Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

Actividad antimicrobiana del aceite esencial y crema de Cymbopogon citratus (DC). Stapf

MSc. Marta Guerra Ordóñez,1 DraC. Mayra Rodríguez Jorge,2 MSc. Gastón García Simón 3
y Lic. Celia Llerena Rangel4

Resumen

Se evaluó la actividad antimicrobiana in vitro del aceite esencial de Cymbopogon citratus (DC). Stapf (caña santa o hierba de limón), especie medicinal cultivada en Cuba, así como de una crema elaborada a partir del mismo. Se empleó el método de diluciones en medio líquido. Se determinó la concentración mínima inhibitoria y mínima microbicida frente a microorganismos de interés clínico humano. Considerando el uso propuesto a la formulación fue necesario conocer su potencial irritante. En este caso, se procedió según las Normas ISO descritas al efecto. La caracterización del aceite esencial reveló la presencia de citral como componente mayoritario. El aceite mostró una notable actividad antifúngica, superior a la que se observó con la crema, lo que justifica el uso tradicional de esta planta en Cuba. La formulación desarrollada resultó no irritante y se propuso usar como antidermatofítica. La especie microbiana más sensible resultó ser Trichophyton rubrum.

Palabras clave: Cymbopogon citratus (DC). Stapf, aceite esencial, crema; actividad antimicrobiana, concentración mínima inhibitoria.

Es enorme la difusión y popularidad de las terapias vegetales en el mundo. Se aconsejan ya no como alternativas en los servicios de salud, sino como primera intención para diversas afecciones, antes de pasar a otros medicamentos más agresivos.

La especie Cymbopogon citratus (DC). Stapf (Gramineae), popularmente conocida como caña santa, es una planta perenne que generalmente no florece, se encuentra muy disponible y se emplea, tradicionalmente, en el tratamiento de uñas encarnadas y otras afecciones cutáneas.

En esta planta se han realizado estudios agrotécnicos, de actividad antiinflamatoria, analgésica, antiasmática, diurética, antispasmódica y antimicrobiana, toxicidad y genotoxicidad, entre otros.

El aceite esencial es mundialmente conocido por sus múltiples usos. De las partes aéreas de la planta se han aislado sustancias no volátiles, entre las cuales se pueden mencionar flavonoides, ácido cafeico, fructuosa y sacarosa. Entre los componentes volátiles, terpenos como el geraniol y citronelol.1,2

En el presente trabajo los autores se propusieron evaluar la actividad antimicrobiana in vitro del aceite esencial de C. citratus y de una crema elaborada empleando el mismo como principio activo. Así mismo, evaluar el efecto tóxico irritante de la formulación en piel de conejo y estimar un posible riesgo para humanos.

Métodos

Formulaciones

El cultivo de la planta se llevó a cabo en los suelos ferralíticos rojos hidratados, aledaños a la planta de aceites esenciales de la empresa Suchel localizada en Alquízar, provincia La Habana.

Se empleó aceite esencial de Cymbopogon citratus (No. Herbario 4593), obtenido mediante destilación de las hojas por arrastre con vapor de agua y caracterizado según las normas establecidas por el Comité Estatal de Normalización de la República de Cuba (NC 35-20: Los aceites esenciales de frutas cítricas. Especificaciones de calidad. 1988; NC 35-03: Los aceites esenciales y otras sustancias aromáticas. Métodos de ensayo. Determinación de olor, color y sabor. 1982; NC 35-04. Determinación del índice de refracción. 1983; NC 35-05. Determinación de la densidad relativa. 1983, y NC 35-08. Determinación de solubilidad en alcohol etílico. 1982).

La crema fue formulada en el departamento de Formas Terminadas del CIDEM, con una base adecuada y 1,5 % de aceite esencial.

Microorganismos controles

Se empleó una batería de microorganismos controles integrada por 8 bacterias: Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Bacillus subtilis ATCC 7001, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 10033, Serratia sp, y Salmonella typhimurium. Se prepararon suspensiones que se incubaron hasta alcanzar la fase de desarrollo logarítmica, ajustándose la concentración al patrón 0,5 de la escala de Mc. Farland.

La batería de hongos estuvo compuesta por 4 hongos dermatofitos: Microsporum canis, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum y Epidermophyton floccosun y una levadura: Cándida albicans, todos aislamientos clínicos. Además se utilizó el hongo ambiental, Aspergillus niger ATCC 16404. Se trabajó con las suspensiones de esporas de los hongos. Con la levadura se procedió de forma similar como con las bacterias.

