Empresa de Productos Biológico "Carlos J. Finlay"

Conservación de soluciones de referencia de ácido úrico

María Victoria Licea Tornes,¹ Mario Badía Llerena² y Concepción Borges Legrá³ 1 Licenciada en Química. Aspirante a Investigadora.
2 Licenciado en Química. Investigador Auxiliar.
3 Técnica en Producción de Biológicos.

RESUMEN

Se estudiaron diferentes agentes preservantes para seleccionar el que proporcionara a las soluciones de referencia de ácido úrico un mayor tiempo de vida útil. Se investigó la estabilidad de las soluciones en un rango de concentración de 2 a 10 mg/dL (199-595 Fmol/L), manteniéndolas en diferentes condiciones de almacenamiento: 2-8 EC, temperatura ambiente y 37 EC. Los mejores resultados se observaron al emplear timerosal como preservo, ya que el coeficiente de correlación obtenido mediante un análisis de regresión lineal fue mayor que 0,9980 en el transcurso de 1 año para las soluciones almacenadas de 2 a 8 ^EC.

Descriptores DeCS: ACIDO URICO; ESTANDARES DE REFERENCIA; SOLUCIONES; ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS; TIMEROSAL; ESTREPTOMICINA; JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; ESPECTROFOTOMETRIA.

Los productos finales del metabolismo de degradación de las purinas varían considerablemente en las diferentes especies animales. En el hombre el producto final de esta degradación es el ácido úrico (urato).¹ En el suero el urato se presenta en 2 formas, libre y unido a la albúmina; la afinidad del urato por la albúmina es distinta en el suero normal que en el patológico.² Tanto el ácido libre como sus sales son insolubles en agua, lo cual provoca que en algunos individuos el ácido precipite y cristalice en la orina formando cálculos renales y lesionando el riñón.

La gota es la principal afección referible al metabolismo de las purinas, patológicamente se caracteriza por ataques inflamatorios que afectan las articulaciones y van acompañadas por depósitos de uratos.² Habitualmente la concentración de ácido úrico varía de un individuo a otro en dependencia de diversos factores, tales como: sexo, origen étnico, constitución genética y embarazo. Los valores normales oscilan entre 119 y 464 mmol/L.³

Con vistas a garantizar la confiabilidad del trabajo en el laboratorio clínico, es conveniente disponer de soluciones de referencia preparadas de manera centralizada mediante un método que asegure no sólo la posibilidad de obtener buena linealidad en la curva de calibración, sino también una correspondencia entre los valores de concentración declarados y los que realmente tienen las soluciones, por esta razón se necesita encontrar una formulación que garantice la invariabilidad de las concentraciones de las sustancias que se analizan en el transcurso del tiempo, en un plazo lo más largo posible.

En el caso del ácido úrico se han empleado numerosos solventes, tales como: trishidroximetilaminometano (TRIS), trietanolamina, glicina-NaOH y carbonato de litio,^4,5 con el propósito de alargar la vida útil de las soluciones de referencia. Estos solventes no garantizan por sí solos la estabilidad de estas soluciones, por lo que se hace imprescindible la utilización de preservos.

Los preservos se clasifican en 2 grandes grupos, los que evitan transformaciones químicas y los que impiden proliferación de microorganismos. Para su utilización se debe tener en cuenta sus posibles efectos sobre la investigación a realizar.

La solución de referencia que se produce actualmente en la Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay" contiene en su formulación formaldehído como agente preservante, el cual confiere estabilidad a las soluciones de ácido úrico cuando la determinación se realiza por el método de Henry, Sobel y Kim (reducción del fosfotungstato de sodio),⁶ pero presenta franca incompatibilidad con el método enzimático, ya que inhibe la actividad de la uricasa,⁷ por lo que el objetivo de nuestro trabajo fue la utilización de otros preservos que reúnan las condiciones adecuadas para prolongar la vida útil de estas soluciones y evitar incompatibilidad en los métodos de determinación empleados.

