Empresa de Producción de Biológicos "Carlos J. Finlay"

Reacción de inmunoglobulinas de distintas especies con el factor reumatoideo en inmunoensayos de látex aglutinación

Leida Díaz Machado,1 Isabel Giraldino2 y Lourdes Dávalos Pantoja2

Resumen

El factor reumatoideo es considerado el responsable fundamental de las interferencias (falsos +) producidas en los inmunoensayos, ya que reacciona inespecíficamente con diferentes epitopos de las moléculas de inmunoglobulina G (IgG). El objetivo de este trabajo fue estudiar la IgG de 7 especies (humana, conejo, burro, carnero, caballo, gallina y ratón, de esta última las subclases IgG1,IgG2a,IgG2b). Se utilizaron partículas de poliestireno de 0,8 µ que fueron recubiertas con 3 concentraciones (0,02, 0,01, 0,05 mg/m2 ) de cada Ig. La reactividad se evaluó frente a 6 concentraciones de factor reumatoideo (1 000, 500, 250, 64, 16, 8 UI ). Se evidenció en todos los casos que la reactividad disminuye a medida que baja la concentración de recubrimiento y que el orden de reactividad decreciente fue: humana, conejo, burro, carnero y caballo, y para las IgG murinas fue IgG1, IgG2a e IgG2b. La IgG de gallina no reaccionó frente al factor reumatoideo, la cual constituyó la especie ideal en la elaboración de reactivos de látex para evitar las interferencias del factor reumatoideo.

DeCS: FACTOR REUMATOIDE; INMUNOGLOBULINA; INMUNOENSAYO; MICROESFERAS.

El factor reumatoideo (FR) se define como autoanticuerpos dirigidos contra determinantes antigénicos del fragmento Fc de las inmunoglobulinas G (IgG) de muchas especies.1 Este se encuentra elevado fundamentalmente en pacientes con artritis reumatoidea, aunque también se eleva en otras enfermedades reumáticas, infecciones, enfermedades hepáticas, así como en sujetos sanos.2-5

El FR es considerado el responsable fundamental de las interferencias (falsos positivos) producidas en los inmunoensayos, ya que generalmente reacciona inespecíficamente con diferentes epítopos de las moléculas de IgG.6,7

La interferencia del FR puede ser reducida o eliminada con una cuidadosa selección de los anticuerpos que comienza con la elección de la especie adecuada para obtenerlos.

La elección de una u otra especie es analizada desde la óptica costo-beneficio: características del inmunógeno, sensibilidad que requiere el diagnosticador, instalaciones, mantenimiento, nutrición requerida, así como resistencia a enfermedades y volumen de suero capaces de aportar.

Incorporar a este análisis las interferencias ocasionadas por el FR sería de gran importancia. El conocimiento de la intensidad de estas interacciones con las IgGs de cada especie animal constituye un elemento importante en su selección para la producción de anticuerpos, ya que la utilización de los menos reactivos permitirá elevar la especificidad de los diagnosticadores.

Las interferencias ocasionadas por el FR fueron la razón fundamental que motivó estudiar el sistema de aglutinación de partículas de látex cuando estas se recubren con inmunoglobulinas de diferentes especies animales.

El objetivo de este trabajo fue estudiar las IgG de 7 especies (humana, conejo, burro, carnero, caballo, gallina y ratón; de esta última las subclases IgG1, IgG2a, IgG2b ).

Métodos

Se sensibilizaron partículas de látex de poliestireno de 0,8 µ con anticuerpo de diferentes especies. En el caso del carnero, conejo y humana se utilizó la fracción gammaglobulina obtenida por precipitación con SO4 (NH2 )4, y en el ratón se emplearon anticuerpos monoclonales del tipo IgG1, IgG 2a, IgG 2b.

El recubrimiento de las partículas se realizó con 3 concentraciones (0,02; 0,01; 0,005 mg/m2) utilizando 200, 100 y 50 µg/mL de cada inmunoglobulinas. La sensibilización se realizó 2 h a temperatura ambiente con agitación. Los reactivos fueron evaluados eliminando las inmunoglobulinas libres por centrifugación y sin centrifugación frente a 6 concentraciones de FR (1 000, 500, 250, 64, 16, 8 UI ).

El ensayo se realizó en una lámina portaobjeto al mezclar 25 µL del suero FR con 25 µL del reactivo de látex. Se agitó manualmente y pasados 5 min se procedió a la lectura según el criterio siguiente:

Aparición de la aglutinación          Codificación
Hasta 1 min                                      4+
Hasta 2 min                                      3+
Hasta 3 min                                      2+
Más de 3 min                                   1+
Más de 5 min                                     -

Resultados

Los resultados indican que las especies humana, conejo, burro, carnero y caballo son reactivas en el rango de concentraciones de FR estudiadas. La especie más reactiva resultó ser la humana. La segunda especie altamente reactiva es el conejo; y las inmunoglobulinas de carnero y caballo reaccionan con menor intensidad (tabla 1 ).