Actividad antimicrobiana

Para evaluar la actividad antimicrobiana in vitro se empleó el método de las diluciones en medio caldo triptona de soja para las bacterias y caldo sabouraud dextrosa para los hongos.3 Los tubos con las diluciones de la muestra se enfrentaron a los microorganismos controles. Se incubaron a 37 y 28 °C respectivamente y se determinó la concentración mínima inhibitoria del crecimiento (CMI) después de 24 h para las bacterias, 48 h para la levadura, 7 días para el hongo ambiental y 14 días para los hongos dermatofitos. En aquellos casos donde se observó inhibición, se tomaron alícuotas de 5 µL y se sembraron en medios específicos libres del agente antimicrobiano: agar Voges-Jhonson, agar Cled, agar Leche, agar Cetrimide, agar Mc Conkey o agar Sabouraud dextrosa, en dependencia del microorganismo. La más baja concentración de la muestra capaz de producir daño letal en la célula microbiana se definió como la concentración mínima bactericida o fungicida (CMB o CMF). El inóculo empleado fue de 105 unidades formadoras de colonias/mL (ufc/mL) para las bacterias y la levadura, y 104 ufc/ mL para los hongos. Se evaluó un rango de concentraciones entre 0,04 y 10 mg/mL y se empleó etanol como disolvente en el caso del aceite, por consiguiente, fue necesario realizar paralelamente una serie blanco. La crema fue hidrosoluble.

Irritabilidad dérmica

Se procedió según la norma ISO descrita al efecto (ISO Biological evaluation of medical devices Part 10. Test for irritation and standarization 1992, pág 5).

Fueron utilizados conejos albinos Nueva Zelandia machos, jóvenes adultos, híbridos de la línea F1, procedentes del Centro para la Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB), con una masa corporal de 1,8-2,5 kg. Fueron mantenidos durante el ensayo a temperatura y humedad controladas y un ciclo de luz-oscuridad de 12/12 h. Un día antes de la prueba, se tomaron varios animales al azar, se depilaron y rasuraron en la superficie de la región dorsal del lomo en un área de 10x18 cm2, distancia equidistante de la columna vertebral y se seleccionaron aquellos que mostraron la piel intacta. Para el ensayo se aplicaron 0,5 mL de la crema adherida a la piel con una cinta adhesiva hipoalérgica. Una vez transcurridas 4 h fueron retirados los parches y una vez marcado el sitio de aplicación, la muestra fue removida empleando agua común. Las observaciones de la zona de aplicación fueron realizadas a las 0,5, 1, 24, 48 y 72 h.

Las reacciones en la piel para el eritema y edema se establecieron según el sistema descrito para la evaluación de la irritación de la piel. Para determinar el índice de irritación primario (IIP) solo se tuvieron en cuenta las observaciones realizadas a las 24, 48 y 72 horas después de la remoción de los parches. Para dar los resultados de la prueba, se compararon los valores obtenidos con los del sistema de clasificación para irritabilidad dérmica.

Resultados

El aceite esencial de Cymbopogon citratus fue caracterizado de la forma siguiente: color, varía de amarillo a carmelita rojizo, con fuerte olor a limón, contenido de citral: 87,65%, sensible a la exposición de la luz y el aire, con el decursar del tiempo aumenta la densidad del mismo, las constantes de densidad relativa igual a 0,8861 e índice de refracción igual a 1,888.
Se obtuvo una formulación con olor a caña santa, color blanco ligeramente perlado, con buena apariencia visual y pH 7 cuando se dispersa 1 g de muestra en 25 mL de agua desionizada, que cumple con las especificaciones de calidad microbiológicas y químico-físicas requeridas para este tipo de producto.
Los resultados de la tabla 1 muestran el potencial antibacteriano del aceite y la crema evaluados, los valores de CMI oscilaron en un rango de 0,1 a 5,00 mg/mL. La acción del aceite resultó ser bactericida excepto para S. aureus para el cual fue bacteriostática y los microorganismos más sensibles fueron los Gram positivos. La crema no produjo un daño letal sobre las especies bacterianas usadas. La especie más sensible fue B. subtilis y P. aeruginosa .

Tabla1. Actividad antibacteriana del aceite esencial y crema de C. citratus

	Aceite		Crema
Especie bacteriana	CMI	CMB	CMI	CMB
	(mg/mL)		(mg/mL)
S. aureus ATCC 25923	0,3	1,25	2,50	BT
S. epidermidis ATCC 12228	0,63	0,63	1,25	2,50
B. subtilis ATCC 7001	0,31	0,31	0,31	1,25
P. aeruginosa ATCC 27853	ND	-	ND	-
E. coli ATCC 25922	2,50	2,50	1,25	BT
K. pneumoniae ATCC 10033	5,00	5,00	0,63	BT
Serratia sp.	2,50	2,50	2,50	BT
S. typhimurium	2,0	2,50	1,25	BT

BT: acción bacteriostática.
ND: no detectable a las concentraciones evaluadas.

En la tabla 2 se observa que el grupo de los hongos fue más sensible a las concentraciones del producto evaluado, particularmente los géneros Trichophyton y Epidermophyton. Los valores de CMI oscilaron entre 0,04 y 2,50 mg/mL. La acción resultó ser fungicida, salvo para la levadura C. albicans, para la cual fue fungistática. Aunque la crema mostró una menor actividad, se mantuvo la acción que sobre la célula microbiana ejerció el aceite esencial.

La actividad antimicrobiana desarrollada por el aceite esencial de C. citratus fue superior como antifúngica que como antibacteriana, los dermatofitos mostraron la mayor sensibilidad. Igual comportamiento se observó en la crema.

