Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay"

Evaluación de anticuerpos antiproteína C reactiva obtenidos en gallina en un ensayo de látex aglutinación

Leida Díaz Machado,1 Isabel Giraldino Falero,2 Kiyen Soria Choy,3 Elsa la Rosa Noda3 y Fermín Vega Disiuz1

Resumen

El uso de aves en la producción de anticuerpos para el inmunodiagnóstico resultaría ventajoso ya que a diferencia de los obtenidos en mamíferos, estos no reaccionan con el factor reumatoideo. Se desarrolló un reactivo de látex con anticuerpos antiproteína C reactiva producidos en aves y se realizó un estudio de su comportamiento mediante la evaluación de muestras utilizando paralelamente reactivos comerciales de referencia. Se comprobó que la no concordancia con algunas muestras entre los reactivos evaluados era producto de las interferencias del factor reumatoideo. El reactivo elaborado con anticuerpos de aves resultó sensible y específico a la antiproteína C reactiva eliminando los falsos positivos. Se demostró que además de las ventajas económicas que ofrece el uso de aves, resulta una especie verdaderamente atractiva en la obtención de anticuerpos para el inmunodiagnóstico.

DeCS: PROTEINA C-REACTIVA; FACTOR REUMATOIDE; FORMACION DE ANTICUERPOS; AVES DE CORRAL; JUEGOS DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO.

La proteína C reactiva (PCR) se sintetiza muy rápidamente y en cantidades importantes por el hígado durante los procesos infecciosos. El aumento muy precoz de esta proteína es el primer signo biológico de una inflamación. De una misma forma su vuelta a la normalidad constituye un argumento fiable para afirmar la eficacia de un tratamiento antiinfeccioso y antiinflamatorio. Contar con un reactivo confiable específico y sensible para la detección de esta proteína de fase aguda es de gran valor diagnóstico.

El desarrollo de reactivos para el diagnóstico basado en la técnica de aglutinación de látex en lámina ha tenido un importante crecimiento en los últimos años, pues se ajusta a los requerimientos actuales. Estos constituyen reactivos para el diagnóstico más confiables, rápidos y económicos.

Los animales más comúnmente usados en la producción de anticuerpos para el inmunodiagnóstico son los mamíferos. Sin embargo, en este sentido resulta ventajoso para evitar la interferencia del factor reumatoideo (FR), el uso de aves como una alternativa de gran valor para la producción de anticuerpos.1

El presente trabajo tuvo como objetivo la evaluación de los anticuerpos anti-PCR de aves utilizando estos en un reactivo de látex aglutinación para la detección de PCR.

Métodos

Los anticuerpos anti-PCR de gallina de la Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay" fueron obtenidos por extracción con polietilenglicol ( PEG )2 y purificados en columna de afinidad.

Preparación del reactivo de látex. Se utilizaron partículas de látex de poliestireno de 0,83 mm a una concentración (masa/volumen) del 10 % en agua.

Se prepararon 3 variantes de reactivo de látex con las inmunoglobulinas de aves utilizando 50, 150 y 200 mg de IgY/mL (0,005; 0,015; 0,020 mg/m2 ) para una concentración final de látex de 1 %. Las variantes se colocaron en un agitador de frascos (RF-02 Retomed) durante 2 h a 37 µC.

Las variantes se centrifugaron, el sobrenadante se eliminó y los precipitados se resuspendieron en buffer fosfato (PBS) con albúmina al 1 %. Se comprobó la estabilidad de las variantes enfrentando los reactivos con solución salina fisiológica.

Evaluación de los anticuerpos IgY específicos para PCR en un sistema de aglutinación de partículas de látex. Las variantes que resultaron estables se evaluaron frente a diferentes concentraciones de PCR, así como a los controles positivos y negativos de un reactivo comercial para la detección de PCR (PCR- Slidex de la firma francesa BioMerieux).

Para evaluar la reactividad de los anticuerpos anti-PCR acoplados a partículas de látex se realizó un estudio comparativo entre el reactivo nuestro y reactivos comerciales. Se analizaron 66 muestras de suero negativas a HBsAg y VIH de pacientes procedentes del Instituto de Reumatología. Se utilizaron como reactivos comerciales el PCR-Slidex de la BioMerieux y el látex-PCR de la firma francesa ELITECH, ambos reactivos de aglutinación en lámina.

