Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia

Composición y propiedades antibacterianas del aceite esencial de Lippia alba (Mill.) n. e. Brown

Jorge A. Pino Alea,¹ Ariel G. Ortega Luis,² Arístides Rosado Pérez,³ Mayra Rodríguez Jorge y Ricardo Baluja³

¹ Investigador Tirular. Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia.
² Aspirante a Investigador. Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia.
³ Investigador Titular. Centro Nacional de Investigaciones Científicas.
⁴ Investigadora Auxiliar. Centro de Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos.

RESUMEN

Con ayuda de la cromatografía gaseosa capilar, espectrometría de masas y espectroscopia infrarroja, se estudiaron los componentes volátiles del aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N. E. Br., lográndose identificar 43 compuestos, de los cuales 20 se informan por primera vez. Se encontró un alto contenido de carvona que hace suponer que se está en presencia de un nuevo quimiotipo. Se evaluó la actividad antibacteriana del aceite esencial sobre una bacteria integrada por 9 especies de bacterias, mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias y con el empleo del método de las diluciones seriadas dobles en medio líquido. El aceite presentó actividad antibacteriana, siendo mayor en general, sobre los gérmenes grampositivos, con valores de las concentraciones mínimas inhibitorias entre 0,3 y 0,63 mg/mL.

Palabras clave: ACEITES VOLATILES; PLANTAS MEDICINALES; MEDICAMENTO HOMEOPATICO.

INTRODUCCION

La flora cubana presenta una diversidad tal que justifica el interés de su estudio sistemático, con el objeto de detectar la presencia y abundancia de productos que puedan ser interesantes como materias primas de valor en diversos campos industriales o de aplicación farmacéutica.

Es importante destacar dentro de esta vegetación, la presencia de numerosas plantas aromáticas, endémicas o introducidas, que se han adaptado a nuestra geografía y clima. Algunas de ellas se utilizan como fuente de aceites esenciales, pero, sin embargo, existen otras aún no explotadas, cuyos extractos o aceites podrían ocasionar la creación de nuevos productos para sustituir importaciones o generar nuevos renglones exportables.

La Lippia alba (Mill.) N.E. Br. es una de las plantas que puede ser de interés fitoterapéutico, conocida en Cuba como quitadolor y anís de España, posee propiedades sudoríficas, antiespasmódicas, estomáquicas y emenagogas,¹ y además, se conoce que su aceite esencial posee actividad antimicrobiana.²

El presente trabajo tiene como objetivo iniciar el estudio de los componentes volátiles del aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E. Br., así como evaluar de forma preliminar su actividad antibacteriana.

MATERIAL Y METODO

Las plantas se cultivaron en la Estación Experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig", en Güira de Melena. El área del proyecto agrotécnico fue de 470 m², con un aproximado de 924 plantas y una distancia de 90 cm entre surco y 60 cm entre plantas. El doctor Víctor Fuentes Fiallo, del INIFAT, realizó la identificación botánica de la especie. Una muestra de referencia (Roig 4611) se conserva en el herbario de la Estación Experimental de Plantas Medicinales.

Las plantas se cosecharon en septiembre de 1993 (8 meses de plantadas) y se secaron en estufa a 40 o C con recirculación de aire y un tiempo promedio de 10 h. El material fue molido en un molino de martillo de laboratorio, con el cuidado de evitar su calentamiento excesivo, hasta un tamaño de partículas promedio de 0,31 mm.

El aceite esencial se obtuvo por hidrodestilación con un aparato del tipo Clevenger a partir de 600 g de material molido. El tiempo de destilación fue de 3 h. El aceite esencial se secó sobre sulfato de sodio anhidro y se guardó en frío hasta su análisis.

Al aceite esencial se le determinaron las características físicas y químicas establecidas.³ Además se efectuó una separación a partir de 0,5 g de muestra por cromatografía de columna con 25 g de silicagel 60 Extrapura (70 a 230 mallas) de actividad 2 a 3. La columna se mantuvo a 20 o C durante el proceso y se recogieron 2 fracciones: una apolar (hidrocarburos) con 150 mL de n-pentano y otra polar (compuestos oxigenados) con 350 mL de éter etílico. A ambas fracciones se les eliminó el solvente por destilación fraccionada y se pesaron.

