Rev Cubana Med Trop 1996;48(2)

Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí"

Estudio taxométrico de especies del género Mycobacterium aisladas en Cuba

Dra. CARIDAD FERRA SALAZAR, Lic. LILIAN M. MEDEROS CUERVO, Téc. MAGDALENA FONSECA y Dr. JOSE A. VALDIVIA ALVAREZ

RESUMEN

Se estudiaron 40 cepas del género Mycobacterium correspondientes a 12 especies las cuales fueron sometidas a 62 pruebas microbiológicas y bioquímicas, consideradas cada una como un carácter. Como resultado de los coeficientes de similitud y su agrupación se obtuvieron 9 fenones, representados por: Fenón I (Mycobacteriu fortuitum), Fenón II (Complejo MAI), Fenón III (Mycobacterium phlei), Fenón IV (Mycobacterium triviale), Fenón V (Mycobacterium smegmatis), Fenón VI (Mycobacterium gordonae), Fenón VII (Mycobacterium szulgai), Fenón VIII (Complejo MAI) y Fenón IX (Mycobacterium scrofulaceum). El trabajo de identificación de las cepas fue coherente con la agrupación desde el punto de vista fenético.

Palabras clave: MYCOBACTERIUM/aislamiento & purificación; MYCOBACTERIUM/clasificación; CUBA.

INTRODUCCION

Las micobacterias presentan un gran interés microbiológico, bioquímico, médico e industrial, dada la importancia que tienen no sólo por el número de especies patógenas que presentan, sino por ser algunas capaces de transformar sustancias o intermediarios esteroidales.^1-7 A partir de los trabajos de Sneath, se adoptaron técnicas de taxometría para micobacterias,^7-10 obteniéndose información en cuanto a la agrupación de estos microorganismos. Esto constituyó el inicio de estudios posteriores que mostraron otros aspectos sobre algunos de los miembros de los grupos I, II y III de acuerdo con el esquema de clasificación propuesto por Tsukamura.²

Tsukamura y Mizumo, realizaron estudios taxométricos con micobacterias escotocromógenas de rápido crecimiento, y de 80 caracteres analizados emplearon 53 efectivos, pero no incluyeron en dicho trabajo a especies de lento crecimiento. Si a ello se suma que la descripción cada vez más detallada de especies del género Mycobacterium ha ocasionado que su número sobrepase de 50,^2,7 con un grupo de ellas identificadas de un modo relativamente fácil, pero otras de muy difícil identificación (Valdivia et al., 1975), resulta evidente realizar estudios lo más completos posible con los miembros de este género y a través de un enfoque taxométrico en cuanto a la agrupación de dichos especímenes; el propósito de este trabajo es contribuir a examinar las relaciones entre las especies de Mycobacterium aisladas en nuestro país.^5,8,9

MATERIAL Y METODO

Microorganismos. Para el presente estudio se emplearon 40 cepas del género Mycobacterium, obtenidas de pacientes sintomáticos respiratorios (SR + 14 días) procedentes de las 14 provincias del país y del Municipio Especial Isla de la Juventud, identificadas por el Laboratorio Nacional de Referencias de Micobacterias y Tuberculosis del Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí" (IPK).

Caracteres estudiados. Se estudiaron las pruebas microbiológicas, fisiológicas y bioquímicas de acuerdo con métodos internacionalmente establecidos,⁶ y para este género en específico^2,7,10 fue analizado un total de 62 caracteres, lo cual está dentro de lo establecido para agrupaciones microbianas.^8-10 En el anexo 1 se relacionan las pruebas a que fueron sometidas las cepas investigadas.