Se utilizó un reactivo de látex-FR Finlay para la detección de factor reumatoideo en las 66 muestras y para semicuantificarlo en las muestras no concordantes.

En todos los casos el procedimiento aplicado con los reactivos comerciales fue el designado por el fabricante. Para el látex elaborado con anticuerpos anti-PCR en gallina el procedimiento fue el siguiente:

• Se esperó que los reactivos y los sueros estuvieran a temperatura ambiente.
  
• Se comprobó la funcionabilidad de los reactivos al enfrentarlos con los controles positivos y negativos.
  
• En una lámina portaobjetos se adicionó una gota (20 µL) de la muestra de suero diluida 1:20.
  
• Se agitó suavemente el reactivo de látex y se adicionó una gota (20 µL) a la lámina.
  
• Se mezclaron las gotas con ayuda de una varilla simulando un círculo.
  
• Se rotó manualmente la lámina durante 5 min.

El criterio que se adoptó para las lecturas fue el siguiente: positiva si se produce una aglutinación en el tiempo dado y negativa en caso contrario.

Tiempo                Codificación

Hata 1 min             4+
Hasta 2 min           3+
Hasta 3 min           2+
Más de 3 min        1+
Más de 5 min         -

Resultados

De los reactivos de látex elaborados con los anticuerpos IgY específicos para PCR obtenidos en gallinas, resultaron estables solamente aquellos preparados con 150 y 200 µg de anticuerpos, pues no aglutinaron luego de enfrentarse a la solución salina fisiológica y se mantuvieron como una suspensión homogénea.

Al ser evaluado paralelamente con un reactivo comercial su comportamiento fue inesperado, pues inicialmente existía una respuesta cruzada con los controles comerciales ya que nuestro reactivo no aglutinaba con el control positivo y sí lo hacía frente al negativo (tabla 1).

TABLA 1. Evaluación de la reactividad de los látex preparados con diferentes concentraciones de IgY frente a diferentes concentraciones de PCR y su comparación con el látex comercial (BioMerieux)

Látex	Control negativo					Control positivo
	Concentración de PCR (mg/L)
	Puro	1:20	Puro	1:20	96	48	24	12	6	3	1,5	0,7	0,4
BioMerieux	-	-	+	-	4+	3+	3+	2+	-	-	-	-	-
Finlay 150 mg	+	-	-	+	-	-	-	-	+	2+	4+	2+	-
Finlay 200 mg	+	-	-	+	-	-	-	-	+	2+	4+	2+	-

El resultado de la evaluación de muestras con el látex-FR y con los reactivos de látex a comparar se muestra en la tabla 2.

TABLA 2. Evaluación de muestras negativas y positivas al FR con los reactivos BioMerieux y Finlay en la determinación de PCR

Reactivo BioMerieux
	PCR positivo	PCR negativo
FR positivo	24	10	34
FR negativo	11	21	32
	35	31
Reactivo Finlay
FR positivo	9	25	34
FR negativo	12	20	32
	21	45

La correspondencia con el reactivo de la BioMerieux fue del 75,7 % y las mayores discrepancias se apreciaron en las muestras positivas a FR, donde los resultados positivos a PCR frente al reactivo comercial son negativas frente a nuestro reactivo. Estas muestras al ser evaluadas semicuantitativamente por el reactivo de látex-FR y ensayadas por otro látex comercial para PCR (ELITECH), se demostró que constituían falsos positivos (tabla 3).

TABLA 3. Determinación semicuantitativa de las muestras discrepantes entre BioMerieux y Finlay. Reevaluación con otro reactivo comercial ELITECH

Muestra	Látex
	FRFinlay	PCRBioMerieux	PCRELITECH	PCRFinlay
6	1:32	+	-	-
8	1:32	+	-	-
10	1:32	+	-	-
20	1:64	3+	-	-
21	1:64	4+	-	-
22	1:64	2+	-	-
24	1:64	4+	-	-
25	1:64	4+	-	-
26	1:64	4+	-	-
27	1:32	2+	-	-
28	1:64	2+	-	-
29	1:64	3+	-	-
30	1:32	4+	-	-
31	1:64	4+	-	-
34	1:32	4+	-	-

 

Discusión

Como todo inmunoensayo los reactivos de látex tienen algunas reacciones inespecíficas.