El análisis por cromatografía de gases (CG) se efectuó en un equipo Pye Unicam 204 con detector de ionización por llama de hidrógeno. Se utilizó una columna capilar de cuarzo (25 m x 0,32 mm) del tipo BP-1 (SGE, Australia). Las condiciones de operación fueron: temperatura del horno, 70 o C (4 min) hasta 220 o C (15 min) a una velocidad de 4 o C/min; gas portador, hidrógeno; temperatura del inyec- tor, 220 o C; temperatura del detector, 250 o C.

El análisis por cromatografía gaseosa-espectrometría de masas (CG- -EM) se realizó en un equipo Jeol JMS-DX 300 con una columna capilar de cuarzo (25 m x 0,25 mm) del tipo SPB-1 (Supelco, EE.UU). Las condiciones de operación fueron: temperatura del horno, 60 o C (4 min) hasta 220 o C (20 min) a una velocidad de 4 o C/min; gas portador, helio; temperatura de la fuente iónica, 250 o C; energía de ionización, 70 eV.

La identificación de los componentes se llevó a cabo con ayuda de una IBM-AT mediante una base de datos denominada IDENT, creada con el programa FOXPRO (Fox Holdings, EE.UU). La base de datos contiene índices de Kovats para 2 fases cromatográficas distintas, así como el peso molecular y los 6 iones más abundantes del espectro de masas de sustancias volátiles.

El análisis cuantitativo se realizó por normalización interna, mediante medición automatizada de la señal del cromatograma iónico reconstruido.

El análisis por espectroscopia infrarroja se efectuó en un equipo modelo PU-9512 de la Phillips-Unicam acoplado a una IBM-PC por medio del programa BIRD que permite la obtención, procesamiento y almacenamiento del espectro, así como su comparación con espectros registrados anteriormente. Se registró en cubeta de KBr de 0,2 mm de espesor o como película.

El estudio de la actividad antibacteriana se llevó a cabo mediante la determinación de las concentraciones mínimas inhibitorias (MCI) con el empleo del método de las diluciones seriadas dobles en medio líquido. Se utilizó una bateria de microorganismos controles integrada por: Pesudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 13883, Serratia marcescens ATCC 8100, Enterobacter aerogenes ATCC 13088, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Bacillus subtilis ATCC 7001 y Streptococcus faecalis ATCC 19433. A partir de cada una de ellas se prepararon suspensiones en medio triptona-soya-caldo y se incubaron a 37 o C hasta alcanzar la fase de desarrollo logarítmica, ajustándoseles la concentración por comparación visual al patrón 0,5 de la escala de Mc Farland. El inóculo utilizado fue de 10⁵ ufc/mL. Los tubos que contenían las diluciones del aceite esencial, después de expuestos a las bacterias controles, fueron incubados a 37 o C durante 24 h, determinándose entonces el valor de la MCI para cada microorganismo, la cual es definida como la menor concentración del agente antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento; en aquellos casos donde se observó inhibición se tomaron alícuotas y se sembraron en medios agarizados libres del agente, para ello se empleó el agar Mc Conkey No. 3 agar Voger-Johnson o agar leche en dependencia del microorganismo en cuestión. La menor concentración de las sustancias capaz de inhibir totalmente el crecimiento microbiano fue definida como la concentración bactericida mínima (MBC). Dada la insolubilidad del aceite en agua, se utilizó etanol 95 % como solvente, por lo que fue necesario realizar paralelamente con la serie problema una serie blanco a fin de conocer el efecto del solvente. En ningún caso se encontró efecto del solvente sobre las células microbianas. En todos los casos se evaluó un rango de concentraciones desde 0,04 hasta 10 mg/mL. Los controles positivos empleados fueron la gentamicina y el ketoconazol.

ANALISIS DE LOS RESULTADOS

El rendimiento en aceite esencial de la muestra evaluada fue de 2,2 % (v/p b.s.). El aceite esencial presentó una densidad específica (25 o C) de 0,9218 g/mL, índice de refracción (25 o C) de 1,4977, rotación óptica (25 o C) de + 100,5 o , contenido de carbonilos de 43,75 % y solubilidad en etanol 80 % (20 o C) de 1:1 (v/v).