Unidades taxonómicas operacionales. Se consideró a cada cepa una Unidad Taxonómica Operacional (UTO). En el anexo 2 se presenta el listado de UTOs, el cual contiene un total de 12 especies del género Mycobacterium. El Complejo MAI está formado por las especies Mycobacterium avium y Mycobacterium intracellulare, de acuerdo con Tsukamura.²

Análisis de agrupación. Los datos obtenidos de cada UTO fueron codificados e introducidos en el programa Análisis de similitud-CLUSTER, elaborado por el Coyula y Sigarroa (Facultad de Biología de la Universidad de La Habana, 1992). Los valores de agrupación se establecieron desde 0,000 hasta 1,000 (0 a 100 %) con similitud, con un intervalo de 6 unidades (6 %) en la escala.

RESULTADOS

El estudio taxométrico realizado con las 40 UTOs demostró que los grupos se corresponden casi con exactitud, se pueden distinguir IX taxones, distribuidos de la manera siguiente: Fenón I (UTOs 1 y 2) representado por la especie Mycobacterium fortuitum, Fenón II (UTOs 26, 30, 32 y 40) constituido por el Complejo MAI (Mycobacterium avium-intracellulare), Fenón III (UTOs 28 y 39) por la especie Mycobacterium phlei, Fenón IV (UTOs 18, 20, 24, 27 y 36) por Mycobacterium triviale, Fenón V (UTOs 23 y 27) por Mycobacterium smegmatis, Fenón VI (UTOs 19, 29 y 38) por Mycobacterium gordonae, Fenón VII (UTOs 13, 21, 31 y 34) por Mycobacterium szulgai, Fenón VIII (UTOs 5, 7, 8, 10, 11, 15, 16, 22 y 25 por el Complejo MAI y Fenón IX (UTOs 6,9 y 12), por Mycobacterium scroifulaceum (figura).

Las UTOs 3, 4, 14 y 17 muestran una independencia relativa lo cual no es de extrañar al ser 4 especies diferentes (Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium marinum, Mycobacterium vaccae y Mycobacterium gastri), y que también es aplicable a la UTO 33 del Complejo MAI. Esta última UTO se aparta visiblemente del contexto de agrupación del Complejo MAI (Fenones II y VIII), pero aún así guarda cerca de un 68 % de similitud con el Fenón II.

La especie Mycobacterium scrofulaceum (UTOs 9,12 y 6), con el 91 % de similitud, muestra un agrupamiento homogéneo, así como Mycobacterium smegmatis (UTOs 23 y 27) con el 87 % de similitud; mientras que Mycobacterium szulgai presentó 2 variantes, una con el 95 % de similitud (UTOs 13 y 21) conectada a 60 % de similitud con otras agrupaciones, y otras con 87 % (UTOs 23 y 27), pero conectada al 79 % con la agrupación Mycobacterium triviale (figura). Por otra parte Mycobacterium triviale (UTOs 18, 20, 24, 27 y 36) con 92 % también muestra una agrupación homogénea, al igual que Mycobacterium phlei (UTOs 28 y 29) con el mismo nivel de similitud pero conectada al nivel 64 % con una de las 2 agrupaciones del Complejo MAI (UTOs 26, 30, 32 y 40) y Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium marinum (UTO 4), también mostró independencia pero conectada al 66 % con la otra agrupación del Complejo MAI (UTOs 5, 7, 8, 10, 11, 15, 16, 22 y 25) como puede apreciarse en la figura.

En el fenograma obtenido se puede observar (figura) que las UTOs de rápido crecimiento (1, 2, 3, 14, 28 y 39) se encuentran agrupadas a niveles de similitud superiores al 91 %, como fue el caso de las agrupaciones de UTOs 1 y 2, y UTOs 28 y 29. No así las UTOs 3 y 14 las cuales mostraron independencia, mientras que las otras 2 agrupaciones restantes corresponden a las especies normales Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium phlei.