MÉTODOS

Preparación de las soluciones de referencia en presencia de diferentes preservos

Para realizar el estudio de estabilidad de las soluciones de referencia de ácido úrico se emplearon 14 antibióticos, timerosal y azida sódica (anexo). La concentración de ácido úrico empleada en todos los casos fue 357 mmol/L (valor medio). Se utilizó como solvente una solución de carbonato de litio 0,6 g/L y todas las soluciones fueron neutralizadas después de añadir el agente preservante (tabla 1). La concentración del antibiótico no es la misma en todos los casos, ya que se tuvo en cuenta su actividad antimicrobiana. Se realizó un estudio de recuperación, tomando como referencia un Precimat de ácido úrico de la firma comercial Boehringer Mannheim.

Preparación de los juegos de soluciones de referencia

Como resultado del estudio de recu-peración, se seleccionaron como preservos el timerosal y la estreptomicina. Se prepararon 2 juegos de soluciones de referencia utilizando estos preservos, por separado, en un intervalo de concentración de 199 a 595 mmol/L. Las soluciones se ajustaron a pH neutro en ambos casos, con soluciones de hidróxido de sodio 0,1 mol/L y ácido clorhídrico 0,1 mol/L.

Se realizaron las curvas de calibración y se comprobó su linealidad mediante un análisis de regresión lineal simple. Las pendientes se compararon mediante la prueba de Duncan.

Métodos para evaluar la concentración de ácido úrico

• Método espectrofotométrico indirecto mediante una reacción química: el ácido úrico reduce al fosfotungstato de sodio, en medio alcalino, originando la formación de un cromógeno azul que se determina espectrofotométricamente a 640 nm.

• Método espectrofotométrico indirecto mediante una reacción enzimática: se basa en la oxidación de ácido úrico a alantoína, con uricasa y la formación de H₂O₂, el cual reacciona en presencia de peroxidasa, originando el 2,4 diclorofenolsulfonato y 4 aminofenazona para formar un compuesto rojo, el cual se determina espectrofotométricamente a 510 nm.

Estudio de estabilidad

Los juegos de soluciones de referencia preparados fueron sometidos a 3 condiciones de almacenamiento para estudiar la estabilidad del analito: 2 a 8 EC, temperatura ambiente y 37 EC.

RESULTADOS

Los resultados obtenidos de la evaluación de la linealidad analítica de los juegos de soluciones de referencia de ácido úrico, preparados en presencia de timerosal y estreptomicina, se observan en la tabla 1. TABLA 1. Linealidad analítica

Soluciones de referencia	Método	r	m
Acido úrico-estreptomicina	I	0,99637	3,252E-03
Acido úrico-timerosal	I	0,99897	3,461E-03
Acido úrico-estreptomicina	II	0,99885	7,350E-03
Acido úrico-timerosal	II	0,99792	7,293E-03

r: coeficiente de regresión lineal; m: pendiente; I: método espectrofotométrico indirecto (reacción química); II: método espectrofotométrico directo.

En la tabla 2 se observa la concentración de ácido úrico obtenida al emplear el método espectrofotométrico indirecto por vía enzimática.

TABLA 2. Comportamiento de las soluciones de ácido úrico

Cau esperada (Fmol/L)	Cau obtenida con estreptomicina	Cau obtenida con timerosal
119	120	124
238	240	232
357	367	350
476	488	471
595	601	601

C_au: concentración de ácido úrico.

El estudio de estabilidad acelerado del juego de soluciones de referencia de ácido úrico preservadas con timerosal, durante 1 año, se muestra en la tabla 3.

TABLA 3. Estudio de estabilidad  

	Tiempo (días)	r	m@10^!3	Intervalo de confianza de la m
Tempertura de 2-8EC
	0	0,9989	3,46	1,25E-04
	90	0,9987	3,41	3,16E-04
	180	0,9991	3,35	1,17E-04
	270	0,9988	3,22	1,50E-04
	365	0,9989	3,28	1,27E-04
Temperatura ambiente
	90	0,9975	3,39	1,96E-04
	180	0,9996	3,03	7,19E-05
	270	0,9936	2,10	2,39E-04
Temperatura 37 EC
	90	0,9839	2,24	3,32E-04

DISCUSIÓN

La concentración de ácido úrico no experimentó deterioro en las soluciones que contenían timerosal y estreptomicina. Se alcanzó el 99 % de recuperación del analito al cabo de los 3 meses, pero no fue así para el resto de los antibióticos y la azida sódica.

Esta estabilidad se atribuye no sólo a la acción antimicrobiana, sino también a la posibilidad de que pueda existir una interacción química entre el preservo y el ácido úrico.