El fraccionamiento por cromatografía de columna indicó que el aceite está constituido por 20,7 % de hidrocarburos y 79,3 % de compuestos oxigenados.

Por la importancia de esta última fracción se procedió a su estudio por espectroscopia IR. Los espectros del aceite esencial y de la fracción oxigenada tienen un alto grado de similitud y coinciden con el espectro de la carvona. Esto se pudo comprobar mediante la comparación de los espectros de los 3 productos (figura). Las bandas principales de la carvona, así como su asignación, se detallan en la tabla 1.

TABLA 1. Bandas típicas del espectro IR de la carvona

Frecuencia (cm^-1)	Absorbancia	Vibración
801	0,288 (D)	Deformación CH del HC=C
894	1,001 (F)	Deformación CH del H2C=C
1 109	0,791 (F)	Esqueleto de C-C=O
1 366	0,891 (F)	Deformación de CH3
1 434	0,838 (F)	Deformación de CH2
1 640	0,839 (F)	Valencia del C=CH2
1 675	0,939 (MF)	Valencia del C=O
2 893	0,729 (M)	Valencia de
2 927	0,879 (M)	los grupos
2 961	0,814 (M)	CH, CH2
2 973	0,818 (M)	y CH3
3 087	0,360 (D)	Valencia del CH de H2C=C
3 340	0,341 (D)	Primer sobretono del C=O

Los resultados cualitativos y cuantitativos para el aceite esencial analizado se resumen en la tabla 2. En total, se identificaron 43 compuestos, agrupados en 22 hidrocarburos terpénicos y 21 constituyentes oxigenados. De ellos, 20 compuestos no habían sido informados anteriormente en esta especie.

TABLA 2. Componentes volátiles identificados en el aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E. Br.

Pico No.	Componente	Espectro de masas (m/z)	%
HIDROCARBUROS
5	a -pineno	93, 92, 91, 77	0,04
6	canfeno	93, 121, 79, 67	0,05
7	sabineno	93, 77, 91, 79	0,01
7	b -pineno	93, 69, 41, 79	0,01
8	mirceno	93, 41, 69, 79	0,26
9	p-cimeno	119, 91, 134, 65	0,07
10	limoneno	68, 93, 67, 79	5,76
11	(E)-b -ocimeno	93, 79, 81, 92	0,16
12	terpinoleno	93, 121, 136, 79	0,02
30	d -elemeno*	121, 93, 136, 41	0,05
31	a -ilangeno*	161, 105, 119, 91	0,16
32	b -bourboneno	123, 81, 161, 41	3,01
32	b -elemeno	81, 93, 68, 107	3,02
34	b -cariofileno	93, 69, 41, 133	1,21
35	a -amorfeno*	161, 105, 91, 119	0,92
36	g -muuroleno	161, 105, 91, 81	1,10
36	(E)-b -farneseno*	69, 41, 93, 133	1,31
39	b -guaieno*	105, 91, 119, 161	9,84
41	biciclogermacreno*	93, 41, 121, 161	0,35
41	g -cadineno	161, 41, 69, 93	0,42
43	d -cadineno	161, 134, 119, 105	0,77
44	cadina-1,4-dieno*	119, 105, 161, 204	0,09
COMPONENTES OXIGENADOS
3	(Z)-3-hexenol	41, 67, 55, 82	0,04
12	linalol	93, 71, 41, 55	1,34
13	fenchol*	81, 80, 43, 69	0,07
14	terpinen-4-ol	71, 43, 69, 93	0,06
16	borneol	95, 41, 55, 110	1,31
17	dihidrocarvona	67, 41, 95, 68	0,82
17	isodihidrocarvona*	67, 95, 41, 68	0,50
17	(Z)-piperitol*	84, 93, 41, 79	0,02
19	cuminaldehído*	105, 148, 133, 77	0,02
19	carvona	82, 54, 39, 93	40,00
19	piperitona*	110, 95, 82, 41	3,62
23	timol*	135, 150, 91, 107	0,41
24	carvacrol*	135, 150, 91, 107	1,02
26	piperitenona*	150, 107, 135, 39	8,26
27	eugenol	164, 149, 103, 55	0,13
35	b -ionona*	177, 43, 91, 57	0,09
45	(E)-nerolidol	69, 41, 93, 43	0,19
50	isoelemicina*	193, 208, 81, 161	0,15
52	epicubenol*	119, 105, 41, 161	0,36
53	d -cadinol*	161, 95, 43, 81	0,85
60	cariofila-3,8(13)-5b -ol*	81, 41, 105, 123	0,32

* Compuestos no informados anteriormente.