DISCUSION

El Complejo MAI presentó 2 agrupaciones bastante separadas, pero conectadas al 44 % de similitud. No obstante, ambas agrupaciones constituyen fenones con el 91 % de similitud entre sus UTOs dentro del grupo. Esta diferencia puede explicarse al analizar que el Complejo MAI está constituido por 2 especies muy afines según Tsukamura, conocidas como Mycobacterium avium y Mycobacterium intracellulare. No fue posible discernir a cual grupo corresponde cada una de dichas especies a partir de los datos analizados, ya que el objetivo básico de este trabajo taxométrico estuvo dirigido hacia un estudio global del género Mycobacterium y no hacia 2 especies dentro del género estudiado. Sin embargo, se impone un estudio más específico para el Complejo MAI en particular.

A partir de un análisis global, puede apreciarse que los resultados de identificación de las UTOs bajo estudio se corresponden coherentemente con el punto de vista fenético, lo cual permitió identificar cada taxón de acuerdo con la especie nominal; estos microorganismos se han agrupado en algunos sistemas de clasificación, con un número relativamente pequeño de pruebas² y con selección de caracteres efectivos.¹⁰

CONCLUSIONES

1. El estudio taxométrico realizado por primera vez en nuestro país, de UTOs aisladas de las diferentes provincias y distribuidas en 12 especies pertenecientes al género Mycobacterium, permitió establecer 9 agrupaciones y asegurar a cada Fenón una especie nominada.

2. El complejo MAI presentó 2 fenones, lo cual se explica por la presencia en éste de 2 especies muy afines, se plantea la necesi dad de un estudio más profundo dirigido sólo a este complejo.

3. Los resultados encontrados en la identificación de las UTOs y sus relaciones con los fenones obtenidos mostraron coherencia desde el punto de vista fenético.

ANEXO 1. Pruebas microbiológicas y bioquímicas realizadas a 40 cepas (Unidades Taxonómicas Operacionales) del género Mycobacterium empleadas en el estudio taxométrico 1. Escotocromógeno

2. Crecimiento a 42 ^oC

3. Crecimiento a 45 ^oC

4. Nitratasa

5. Nitratasa (24h)

6. Benzamida

7. Urea

8. Isonicotinamida

9. Pirazinamida

10. Succinamida

11. Glutamato (Fte. C y N)

12. Succinato (Fte. C y N)

13. Tween 80 (1 %)

14. N₂NO₃ (0,1 %)

15. NH₂OHCL (250 mg/mL)

16. NH₂OHCL (500 mg/mL)

17. TCH (1 mg/mL)

18. Etambutol (5 mg/mL)

19. Rifampicina (25 mg/mL)

20. Cloranfenicol

21. Tetraciclina (Fte. N)

22. Colimicina

23. Carbenicilina

24. Cefaloridina

25. Amikacina

26. Penicilina

27. Meticillin

28. Eritromicina

29. Gentamicina

30. Kanamicina

31. Arilsulfatasa (3 d)

32. Niacina

33. Catalasa (45mm)

34. Hidrólisis del Tween (24h)

35. Hidrólisis del Tween (5d)

36. Hidrólisis del Tween (11d)

37. Cloruro de sodio 5 % (3d)

38. Cloruro de sodio 5 % (14d)

39. Cloruro de sodio 5 % (21d)

40. B-glucosidasa

41. Mac Conkey

42. Captación de Fe

43. Serina (Fte. C y N)

44. Glucosamida (Fte. C y N)

45. Acetamina (Fte. C y N)

46. Benzamida (Fte. C y N)

47. Benzoato (Fte. C y N)

48. Nitrato (Fte. N)

49. Nitrito (Fte. N)

50. Acetamina (Fte. N)

51. Benzamida (Fte. N)

52. Urea (Fte. N)

53. Pirazinamida (Fte. N)

54. Nicotinamida (Fte. N)

55. Isonicotinamida (Fte. N)

56. Succinamida (Fte. N)

57. Patogenicidad

58. Resistencia INH (1 mg/mL)

59. Crec. rápido (Ogawa)

60. Fuertemente BAAR

61. Débil o parcial BAAR

62. Resistencia INH (10 mg/mL)

 ANEXO 2. Relación de Unidades Taxonómicas Operacionales sometidas a estudio taxonométrico, pertenecientes al género Mycobacterium 1. M. fortuitum