Según los resultados del análisis de regresión, se obtuvieron coeficientes de regresión lineal mayores que 0,996 y un intercepto no significativo en todos los casos. Esto indica que la acción de los preservos utilizados no perjudica la linealidad analítica de la curva de calibración.

En la tabla 2 se observan los resultados al evaluar la concentración de ácido úrico obtenida, mediante el método espectrofotométrico por vía enzimática, los cuales no difieren significativamente del valor esperado, lo que nos demuestra que la presencia de timerosal o estreptomicina no afecta la determinación enzimática.

En las soluciones preparadas en presencia de estreptomicina ocurrió una contaminación micótica al cabo de los 30 d. Esto se corroboró mediante una prueba microbiológica. Las soluciones preservadas con timerosal, exhiben buena linealidad en las 3 condiciones de almacenamiento, notándose que al cabo de 1 año sólo se mantiene la linealidad analítica en las soluciones almacenadas de 2 a 8 EC. Esto se comprobó mediante un análisis de regresión lineal. Además se realizó la prueba de rango múltiples de Duncan para comparar las pendientes, no observándose diferencias significativas para los niveles de significación 0,05 y 0,01.

En conclusión las soluciones de referencia de ácido úrico preparadas con timerosal o estreptomicina como agente preservante, pueden ser evaluadas por el método espectrofotométrico indirecto mediante una reacción química o enzimática.

La información obtenida, en cuanto a la estabilización de las soluciones de referencia del urato, resulta de vital importancia para el desarrollo de la tecnología de producción de éstas.

Las sustancias antibacterianas probadas no garantizan por sí solas la protección de las soluciones que se someten a riesgo de contaminación micótica en el trabajo diario, por lo que se recomienda estudiar la posibilidad de combinar los agentes antibacterianos con agentes antimicóticos.

Anexo. Concentración de preservos empleada

Agente preservante	Concentración empleada  (g/L)
Estreptomicina	0,50
Eritromicina	0,56
Gentamicina	0,80
Ampicillin	0,39
Cloranfenicol	1,00
Kanamicina	1,44
Carbenicilina	4,33
Cefalotina	1,07
Tetraciclina	1,03
Meticillin	0,18
Amikacina	1,00
Colimicin	0,33
Penicilina	0,10
Novobiocina	1,00
Timerosal	0,20
Azida sódica	4,00

SUMMARY

Different preservative agents were studied in order to select the one which may provide a greater time of useful life to reference solutions of uric acid. Stability of solutions in a rank of concentrations from 2 to 10 mg/dL (199-595F mol/L) was investigated keeping them under different conditions of storage: 2-8 EC, room temperature and 37 EC. The best results were observed when using thimerosal as a preservative agent since the correlation coeficient obtained by the analysis of linear regression was found to be higher than 0.9980 during 1 year for the solutions stored at 2-8 EC.

Subject headings: URIC ACID; REFERENCE STANDARDS; SOLUTIONS; DRUG STABILITY; THIMEROSAL; STREPTOMYCIN; REAGENTS KITS, DIAGNOSTIC; SPECTROPHOTOMETRY.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Lehninger AL. Bioquímica. 2 ed. Barcelona: Editorial Omega, 1980:750.
2. Davidsohn I, Henry J. Diagnóstico clínico para el laboratorio. 6 ed. Madrid: Jims, 1982:610-2.
3. Wiener Lab. Manual de reactivos para el laboratorio clínico. Buenos Aires: Editorial Rosario, 1995:1-2.
4. Lindsey AS, Sharma RK. Some observations on the stability of uric acid in alkaline solutions. Anal Lett 1981;14(B10):799-811.
5. Mc Culloch JC. A solubility problem in the preparation of uric acid standars. Clin Chem 1971;84:269-71.
6. Henry RJ, Cannon DC, Winkelman JW. Química clínica: principios y técnicas. 2 ed. Barcelona: Jims, 1980; t 1:529.
7. Tsan ZL. Thymol preservative interferes with quantitation of serum uric acid by direct acid ferric reduction method. Clin Chem 1981;27(6): 1144-5.

Recibido: 31 de enero de 1997. Aprobado: 3 de marzo de 1997.

Lic. María Victoria Licea Tornes. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J Finlay". Infanta No. 1162, municipio Centro Habana, La Habana 10300, Cuba.