Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay"

Obtención de la toxina tetánica a partir de hidrolizado de caseina de producción nacional

Isis García, Miriam Díaz, Rosa González, Zuleyka López y Rebeca González⁴

RESUMEN

La producción de toxoide tetánico se realiza a partir de la toxina tetánica destoxificada y purificada por métodos químicos. Un buen rendimiento de la toxina tetánica reviste gran importancia, pues éste es fundamental para obtener el número de dosis necesarias a un bajo costo. Se presentan los resultados obtenidos en la producción de toxina tetánica a partir de hidrolizado de caseína de producción nacional, mediante la realización de pruebas químicas, microbiológicas e inmunológicas, y se comprueba que el rendimiento es superior al obtenido con el hidrolizado de caseína de importación (triptona T, Oxoid).

Palabras clave: TOXOIDE TETANICO; TOXINA TETANICA; HIDROLIZADOS DE PROTEINAS; CASEINAS.

INTRODUCCION

El tétanos es una enfermedad producida por el Clostridium tetani,el cual excreta una neurotoxina capaz de causar la muerte en poco tiempo después de haber infectado un organismo a través de heridas punzantes, quemaduras o a través del cordón umbilical.¹ Este proceso de producción acelerada de esta potente y mortal toxina solamente se produce en condiciones de anaerobiosis y en presencia de sustancias ricas en proteínas; in vitro sólo se logra con la adición al medio del hidrolizado de caseína que le aporta al microorganismo la fuente de nitrógeno necesaria para que se sintetice esta toxina que está compuesta por 18 aminoácidos diferentes, lo cual confiere una estructura de proteína simple presentándose en 2 estados, el monómero tóxico y el dímero atóxico.²

El medio de cultivo también requiere de otros componentes importantes para el crecimiento del microorganismo, como son: fuentes de carbono, sales minerales, vitaminas y factores de crecimiento.³

El objetivo de este trabajo fue la producción de una toxina de mayores rendimientos a partir del hidrolizado de caseína de producción nacional para garantizar el toxoide tetánico, tanto para el consumo nacional como para la exportación, lográndose además la sustitución de importaciones.

MATERIAL Y METODO

Se prepararon 6 lotes de medios de cultivo en paralelo, 3 con hidrolizado de caseína de la firma Oxoid (Triptona T) y 3 con un mismo lote de hidrolizado de caseína de producción nacional (BACINA), los demás componentes del medio no tuvieron variaciones. Este medio fue preparado según la Norma de Empresa de Toxoide Tetánico Adsorbido, marzo 1985.

Para la producción de toxina se utilizó un inóculo preparado a partir de la cepa Clostridium tetani (Massachusetts), en medio de tioglicolato.

Se inocularon los 6 lotes con volúmenes iguales de un mismo inóculo, para evaluar los rendimientos obtenidos con las 2 variantes. Se incubaron 6 días a 34 " 0,5 EC, y se tomaron muestras antes de pasar los cultivos a temperatura de 4-8 EC durante 24 h para su posterior recogida.

Las pruebas de control⁴ fueron las siguientes:

- Comprobación de pH antes y después de esterilizado el medio.
- Microscopia al cultivo (empleando la tinción de Gram).
- Pruebas en caldo de corazón y las placas agar sangre en condiciones de aerobiosis, con el objetivo de comprobar pureza.
- Para la titulación del antígeno por la técnica de floculación de Ra-món se utilizó antitoxina tetánica de 100 UI/mL y solución salina fosfatada pH: 7,4 para la dilución de ésta. Las concentraciones de la antitoxina tetánica para la toxina experimental fueron 45, 50, 55, 65, 70 UI/mL y para las toxinas de referencia fueron 20, 25, 30, 35, 40, 45 UI/mL.
- Inmunodifusión radial para comprobar la titulación del antígeno:⁵ Se prepararon placas con gel de agarosa al 1 % en PBS pH: 7,4 y se realizaron pruebas de inmunodifusión radial, teniendo en cuenta los resultados de la floculación, se escogieron las mismas concentraciones para la antitoxina tetánica utilizadas en la floculación de Ramón, las cuales fueron colocadas en los pozuelos, alrededor del pozuelo de la muestra de cada uno de los lotes ensayados; en todos los casos se utilizó un patrón de referencia de toxina tetánica de producción nacional con un título que osciló de 25 a 30 Lf/mL.

Estas placas fueron coloreadas con amido negro y decoloradas con ácido acético al 5 %.

