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Revista Cubana de Farmacia

Print version ISSN 0034-7515On-line version ISSN 1561-2988

Rev Cubana Farm vol.33 no.2 Ciudad de la Habana May-Aug. 1999

 

Artículos Originales

Instituto Finlay. Centro de Investigación – Producción de vacunas y sueros

Pasteurización de soluciones de inmunoglobulinas de uso intravenoso. 1. Uso de azúcares como estabilizantes

Armando Cádiz Lahens,1 Janhna Hernández Machín,2 Lázaro Joó Sánchez,3 Aniel Moya Torres4 y Amador Camero Santiesteban5

Resumen

Se realizó la pasteurización a partir de la unión de los sobrenadantes II de 4 lotes de plasma normal sometidos a fraccionamiento alcohólico, con la utilización de los estabilizantes siguientes: sorbitol, sacarosa y dextrosa al 30 %. El grado de agregación molecular se determinó por cromatografía en gel. Entre los estabilizantes utilizados, el sorbitol presentó los mejores resultados, con formación de polímeros que fluctúan entre el 10 – 15 %, valores que se corresponden con los reportados por otros autores. Estos polímeros según los requerimientos de la OMS deben ser eliminados por otros procedimientos para obtener valores inferiores al 10 %.

Descriptores DeCS: CALOR; ESTERILIZACION/métodos; INMU-NOGLOBULINAS INTRAVENOSAS/aislamientos & purificación; IGG/ /aislamiento & purificación.

 

La sangre constituye un producto biológico, cuyo origen es sumamente variable, ésta es la razón fundamental por la cual puede ser causante de serios accidentes, entre ellos la transmisión de enfermedades virales de alto riesgo, como: hepatitis B, hepatitis C, SIDA, citomegalovirus (CMV) y parvovirus, entre otros.1

Aunque la selección del donante y los procedimientos de examen del material de partida, desempeñan una función importante en la reducción de la contaminación con virus del pool de plasma, es aceptado que estas medidas sólo ofrecen una limitada seguridad al producto por:

  • Limitada sensibilidad de las pruebas. (Falsos negativos).
  • Período de ventana: tiempo del individuo infectado e infeccioso sin marcadores detectables. (Ejemplo: SIDA).
  • Riesgo intrínseco del error del examen masivo.
  • Virus que aún no poseen un método de pesquisaje adaptado a las donaciones de sangre.

El estudio de los lotes finales también presenta limitaciones, fundamentalmente por la limitada sensibilidad de los ensayos para detectar virus en tan bajas concentraciones, altas concentraciones del principio activo, presencia de anticuerpos contra el virus específico, además del error que introduce el propio muestreo de grandes lotes de productos.2

Por estas razones, los procedimientos de inactivación y/o remoción de virus desempeñan una función esencial en el establecimiento de la seguridad de un producto biológico, los cuales brindan una alta probabilidad de que cualquier virus desconocido no sospechado y peligroso sea removido o inactivado.3-6

El calentamiento en solución (60 °C durante 10 h) es un método que en adición al fraccionamiento etanólico del plasma muestra resultados seguros en la inactivación viral.7,8 Este calentamiento ha sido combinado con el uso de estabilizantes para evitar la agregación de la molécula de IgG durante el calentamiento.9-12

En el presente trabajo utilizamos algunos de estos estabilizantes con vistas a estudiar la agregación durante el calentamiento en soluciones de IgG.
 

Métodos

A partir de la unión de los sobrenadantes II (Sob. II) de 4 lotes de plasma normal sometidos a fraccionamiento alcohólico,13 se efectuaron los pro-cedimientos siguientes:

Pasteurización en un rango de pH de 4,0 a 7,0 con intervalos de 0,5 unidades y la utilización de sorbitol 30 %, sacarosa 30 % y dextrosa 30 % como estabilizantes.

El calentamiento se realizó en un baño de agua (Precisterms - 138, Selecta), de temperatura controlada a 60 °C durante las 10 h establecidas.

Las muestras pasteurizadas fueron sometidas a cromatografía en gel, para determinar el porcentaje de polímeros y dímeros originados por el calentamiento.