Tabla 2. Actividad antifúngica del aceite esencial y crema de C. citratus

	Aceite		Crema
Especie fúngica	CMI	CMF	CMI	CMF
	(mg/mL)		(mg/mL)
M. canis	0,63	0,63	1,25	1,25
T. rubrum	0,04	0,04	0,16	0,16
T. mentagrophytes	0,04	0,04	0,31	0,31
E. floccosum	0,04	0,04	0,08	0,08
A. niger ATCC 16404	1,25	1,25	2,50	2,50
C. albicans	0,16	0,31	2,50	5,00

No se encontraron signos de irritación sobre la piel del conejo. Se obtuvo un IIP con valor de cero.

Discusión

En algunas especies foráneas se ha logrado identificar el 89 % (34 compuestos) de los constituyentes de este aceite, como mayoritarios aparecen el geraniol (39,8 %) y el nerol (32 %).4 Roig registra en la especie cubana la presencia de geraniol, linalol, methilheptona, citronelol, limoneno, diterpenos y otras sustancias.5 En particular, la empleada por los autores posee un elevado contenido de citral.

Las bacterias Gram positivas fueron más sensibles, similar a lo informado por Lemos T, Hdez L y Almazora L.6-8 Sin embargo, algunos autores señalan lo contrario.9 Se conoce que diferencias genéticas entre algunas cepas de Cymbopogon ejercen una gran influencia en la actividad antibacteriana del aceite esencial.2 Esta acción se atribuye al citral, particularmente al geraniol (alfa citral) y al nerol (beta citral), incluso se plantea que el mirceno, aunque solo no muestra tal actividad, como la parte del aceite, incrementa la acción cuando se mezcla con los anteriores.10,11

Los resultados de la actividad antifúngica se corresponden con los de la literatura. Algunos ensayos in vitro indican que un 80 % de las cepas de dermatofitos probadas han sido inhibidas por el aceite esencial, incluso mencionan una cepa de M. canis entre las más resistentes.12-14 Otros, notifican la actividad en algunas especies del género de Aspergillus.12,15 Algunos informes hacen responsable de la actividad antifúngica a la mezcla de compuestos en el aceite y no al citral como un compuesto independiente.16 En otras especies como C. martini, al D-limoneno y al beta mirceno, entre otros.17

Como era de esperar se obtuvieron valores menores de CMI para el aceite respecto a la crema. Aunque la literatura sugiere 2,5 % del aceite de C. citratus, como concentración mínima para elaborar una crema con acción fungicida,18 en este trabajo fue suficiente el empleo de 1,5 % para lograr esta acción. Con seguridad habría que profundizar en la composición de ambos aceites esenciales, la cual es determinante en la acción biológica y que puede variar incluso dependiendo de la situación geográfica de la especie. 2,10,11,19

La crema elaborada a partir del aceite esencial de C. citratus resultó aprobada, se clasificó como no irritante dado el valor de IIP obtenido, lo que ratifica la factibilidad de su empleo en la práctica médica asistencial.

Se puede concluir que la evaluación del aceite esencial mostró el potencial antimicrobiano de esta especie medicinal y posibilitó desarrollar, a partir de una fuente natural abundante, una crema con actividad farmacológica definida. Como componente mayoritario del aceite se registró el citral.

La formulación de crema obtenida a partir de Cymbopogon citratus posee actividad antifúngica, particularmente interesante como antidermatofítica y no presenta efectos tóxicos irritantes sobre la piel de conejo. Los resultados del trabajo justifican el uso tradicional de esta planta medicinal en Cuba

Summary

The in vitro antimicrobial activity of the essential oil of Cymbopogon citratus (DC). Stapf (lemon grass), a medicinal species cultivated in Cuba, as well as of an ointment prepared from it, was evaluated. The dilution method in liquid medium was used. The minimum inhibitory and the minimum microbicidal concentration against microorganisms of human clinical interest was determined. Taking into account the use proposed for the formulation, it was necessary to know its irritating potential. In this case, it was proceeded according to the ISO Norms described to this end. The characterization of the essential oil reveals the presence of citral as the most abundant component. The oil showed a significant antifungal activity, higher than the observed with the ointment, which justify the traditional use of this plant in Cuba. The formulation developed proved to be non irritating and it was suggested to use it as antidermatophytic. The most sensitive microbial species was Trichophyton rubrum
.
Key words: Cymbopogon citratus (DC). Stapf, essential oil, ointment antimicrobial activity, minimum inhibitory concentration.

Referencias bibliográficas

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Recibido: 29 de abril de 2004. Aprobado: 12 de mayo de 2004.
MSc. Marta Guerra Ordóñez. Ave. 26 No. 1605 e / Boyeros y Puentes Grandes. Plaza. La Habana, Cuba. Telefono: 881 08 18. E- mail: [e-mail].

1 Máster en Ciencias. Licenciada en Microbiología. Investigadora Auxiliar.
2 Doctora en Ciencias. Licenciada en Microbiología. Investigadora Titular.
3 Máster en Ciencias. Licenciado en Biología.
4 Licenciada en Bioquímica.