TABLA 1. Reactividad del FR con partículas de látex recubiertas con inmunoglobulinas de diferentes especies animales

Recubrimiento(mg/m2)		0,02		0,01		0,005
		C	S/C	C	S/C	C	S/C
HUMANA	UI FR
	1 000	4+	3+	3+	2+	2+	1+
	500	4+	3+	3+	2+	2+	1+
	250	4+	3+	3+	2+	1+	1+
	64	4+	3+	3+	2+	1+	-
	16	3+	2+	2+	1+	1+	-
	8	2+	1+	2+	1+	-	-
CONEJO	1 000	3+	3+	3+	2+	1+	-
	500	3+	3+	2+	1+	1+	-
	250	3+	2+	2+	1+	-	-
	64	3+	2+	1+	1+	-	-
	16	2+	1+	1+	-	-	-
	8	1+	-	-	-	-	-
BURRO	1 000	3+	3+	3+	2+	-	-
	500	3+	2+	2+	1+	-	-
	250	2+	1+	1+	-	-	-
	64	1+	1+	-	-	-	-
	16	1+	-	-	-	-	-
	8	-	-	-	-	-	-
CARNERO	1 000	3+	3+	2+	2+	-	-
	500	3+	2+	2+	1+	-	-
	250	3+	1+	2+	1+	-	-
	64	2+	1+	1+	-	-	-
	16	1+	-	-	-	-	-
	8	-	-	-	-	-	-
CABALLO	1 000	3+	3+	3+	2+	-	-
	500	3+	2+	2+	1+	-	-
	250	2+	1+	1+	-	-	-
	64	1+	1+	-	-	-	-
	16	1+	-	-	-	-	-
	8	-	-	-	-	-	-

          C: centrifugado; S/C: sin centrifugar.

Los anticuerpos monoclonales a pesar de sus innumerables ventajas, no están exentos de las reacciones inespecíficas que causa el FR. Se determinó que las distintas clases de IgG monoclonales murinas muestran grados de reactividad diferentes frente al FR y en general son menos reactivas que las IgG policlonales (tabla 2).

TABLA 2. Estudio de la reactividad del FR con partículas de látex recubiertas con diferentes subclases de monoclonales murinos

Recubrimiento(mg/m2)		0,02		0,01		0,005
		C	S/C	C	S/C	C	S/C
IgG2a	UI FR
	1 000	2+	2+	2+	2+	-	-
	500	2+	2+	2+	1+	-	-
	250	2+	1+	2+	1+	-	-
	64	2+	1+	1+	1+	-	-
	16	1+	-	-	-	-	-
	8	-	-	-	-	-	-
IgG1	1 000	2+	1+	2+	1+	-	-
	500	2+	1+	1+	-	-	-
	250	1+	1+	-	-	-	-
	64	1+	-	-	-	-	-
	16	-	-	-	-	-	-
	8	-	-	-	-	-	-
IgG2b	1 000	2+	1+	1+	1+	-	-
	500	2+	1+	1+	1+	-	-
	250	1+	-	-	-	-	-
	64	-	-	-	-	-	-
	16	-	-	-	-	-	-
	8	-	-	-	-	-	-

          C: centrifugado; S/C: sin centrifugar.

La gallina fue la única especie de las cinco estudiadas que no reaccionó frente a las diferentes concentraciones utilizadas (tabla 1).

En el análisis del comportamiento de la interferencia teniendo en cuenta la cantidad que se absorbe físicamente sobre la partícula de látex y la concentración de las inmunoglobulinas en solución, quedó evidenciado que la reactividad disminuye con la disminución de la concentración de recubrimiento así como con la presencia de anticuerpos libres.

Discusión

Existe un fuerte compromiso conformacional entre el FR y las inmunoglobulinas que justifican las diferencias en la reactividad que se encontraron entre las inmunoglobulinas de las distintas especies estudiadas.8

La reacción de aglutinación inespecífica debido al FR que ocurre en los sistemas de látex se basa fundamentalmente en la modificación que sufren las inmunoglobulinas durante el proceso de adsorción a las microesferas de látex.

Las inmunoglobulinas de las especies animales estudiadas demostraron diferencias en la reactividad frente al FR cuando se encontraban recubriendo partículas de látex de poliestireno. El orden decreciente de reactividad fue: humana, conejo, burro, carnero, caballo, monoclonal murino IgG2a, IgG1, IgG2b. La gallina resultó la única especie que no reaccionó con el FR.9

Los resultados demostraron que a mayor concentración de recubrimiento de inmunoglobulinas, mayor es la reactividad frente al FR para todas las especies reactivas ensayadas, esto pudiera tener su origen en el propio proceso de adsorción, donde debido a todos los fenómenos químico-físicos que se desarrollan en él, las moléculas de IgG sufren cambios estructurales que al parecer son los responsables de la mejor exposición del sitio entre el dominio CH2-CH3 de la región Fc que resulta el epítopo crucial en la unión al Fc.