Desde el punto de vista cuantitativo, se resalta la presencia mayoritaria de la carvona (pico 19). A partir de estos resultados, parece obvio que la especie evaluada posee diferencias químicas infraespecíficas que permiten afirmar que está en presencia de un nuevo quimiotipo, del tipo carvona, diferente a los cuatro anteriormente informados:^2,4-8 dihidrocarvona, piperitona-óxido de piperitenona, citral y citral-1,8-cineol.

Los resultados de la actividad antibacteriana del aceite de Lippia alba sobre gérmenes de interés clínico humano (tabla 3) pusieron de manifiesto que de las especies estudiadas sólo la Pseudomonas aeruginosa mostró resistencia a las diferentes concentraciones evaluadas de dicho agente. El resto de las bacterias, específicamente las grampositivas y S. marcescens, presentaron susceptibilidad frente al aceite esencial, con valores de MCL entre 0,31 y 0,63 mg/mL. El S. aureus fue de todas las bacterias la que resultó inhibida con la menor dosis del agente antibacteriano.

TABLA 3. Actividad antibacteriana del aceite esencial

Especies	Clasificación	MCI*	MBC*
E. coli ATCC 25992	Bacilos gramnegativos	2,50	2,50
K. pneumoniae ATCC 13883	Bacilos gramnegativos	2,50	2,50
S. marcescens ATCC 8100	Bacilos gramnegativos	0,63	1,25
E. aerogenes ATCC 13088	Bacilos gramnegativos	2,50	2,50
Ps. aeruginosas ATCC 27853	Bacilos gramnegativos	ND	ND
S. aureus ATCC 25923	Cocos grampositivos	0,31	0,63
S. epidermis ATCC 12228	Cocos grampositivos	0,63	1,25
B. subtilis ATCC 7001	Bacilos grampositvos	0,63	1,25
St. faecalis ATCC 19433	Cocos grampositivos	0,63	1,25

*Concentración expresada en mg/mL.

ND: No detectable a las concentraciones evaluadas.

Las concentraciones mínimas bactericidas fueron en la mayoría de los casos diferentes en una dilución de las mínimas inhibitorias, lo cual evidencia que la inhibición del crecimiento microbiano fue debida a una sección bacteriostática ocasionada por el aceite sobre las células. En el caso de la E. coli, K. pneumoniae y E. aerogenes se observó un efecto bactericida, siendo para ella los valores MBC similares a los MCI.

CONCLUSIONES

Se identificaron 43 compuestos volátiles del aceite esencial de Lippia alba (Mill.) N.E.Br., de los cuales 20 se informan por primera vez. El alto contenido de carvona hace suponer de que se está en presencia de un nuevo quimiotipo.

Este aceite esencial presenta actividad antibacteriana, siendo mayor, en general, sobre los gérmenes grampositivos, con valores de las MCI entre 0,31 y 0,63 mg/mL.

SUMMARY

With the aid of capillary gas chromatography, mass spectrometry, and infrared spectroscopy, the volatile components of Lippia alba (Mill.) N.E. Br. essential oil, were studied, achieving the identification of 43 compounds, 20 of them reported for the first time. A high contents of carvone (carvona) was found, and this suggests the presence of a new chemotype. The antibacterial activity of the essential oil on a bacteria integrated by 9 bacterial species, was valuated by determining the inhibitory minimal concentrations, and with the use of the method of double dilution series in a liquid medium. The oil presented antibacterial activity, generally being higher on gram-positive germs, with values of the inhibitory minimal concentrations between 0,3 and 0,63 mg/L.

Key words: OILS, VOLATILE; PLANTS, MEDICINAL; HOMEOPATHIC DRUG.

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Recibido: 4 de mayo de 1995. Aprobado: 23 de mayo de 1995.

Dr. Jorge A. Pino Alea. Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia. Carretera del Guatao Km 1/2, Ciudad de La Habana 19200, Cuba.