaniasis se ha limitado a regiones endémicas, aunque las estimaciones actuales sugieren que más de 10 millones de personas están infectadas, con 2 millones de casos nuevos y más de 20 000 muertes anualmente. 2 El diagnóstico de estas enfermedades es limitado. Dependiendo de la especie involucrada y la respuesta inmune del huésped, pueden presentarse un amplio espectro de manifestaciones clínicas que varían desde la leishmaniasis cutánea (LC) a la forma visceral (LV). 3
Los tratamientos antileishmaniales que actualmente se encuentran disponibles incluyen los derivados de antimonio pentavalente, la pentamidina, la miltefosina, la anfotericina B y la paramomicina, cuyo uso está principalmente limitado en regiones endémicas, debido a la ineficacia, toxicidad y altos costos. 4,5 Además, la ausencia de vacunas, conlleva a la necesidad de buscar nuevas opciones de tratamiento para los pacientes infectados por Leishmania. Durante la última década, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha propuesto como una de las estrategias más atractivas la búsqueda de nuevos compuestos con actividad antileishmanial a partir de fuentes naturales. En este sentido, la actividad antileishmanial de productos derivados fundamentalmente de plantas ha sido ampliamente explorado. 6 Teniendo en cuenta la amplia y rica flora existente en Cuba, diferentes productos han sido evaluados, entre los que figuran los derivados de Bixa orellana L (familia Bixaceae). Por lo tanto, en este trabajo se evaluaron las potencialidades de extractos, fracciones, subfracciones y el aceite esencial obtenido de las semillas de esta planta sobre la LC.
MÉTODOS
Plantas y productos de B. orellana: Las plantas fueron colectadas en los alrededores del Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí, La Habana e identificadas por el MSc. Ramón Scull. Un espécimen fue depositado en el Jardín Botánico Nacional de La Habana, Cuba, con el número de ejemplar JBN-9600288. Las semillas fueron seleccionadas y secadas en estufa con ventilación. El extracto fluido se preparó mediante maceración de 7 días con etanol al 80 % de acuerdo con el reglamento NR309. 7 A partir de este, se realizó un primer paso de fraccionamiento por agotamiento utilizando diferentes solventes de polaridad creciente (n-hexano, acetato de etilo y metanol) para obtener 4 fracciones con el residuo final: BO-A, BO-B, BO-C, y BO-D. El disolvente se evaporó y cada fracción se sometió a un segundo paso de subfraccionamiento en una columna LH-20 sephadex de 2 cm x 30 cm utilizando metanol como fase móvil para obtener 10, 5, 4 y 9 subfracciones de BO-A, BO-B, BO-C, y BO-D, respectivamente. En todos los casos se evaporó el disolvente y se liofilizó.
El aceite esencial se obtuvo mediante hidrodestilación de las semillas utilizando un equipo tipo Clevenger durante 5 horas. Este producto en particular fue utilizado para obtener una formulación basada en nanococleatos. De todos los productos se separó una muestra para realizar la caracterización química y otra fue diluida en dimetilsulfóxido a una concentración de 20 mg/mL para los ensayos biológicos.
Modelos biológicos: Para las evaluaciones biológicas de los productos obtenidos de B. orellana se utilizó la cepa de referencia de L. amazonensis (MHOM/77BR/LTB0016) y en los estudios de mecanismo de acción la especie de L. tarentolae (P10). Los estudios in vitro se llevaron a cabo sobre promastigotes o amastigotes intracelulares; mientras que para los experimentos in vivo se utilizó el modelo de LC experimental en ratones BALB/c (código de aprobación CEI-IPK 14-12).
RESULTADOS
El extracto hidroalcohólico evaluado mostró actividad significativa contra promatigotes y amastigotes con una concentración inhibitoria media (CI50) de 22,1 μg/mL ± 0,05 μg/mL y 9,1 μg/mL ± 0,6 μg/mL, respectivamente. Sin embargo, la toxicidad fue moderada, con una concentración citotóxica media (CC50) de 224,6 μg/mL ± 3,3 µg/mL e índice de selectividad de 25, lo que sugirió la actividad específica para Leishmania. El tratamiento de ratones con el extracto no provocó la muerte o pérdida de peso superior al 10 %. Una reducción significativa (p < 0,05) en el tamaño de las lesiones en los animales tratados con el extracto fue observado durante los primeros 14 días en comparación con el otro grupo (figura 1A), lo cual fue corroborado mediante la determinación de la carga parasitaria (figura 1B).
Fig. 1 Efecto del extracto hidroalcohólico de semillas de Bixa orellana en ratones BALB/c infectados con Leishmania amazonensis. A: Tamaño de la lesión; B: Carga parasitaria. Los resultados se expresan como media ? desviación estándar. *: Diferencias significativas (p < 0,05) respecto al vehículo y el control.
La figura 2 muestra la actividad antileishmanial y citotoxicidad de los extractos, fracciones y subfracciones de semillas de B. orellana. Las fracciones BO-A y BO-B mostraron la mayor actividad con valores de CI50 de 12,9 μg/mL ± 4,1 μg/mL y 12,4 μg/mL ± 0,3 μg/mL, respectivamente. Las subfracciones BO-B1 y BO-B3 mantuvieron la misma actividad (p> 0,05) que la fracción original con valores de CI50 de 11,8 μg/mL ± 3,8 μg/mL y 13,6 μg/mL ± 4,7 μg/mL, respectivamente. El análisis de resonancia magnética nuclear (RMN) de la sub-fracción BO-B1 mostró las principales señales en la región alifática del espectro de 1H RMN que sugiere la presencia de compuestos alifáticos, en específico isómeros de la bixina y su análogo la norbicina.