En el caso de la menor concentración de recubrimiento (0,005 mg/m2 ) para las especies: burro, carnero y caballo y las 3 subclases de IgG monoclonales no es suficiente la cantidad de IgG modificada sobre la superficie para que al unirse al FR se produzca una reacción de aglutinación. En cambio, para las especies conejo y mayormente la humana a pesar de haber poca cantidad de IgG modificada sobre la superficie, estas inmunoglobulinas resultan más reactivas.

Después de la adsorción siempre quedará anticuerpo libre en solución; mientras mayor sea la concentración a que se expone la partícula de látex, mayor será la cantidad absorbida, pero mayor será también la concentración de anticuerpos libres.

Una vez eliminada el sobrenadante encontramos que se potenció la reacción al FR. Esto pudiera deberse a que existe un porcentaje de IgG que se agregue espontáneamente y el FR reacciona preferentemente con la IgG modificada en solución.

Estos resultados indican la importancia de ajustar la sensibilidad de los reactivos con la menor concentración de recubrimiento posible, y muestran las especies más apropiadas en la obtención de anticuerpos para la elaboración de inmunoensayos señalando a las inmunoglobulinas de gallina como la especie ideal para la elaboración de reactivos de látex y evitar así las interferencias que causa el FR.

Summary

The rheumatoid factor is considered as the fundamental responsible for the interferences (false +) produced in the immunoassays, since it reacts unspecifically with different epitopes of the molecules of immunoglobulin G (IgG). This paper was aimed at studying the IgG from 7 species (human, rabbit, donkey, lamb, horse, hen and mouse; and of the latter the subclasses IgG1, IgG2a, IgG2b). Particles of polystyrene of 0.8 m that were covered with 3 concentrations (0.02, 0.01. 0.05 mg/m2) of every 1 g were used. Reactivity was evaluated against 6 concentrations of rheumatoid factor (1 000, 500, 250, 64, 16, 8 UI). In all cases, it was demonstrated that the reactivity decreases as the covering concentration diminishes and that the decreasing reactivity order was: human, rabbit, donkey, lamb, and horse; whereas for the murine IgG it was IgG1, IgG2a and IgG2b. The hen IgG did not react against the rheumatoid factor. It was the ideal species to make latex reagents to avoid the interferences of the rheumatoid factor.

Subject headings: RHEUMATOID FACTOR; IMMUNOGLOBULINS; IMMUNOASSAY; MICROSPHERES.

Referencias Bibliográficas

1. Song CS. Antibodies to the subunits of insulin receptor from eggs of immunized hens. J Immunol 1985;135:3354-9.
   
2. Torrigiani G, Roitt IM. Antiglobulin factor in serum from patients with rheumatoid arthritis and normal subjets. Quantitative estimation in different immmunoglobulin classes. Ann Rheum Dis 1967; 26:334-40.
   
3. Markusse HM. Rheumatoid factor isotypes in serum and salivary fluid of patients with primary Söjgren`s syndrome. Clin Immunol Immunopathol 1993;66:26-32.
   
4. March RE. Sensitive ELISA Measurement of IgA, IgG and IgM antiglibulins in rheumatic and other diseases and a comparison of their specificity in rheumatic arthritis and infections mononucleosis. Scand J Rheumatol 1987;16:445-9.
   
5. Silvestris F, Goodwin JS, Williams RC. IgM, IgA and IgG rheumatoid factor in patients with rheumatoid arthritis and normal donors. Clin Rheumatol 1985;4:392-8.
   
6. Hamilton RG. Rheumatoid factor interference in immunological methods. Monogr-Allergy 1989;26:27-44.
   
7. Gosslin JP. A decade of development in immunoassay methodology. Clin Chem 1990; 36(8):1408-27.
   
8. Hamako J. Binding of humans IgM from rheumatoid factor of IgG to 12 animal species. Comp Biochem Mol Biol 1995;112(4):683-8.
   
9. Schade R, Behn I, Erhrad M. Chicken Egg Yolk Antibodies, Production and Application: IgY-Technology . Springer Lab Manuals. Berlin: Springer-Verlag; 2001; Chapter 6. p.214-5.
   

Recibido: 30 de abril de 2003. Aprobado: 29 de mayo de 2003.
Lic. Leida Díaz Machado. Empresa de Producción de Biológicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162 entre Manglar y Línea del Ferrocarril, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, CP 10300, Cuba.

1Licenciada en Bioquímica.
2Master en Bioquímica de las Proteínas.