Por la alta concentración del Sob. II (26,27 mg/mL), realizamos a las muestras una dilución 1:4, para desarrollar corridas dentro del rango de concentraciones establecidas para este método y la sensibilidad seleccionada, y así obtener una mayor resolución en el cromatograma.

La matriz utilizada fue el Sephacril S - -300, columna Pharmacia XK 16/70, sensibilidad 0,2, velocidad del papel 0,01 mm/min, flujo 30 mLh-1 y como buffer de corrida solución salina tamponada con fosfato (0,1 M) o solución tamponada con acetato (0,1 M) en dependencia del rango de pH de las muestras.

El porcentaje de polímeros, dímeros y monómeros fue determinado por el cálculo del peso del área bajo la curva.
 

Resultados

Conforme a las regulaciones de la OMS, el pool de Sob. II utilizado como material de partida para este trabajo consta del 3,8 % de polímeros, el 5,12 % de dímeros y el 91 % de monómeros.

La formación de polímeros de IgG durante la pasteurización con sorbitol fue determinada por cromatografía en gel; obsérvese la mayor proporción de polímeros a pH 4,5 y la menor a pH 6,5 (tabla 1).

Tabla 1. Pasteurización del intacglobin con sorbitol como estabilizante
Muestras 
Porcentaje de
polímeros
Porcentaje de dímeros
Porcentaje de monómeros
pH 4,0
20,9
39,1
40,0
pH 4,5
32,1
-
67,9
pH 5,0
18,0
-
82,0
pH 5,5
13,0
12,0
75,0
pH 6,0
18,0
-
82,0
pH 6,5
12,0
11,0
77,0
pH 7,0
12,8
6,7
80,5
* Gelificado. ______: Ausencia.

Empleando sacarosa como estabilizante los mayores porcentajes de polímeros se obtuvieron a pH 4,0 y 4,5, con valores relativamente constantes y menores para pH de 5,0 a 7,0 (tabla 2).

Tabla 2. Pasteurización del intacglobin con sacarosa como estabilizante
Muestras 
Porcentaje de polímeros
Porcentaje de dímeros
Porcentaje de monómeros
pH 4,0
72,8
-
27,2
pH 4,5
43,9
-
56,1
pH 5,0
18,0
4,0
78,0
pH 5,5
18,0
2,0
80,0
pH 6,0
18,0
12,0
70,0
pH 6,5
20,0
7,0
73,0
pH 7,0
18,0
3,0
79,0
 * Gelificado. _____: Ausencia.

En este estudio el tercer estabilizante utilizado fue la dextrosa, con el mayor porcentaje de polímeros a pH 4,0 y el menor a pH 5,5 (tabla 3).

Tabla 3. Pasteurización del intacglobin con dextrosa como estabilizante
Muestras 
Porcentaje de polímeros
Porcentaje de dímeros
Porcentaje de monómeros
pH 4,0
45,6
14,2
40,2
pH 4,5
23,0
13,9
63,1
pH 5,0
28,3
-
71,7
pH 5,5
15,0
20,0
65,0
pH 6,0
16,8
11,2
72,0
pH 6,5
16,0
3,4
80,6
pH 7,0
16,0
20,3
63,3
 * Gelificado ______: Ausencia.

Los patrones sin estabilizantes también muestran el mayor porcentaje de polímeros a pH 4,0 y el menor a pH 5,0; obsérvese la gelificación total de ellos a partir de pH 5,5 (tabla 4).

Tabla 4. Pasteurización del intacglobin sin estabilizante
Muestras 
Porcentaje de polímeros
Porcentaje de dímeros
Porcentaje de monómeros
pH 4,0
87,6
-
12,4
pH 4,5
69,8
-
30,2
pH 5,0
58,0
-
42,0
pH 5,5
*
*
*
pH 6,0
*
*
*
pH 6,5
*
*
*
pH 7,0
*
*
*
*Gelificado _____: Ausencia.
 