RESULTADOS

En la tabla 1 se presentan los resultados obtenidos después del cultivo; sólo hay diferencias significativas en cuanto a los valores de rendimiento obtenidos con los lotes procesados con hidrolizado de caseína de producción nacional. TABLA 1. Resultados de la prueba de control del proceso  

Pruebas	L-E 1/92	L-59/92	L-E 2/92	L-66/9	L-E 3/92	L-70/92
pH antes de esterilizar	7,75	7,80	7,70	7,70	7,70	7,70
pH después de esterilizar	6,90	7,00	7,03	7,02	7,02	6,90
Prueba de esterilidad	OK	OK	OK	OK	OK	OK
Microscopia	Bacilos característicos	Bacilos característicos	Bacilos característicos	Bacilos característicos	Bacilos característicos	Bacilos característicos
Floculación (Lf/mL)	65	25	65	25	60	30

E - 1/92: Lote experimental con hidrolizado de caseína (producción nacional).
L - 59/92: Lote de referencia que se realizó en paralelo con E 1/92 (hidrolizado de caseína, Oxoid).
E - 2/92: Lote experimental con hidrolizado de caseína (producción nacional).
L - 66/92: Lote de referencia que se realizó en paralelo con E 2/92 (hidrolizado de caseína, Oxoid).
E - 3/92: Lote experimental con hidrolizado de caseína (producción nacional).
L - 70/92: Lote de referencia que se realizó en paralelo con E 3/92 (hidrolizado de caseína, Oxoid).

En la tabla 2 observamos la composición de los 2 hidrolizados de caseína utilizados en este trabajo, donde hay diferencias en la concentración de algunos componentes.

TABLA 2. Composición de los hidrolizados de caseína

	Lote 0001	Lote 23643885
Indice Producción nacional	Firma	0xoid
Nitrógeno total, %	12,60	11,70
Nitrógeno amínico, %	5,52	3,90
Nitrógeno de proteosas totales, %	0,55	0,60
Nitrógeno de proteosas primarias, %	0,35	0,30
Nitrógeno de proteosas secundarias, %	0,20	0,30
Nitrógeno de peptonas, %	5,14	3,57
Humedad, %	8,09	3,30
Cloruros (NaCl), %	5,85	4,90

DISCUSION

Los rendimientos obtenidos con el hidrolizado de caseína de producción nacional fueron superiores a los obtenidos con el hidrolizado de caseína de importación.

En la inmunodifusión radial simple realizada a los lotes experimentales en comparación con el lote de toxina tetánico de referencia, se observa que no aparecen líneas de precipitación en el rango de concentraciones de la antitoxina de 45 a 70 UI/mL para el lote de referencia, lo que corrobora los valores obtenidos de floculación.

Para los 3 lotes experimentales obtuvimos líneas de precipitación en el rango de concentración de la antitoxina tetánica de 45 a 70 UI/mL, por lo que la concentración de la toxina tetánica está por encima de 45 Lf/mL mientras que para los lotes de referencia está por debajo de 45 Lf/mL, lo que demuestra el alto rendimiento obtenido en los lotes experimentales.

CONCLUSIONES

De acuerdo con los resultados obtenidos el hidrolizado de caseína de producción nacional utilizado en este trabajo da resultados superiores en el rendimiento de la toxina tetánica producida, por lo que se puede obtener un mayor número de dosis de toxoide tetánico con la misma cantidad de materia prima.

Se logró un rendimiento de toxina reproducible, pues los valores oscilaron entre 60 y 65 Lf/mL, lo que permite una producción estable.

Estas experiencias se deben repetir con otros lotes de hidrolizado de caseína de producción nacional, para llegar a la certeza de la sustitución del hidrolizado de la firma Oxoid.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la colaboración de los compañeros del Laboratorio de Medio de Cultivo del BIOCEN por facilitarnos el hidrolizado de caseína de producción nacional para nuestro estudio.

SUMMARY

The production of the tetanus toxoid is developed from the chemically detoxified and purified tetanus toxin. A good yielding of the tetanus toxin has a great importances, since it is fundamental to obtain the amount of necessary doses at a low cost. Here the authors present the results of the production of the tetanus toxin from the nationally produced casein hydrolysate, through chemical, microbiological, and immunological tests, and it is confirmed that the yield is higher than the one obtained with the imported casein hydrolysate (triptone T, Oxoid).

Key words: TETANUS TOXOID; TETANUS TOXIN; PROTEIN HYDROLYSATES; CASEINS.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Resik P. Tétanos. Series: Información Ciencias Médicas. 1978;13:5-12.
2. Samuel A, Salomon K, Thomas CM. Microbial toxins. New York: Academic Press, 1970;t1:24-6.
3. Well CL, Balish E. Clostridium tetani growth and production. Infect Inmun 1983;2:30-4.
4. Toxoide tetánico adsorbido. Proceso de producción. Normas de Empresa de Medicamento. NESP. 1758.070. La Habana, 1985.
5. Randi W, Banto M. The identification of diphteria. Tetanus and pertussis vaccines by single radial and double inmunodiffusion tecniques. 1985;13:31-4.

Recibido: 13 de abril de 1994. Aprobado: 14 de septiembre de 1995.

Lic. Isis García. Concepción 759 entre 15 y 16, Lawton, Ciudad de La Habana, Cuba.