El FR es la causa principal de estas reacciones debido a la presencia de estos en el suero de pacientes en numerosas afecciones e incluso estados fisiológicos. La interferencia del FR puede ser disminuida o eliminada con una cuidadosa selección de los anticuerpos, que comienza con la elección de una especie adecuada para obtenerlos. Al parecer el epítopo crucial en la unión del FR a la IgG de diferentes especies se encuentra en la región del sitio de unión de la proteína A, pues la unión de esta proteína a la IgG inhibe la unión de estas al FR.3 La IgG de aves es la única que al parecer no tiene estos epítopos pues no es capaz de unir proteína A ni FR.4

La producción de anticuerpos requiere primeramente de la purificación del antígeno y su inoculación en un hospedero adecuado para la posterior obtención de los anticuerpos específicos a partir de esta fuente. En nuestro trabajo se utilizaron anticuerpos obtenidos en gallinas como hospedero debido a que resultan ventajosas, pues evitan la interferencia del FR en los inmunoensayos.4 Las gallinas son económicas de mantener y fáciles de manipular a diferencia de los mamíferos y desde el punto de vista de las regulaciones de la protección de los animales resulta más factible su uso, ya que la inmunización con adyuvante completo de Freund es bien tolerada y no produce reacciones locales inflamatorias,5 además colectar huevos en contraste con el sangrado de los mamíferos es un procedimiento no invasivo que no requiere personal especializado.6,7

El sistema de aglutinación en lámina resultó ventajoso en la evaluación de estos anticuerpos de aves acoplandolos en su superficie por simple adsorción. Las concentraciones de recubrimiento 150 y 200 µg/mL (0,015 ; 0,020 mg/m2 ) resultaron adecuadas originando reactivos estables.

Los resultados de la tabla 1 muestran que los látex elaborados presentan más sensibilidad que el látex comercial, pues posee un rango de lectura de PCR diferente e inferior al reactivo comercial BioMerieux, además de aglutinar el control negativo y no hacerlo frente al control positivo. Solo después de diluidos los controles 1:20, las respuestas fueron adecuadas. Nuestros reactivos de látex comienzan a aglutinar la muestra a concentraciones de PCR que están aproximadamente en el límite de detección del reactivo comercial de referencia.

Esto puede ser debido a que nuestro reactivo al ser elaborado con inmunoglobulinas de aves presenta mayor sensibilidad que el reactivo comercial elaborado con inmunoglobulinas de mamíferos, pues las diferencias filogenéticas entre ambas especies redundan en anticuerpos con mayor afinidad, avidez y, por tanto, la sensibilidad y especificidad de los ensayos inmunológicos aumenta.8

Por esta razón se decidió diluir las muestras de suero a avaluar igual que se procedió con los controles, valorando una posible inhibición de la aglutinación por exceso de antígeno (efecto prozona), lo que resultó adecuado ya que el reactivo logró detectar concentraciones patológicas manteniendo su homogeneidad con valores normales.

Se evaluaron un total de 66 muestras con el reactivo para FR (Finlay); 32 resultaron negativas y 34 positivas. Además se evaluaron paralelamente el reactivo elaborado y el reactivo de referencia comercial BioMerieux para detección de PCR.

Del total de muestras evaluadas 50 fueron concordantes entre resultados positivos y negativos para el 75,7 % de correspondencia entre ambos reactivos en la detección de PCR. La mayor discrepancia fue precisamente en las muestras positivas al FR mostrando diferencias en cuanto a la respuesta positiva o negativa donde de un total de 34 muestras, 24 fueron dadas como positivas a PCR por el reactivo BioMerieux y solo 9 por el reactivo Finlay para un total de 15 muestras discordantes (tabla 2). Similares resultados se han obtenido por otros autores al comparar pruebas elaboradas con anticuerpos de mamíferos con pruebas elaboradas con anticuerpos de aves. 9

Estas muestras al ser semicuantificadas para el FR demostraron que el alto título de FR que presentaban interfirió en la evaluación con látex comercial BioMerieux resultando las anteriores discrepancias falsos positivos. Las muestras fueron también reevaluadas con otro reactivo comercial para PCR (ELITECH). Teniendo en cuenta el análisis realizado a las muestras no concordantes y eliminando esos falsos positivos comprobados por el reactivo ELITECH, la especificidad del reactivo Finlay aumenta al 97 % (tabla 3).

En nuestro caso no existió tal interferencia debido al uso de anticuerpos de aves los cuales no reaccionan con el FR y por tanto, aumentan la especificidad respecto a algunos reactivos elaborados con anticuerpos de mamíferos.