Discusión

Las inmunoglobulinas de uso intramuscular presentan una larga vida y segura historia de uso sin transmitir virus.14 Sin embargo, en la última década se han presentado algunas comunicaciones de transmisión de hepatitis C en inmunoglobulinas intravenosas (IGIV).5-18

En la búsqueda de métodos complementarios al fraccionamiento alcohólico del plasma para la obtención de IGIV cada vez más seguros, realizamos la pasteurización de preparaciones de IgG a diferentes pH y estabilizantes, y estudiamos el efecto de estos preservantes en la estabilidad térmica de la IgG humana y la formación de agregados durante el período de calentamiento, teniendo en consideración los requerimientos de la OMS.19

Es conocido desde la década de los 60 que los agregados de IgG pueden activar el sistema complemento y causar reacciones adversas;20 el material de partida utilizado en estos estudios poseía el 3,8 % de polímeros, por lo cual teníamos solamente un margen de aproximadamente el 6 % de incremento de esta cifra.

Los 3 estabilizantes estudiados protegieron al producto pero no con la misma efectividad; se observaron diferencias en el porcentaje de polímeros, dímeros y monómeros, y en el grado de turbidez, con marcada diferencia en el control sin estabilizante (tablas 1-4).

Para todas las variantes de estabilizantes utilizadas, el porcentaje de polímeros aumenta con la disminución de pH; de manera que los mayores porcentajes se encuentran a pH 4,0 y 4,5, ya que a estos pH existe una gran disociación de la IgG, lo que la hace más susceptible al calor y por tanto a la desnaturalización. A medida que aumentamos el pH, dentro de las condiciones igualmente ácidas, se produce una disminución en la formación de polímeros.

Una vez analizadas todas las variantes de estabilizantes y pH aplicadas a las muestras, la realizada con sorbitol a pH 5,0 resultó ser la mejor, con el 12 % de polímeros (tabla 1).

En otros trabajos donde se utiliza este estabilizante, se reporta que el sorbitol previene la desnaturalización masiva, pero que la formación del 10 % de polímeros de elevado peso molecular (PM) no puede ser evitado, cuando el calentamiento es por 10 h a 60 24 °C. Estas experiencias corroboran las nuestras ya que llegan a iguales resultados en condiciones muy similares. El éxito del sorbitol como estabilizante puede deberse al mecanismo por el cual éste induce estabilidad térmica, que se explica por una interacción no favorable del cosolvente con la superficie proteica. El efecto que conlleva el polialcohol se basa en una hidratación preferencial en la superficie proteica con la exclusión de las moléculas aditivas provenientes de la interfase. Como la conformación enrollada tiene menos área expuesta al solvente que la conformación no enrollada, la consecuencia de la interacción no favorable con el aditivo, es la estabilización de la estructura nativa de la proteína. El sorbitol previene la agregación masiva después del desenrollamiento.12

Los resultados muestran que aun cuando el sorbitol parece ser un agente estabilizante efectivo, por el largo tiempo de calentamiento que requiere el proceso de pasteurización no es suficiente para prevenir la agregación y la solución de inmunoglobulinas pasteurizada requeriría de un procedimiento adicional para la eliminación de polímeros.
 

Summary

Pasteurization from the union of II supernatants of 4 batches of normal plasma subjected to alcoholic fractionation was carried out using following stabilizers: sorbitol, sacarose and 30 % dextrose. The level of molecular aggregation wass determined by gel- filtration chromatography. Sorbitol exhibited the best results with polymer formation ranging from 10 - 15 %; the values match those reported by other authors. According to WHO requirements, these polymers should be eliminated through other procedures for obtaining values under 10 %.

Subject headings: HEAT; ESTERILIZATION/methods; IMMUNOGLOBULINS INTRAVENOUS/isolation & purification; IGG isolation & purification.
 

Referencias Bibliográficas

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Recibido: 20 de enero de 1999. Aprobado: 26 de febrero de 1999.
Lic. Armando Cádiz Lahens. Instituto Finlay. Centro de Investigación-Producción de Vacunas y Sueros. Ave 27 No. 19805, municipio La Lisa, AP 16017, Código 11600, Ciudad de La Habana, Cuba.

1 Licenciado en Biología. Investigador Titular.
2 Licenciada en Microbiología.
3 Licenciado en Biología y Bioquímica.
4 Licenciado en Bioquímica. Aspirante a Investigador.
5 Licenciado en Biología.

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