Fig. 2 Actividad sobre amastigotes de Leishmania amazonensis e índice de selectividad de fracciones de semillas de Bixa orellana.
Los resultados de los análisis cualitativos y cuantitativos por cromatografía gaseosa acoplada a espectrometría de masas del aceite esencial de las semillas de B. orellana mostró un total de 73 compuestos. El ishwarano fue el componente principal, constituyendo 18,6 % del aceite, con menores cantidades de geranilgeraniol (9,1 %), biciclogermacreno (8,4 %), germacreno D (6,9 %) y δ-selineno (6,2 %). En los ensayos biológicos, el aceite de B. orellana mostró actividad contra amastigote de L. amazonensis, con una CI50 de 8,5 ± 0,8 μg/mL. La CC50 fue 7 veces mayor para las células hospederas en comparación con los parásitos. Por otra parte, se demostró la capacidad de este producto para controlar la enfermedad establecida en ratones BALB/c. El efecto sobre la progresión de la LC fue evidente por el tamaño de la lesión y la carga parasitaria, que mostraron una reducción significativa (p < 0,05) en ratones tratados con el aceite en comparación con los animales tratados con el vehículo o sin tratar (figura 3). Paralelamente, no se observaron muertes ni perdidas de peso superior al 10 %.
Fig. 3 Efecto del aceite esencial de semillas de Bixa orellana en ratones BALB/c infectados con Leishmania amazonensis. A: Tamaño de la lesión; B: Carga parasitaria. Los resultados se expresan como media ? desviación estándar. *: Diferencias significativas (p < 0,05) respecto al vehículo y el control.
El aceite esencial inhibió el consumo de oxígeno de promastigotes de Leishmania en concentraciones comparables (p > 0,05) con las que causaron inhibición del crecimiento (figura 4). En consecuencia, examinamos su impacto sobre los complejos de la cadena de transporte electrónico, donde se evidenció una inhibición del complejo I y II, con CI50 de 0,8 µg/mL ± 0,1 µg/mL y 41,9 µg/mL ± 2,3 µg/mL, respectivamente, los cuales fueron significativamente inferiores (p < 0,05) que los mostrados para la célula hospedera.
Fig. 4 Efecto del aceite esencial de semillas de Bixa orellana sobre la viabilidad y el consumo de oxígeno de promastigotes de Leishmania tarentolae. Los resultados se expresan como media ? desviación estándar.
A partir del aceite esencial se diseñaron y prepararon nanococleatos basados en fosfolípidos obtenidos de lecitina de soya, los cuales fueron evaluados en los diferentes modelos in vitro e in vivo. En relación al ensayo anti-amastigote, la formulación de nanococleato mantuvo la actividad leishmanicida in vitro (p > 0,05) y redujo la citotoxicidad (p < 0,05) con respecto al aceite solo, con valores de CI50 y CC50 de 15,4 μg/mL ± 3,3 μg/mL y 94,6 μg/mL ± 2,2 μg/mL, respectivamente. En el ensayo in vivo, el tratamiento de ratones con el aceite esencial puro y en su formulación (30 mg/kg/vía intralesional/cada 4 días/4 dosis total) no causó mortalidad ni pérdida de peso superior al 10 %. Sin embargo, los animales tratados con la formulación del nanococleato mostraron menor tamaño de la lesión (p < 0,05) que los controles y comparable (p > 0,05) a los efectos del Glucantime® (fármaco de referencia). Adicionalmente, la carga parasitaria del grupo tratado fue de Log10 = 3,33-3,93 parásito/g (figura 5).
Fig. 5. Efecto de nanococleatos con el aceite esencial de semillas de Bixa orellana en ratones BALB/c infectados con Leishmania amazonensis sobre el tamaño de la lesión. NC B. orellana: nanococleato con el aceite de Bixa, NC: Nanococleato vacío. *: Diferencias significativas (p < 0,05) respecto al vehículo y el control.
DISCUSIÓN
A pesar de los esfuerzos, la ausencia de vacunas antileishmaniales en un futuro próximo hace que el descubrimiento de quimioterapias efectivas es una necesidad urgente, especialmente para las regiones endémicas pobres. 8 En consecuencia, los productos a partir de fuentes naturales han llegado a representar una fuente ilimitada de entidades químicas con actividad antileishmanial. 9
De forma general, los productos evaluados en este trabajo a partir de las semillas de B. orellana cumplen los criterios internacionales recomendados para la selección de compuestos promisorios con actividad antileishmanial, 10,11 que incluyen: a) actividad inhibitoria in vitro con CI50 menor que 10 µg/mL; b) índice de selectividad mayor que 5; c) activo in vivo a dosis menor e igual 100 mg/kg por vía intraperitoneal y a dosis menor que 100 mg/kg por vía oral o intralesional, y d) no causar signos de toxicidad a las dosis terapéuticas.
Conclusiones
Por lo tanto, se describe por primera vez a nivel internacional la obtención de diferentes productos con actividad antileishmanial potencial de las semillas de B. orellana cultivada en Cuba. 12-17 El estudio bioguiado resultó en una fracción con actividad antileishmanial promisoria, al igual que el aceite esencial, del cual además se demostró su mecanismo de acción. En particular, se destacan los nanococleatos del aceite esencial como una nueva formulación para el tratamiento de la LC, enfermedad con diversas presentaciones clínicas que cuenta actualmente con limitadas opciones terapéuticas.