Por esta causa la evaluación de este producto utilizando reactivos comerciales con inmuoglobulinas de mamíferos no será una buena opción ya que no es posible considerar a los positivos, verdaderos positivos si se tiene en cuenta la interferencia del FR, así los resultados obtenidos serían paradójicos pues reflejarían una baja especificidad cuando lo que ocurre es todo lo contrario.

A pesar de que en el mercado no se encuentran este tipo de inmunoensayos elaborados con anticuerpos de aves, en nuestro criterio la utilización de esta especie en la obtención de anticuerpos para el inmunodiagnóstico resulta muy atractiva teniendo en cuenta las ventajas que ofrecen desde el punto de vista económico, además de su especificidad y sensibilidad en los inmunoensayos, sobre todo en aquellos donde es necesario detectar pequeñas concentraciones de antígeno para el diagnóstico temprano de determinada afección.

Si se unen todos estos elementos con los resultados favorables obtenidos en el ensayo de aglutinación de partículas de látex para la detección de PCR, se puede plantear que el empleo de anticuerpos de gallinas en este tipo de sistema resulta indudablemente ventajoso.

Summary

The use of poultry in the production of antibodies for the immunodiagnosis would be advantageous, since differently from those obtained from mammals, they do not react to the rheumatoid factor. A latex reagent was developed with C-reactive antiprotein antibodies in poultry, and a study on its behavior was conducted by the evaluation of samples using at the same time reference commercial reagents. It was proved that the nonconcordance with some samples among the evaluated reagents resulted from the interferences of the rheumatoid factor. The reagent made of poultry antibodies proved to be sensitive and specific to C-reactive antiprotein, eliminating the false positives. It was demonstrated that besides the economic advantages of its use, it is a really attractive species for the obtention of anitbodies for the immunodiagnosis.

Subject headings: C-REACTIVE PROTEIN; RHEUMATOID FACTOR; ANTIBODY FORMATION; POULTRY; REAGENT KITS, DIAGNOSTIC.

Referencias Bibliográficas

1. Schade R, Behn I, Erhrad M. Chicken egg yolk antibodies, production and application: IgY- Technology . Springer Lab Manuals. Berlin: Springer-Verlag; 2001. Chapter 6. p.214-5.
   
2. Polsson A, Coetzer T, Kruger J, Maltzahn E von, Merwe KJ van der. Improvement in the isolation of IgY from the yolks of egg laid by immunized hens. Immunol Invest 1985;14: 323-7.
   
3. Hamako J. Binding of humans IgM from rheumatoid factor of IgG to 12 animal species. Comp Biochem Mol Biol 1995;112(4):683-8.
   
4. Larsson A, Karlsson-Parra A, Sjoquist J. Use of chicken antibodies in enzyme immunoassays to avoid interference by rheumatoid factors. Clin Chem 1991;37(3):411-4.
   
5. Gassman M, Thommmes P, Weiser T, Hubscher U. Efficient production of chicken egg yolk antibodies against a conserved mammalian protein. FASEB J 1990;4:2528-32.
   
6. Schade R, Hlinak A. Egg yolk antibodies, state of the art and future prospects. Altex 1996a; 13(Supplement):5-9.
   
7. Woolley JA, Landon J. Comparison of antibodies production to human interleukin G (IL-G) by sheep and chicken. J Immunol Methods 1995;178:253-65.
   
8. Shade R, Henklein P, Hlinak A, De Vente J, Steinbusch H. Specificity of chicken (IgY versus rabbit (IgG) antibodies raised against cholecystokinin octapeptide (CCK-8). Altex 1996b;13(Supplement):80-5.
   
9. Rieger A, Burger W, Hiepe F, Shade R. Determination of human serum CRP using a chicken egg yolk antibody (IgY) to avoid interferences with rheumatoid factors. Comparison with mammalian antibodies. Altex 1996;13(Supplement):57-61.
   

Recibido: 2 de mayo de 2003. Aprobado: 30 de mayo de 2003.
Lic. Leida Díaz Machado. Empresa de Productos Biológicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162 entre Manglar y Línea del Ferrocarril, municipio Centro Habana, Ciudad de La Habana, CP 10300, Cuba.

1 Licenciado en Bioquímica.
2 Master en Ciencias.
3 Técnica en Tecnología Farmacéutica.