2. M. fortuitum

3. M. smegmatis

4. M. marinum

5. Mycobacterium sp.

6. M. scrofulaceum

7. Complejo MAI

8. Complejo MAI

9. M. scrofulaceum

10. Complejo MAI

11. Complejo MAI

12. M. scrofulaceum

13. M. szulgai

14. M. vaccae

15. Complejo MAI

16. Complejo MAI

17. M. gastri

18. M. triviale

19. M. gordonae

20. M. triviale

21. M. szulgai

22. Complejo MAI.

23. M. smegmatis

24. M. triviale

25. Complejo MAI

26. Complejo MAI

27. M. triviale

28. M. phlei

29. Mycobacterium sp.

30. Complejo MAI

31. M. szulgai

32. Complejo MAI

33. Complejo MAI

34. M. szulgai

35. Complejo MAI

36. M. triviale

37. M. smegmatis

38. M. gordonae

39. M. phlei

40. Complejo MAI

SUMMARY

40 straing of the Mycobacterium genus corresponding to 12 species, which were subjected to 62 microbiological and biochemical tests, were studied. Each one was considered as a character. As a result of the similitude coefficient and their grouping, 9 phenomes represented by: Phenome I (Mycobacterium fortitum), Phenome II (MAI Complex), Phenome III (Mycobacterium phlei), Phenome IV (Mycobacterium triviale), Phenome V (Mycobacterium smegmatis), Phenome VI (Mycobacterium gordonae), Phenome VII (Mycobacterium szulgai), Phenome VIII (MAI Complex), and Phenome IX (Mycobacterium scrofulaceum), were obtained. The strain identification work was consistent with grouping from the phenotypic point of view.

Key words: MYCOBACTERIUM/isolation/purification; MYCOBACTERIUM/classification; CUBA.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Kappler W. Zur Taxonomie der Gattung Mycobacterium: II: Klassidizierung langsam waschsender Myokobakterien. Z Tuberk Erkrank Thoraxorgane 1968;129:321-8.
2. Tsukamura M. Intermediate between Mycobacterium tubercu-losis and Mycobacterium bovis. Microbiol Immunol 1984;28: 961-3.
3. Bojalil LF, Cerbon J, Trujillo A. Adansonian classification of Mycobacteria. J Gen Microbiol 1962;28:333.
4. Wayne LG. Classification and identification of Mycobacteria: III Species within group III. Am Rev Respir Dis 1966;93:919- -28.
5. Valdivia JA, Echemendía M. Estudio de 16 cepas de micobacterias cromogénicas y de crecimiento rápido. Rev Cubana Med Trop 1975;27:213-23.
6. Bonicke R. L'identification des mycobactéries a l'aide des méthodes biochemiques. Bull Un Int Tuber 1962;32:13.
7. Tsukamura M. Selected papers of studies on Mycobacterium, Rhodococcus and Nocardia taxonomy. Published by the Mycobacteriosis Research Laboratory of the National Chubu Hospital, Obu, Aichi, 474, Japan, 1984.
8. Sneath PHA. Some thoughts on bacterial classification. J Gen Microbiol 1957;17:184.
9. Sneath PHA. The application of computer to toxonomy. J Gen Microbiol 1957;17:201.
10. Tsukamura M, Mizuno S. Numerical analysis of relationship among rapidly growing, scotochromogenic mycobacteria. J Gen Microbiol 1977;98:511-7.

Recibido: 7 de agosto de 1995. Aprobado: 10 de abril de 1996.

Dra. Caridad Ferrá Salazar. Instituto de Medicina Tropical "Pedro Kourí". Apartado 601, Marianao 13, Ciudad de La Habana, Cuba.