Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

Estandarización del ensayo del lisado de amebocitos de Limulus (LAL): método de gelificación

Rolando Perdomo Morales1 y Vivian Montero Alejo

Resumen

Entre las principales aplicaciones del método del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) está el control de endotoxinas en producto final de drogas parenterales. Para la aplicación exitosa del ensayo se requiere del dominio de un conjunto de habilidades, por lo que usualmente se corre en laboratorios especializados que ya cuentan con una basta experiencia. Aunque ya es un método ampliamente establecido y conocido, la aplicación del ensayo puede ser laborioso, consumir tiempo y reactivos hasta la obtención de resultados correctos. En el presente trabajo se describe la estandarización del ensayo del LAL por el método de gelificación. Se evalúan varias estrategias con la finalidad de optimizar y/o reducir el tiempo total de ensayo, el empleo de materiales como puntas certificadas libres de endotoxinas, tubos de ensayo y la sustitución de agua libre de endotoxinas suministrada por los fabricantes de reactivo LAL por agua para inyección. El procedimiento estandarizado produce resultados válidos según los criterios de la Farmacopea de EE.UU.

Palabras clave: método del LAL, endotoxinas, pirógenos, control de calidad, inyectables.

El ensayo del lisado de amebocitos de Limulus (LAL) es un método para la cuantificación de endotoxinas bacterianas (pirógenos), que se basa en la activación por las endotoxinas de una cascada de enzimas serino proteasas (reactivo LAL) presentes en los amebocitos del cangrejo herradura, Limulus polyphemus. El grado de activación está relacionado con la concentración de endotoxinas presente en la muestra y se determina por 3 métodos in vitro: gelificación, cromogénicos y turbidimétricos.1

En la actualidad, la mayoría de las monografías de drogas parenterales descritas en las principales Farmacopeas regulan el ensayo LAL para el control de pirógenos en producto terminado. Por ejemplo, la Farmacopea de los Estados Unidos en su edición 24, contiene más de 650 nuevas entradas de productos en los cuales regula en ensayo del LAL.2 El método también se emplea en el control de proceso de la producción de inyectables, control de endotoxinas en los accesorios médicos que tendrán contacto con la circulación sistémica, en la industria alimenticia, en la clínica, en el control del agua que se emplea en la industria de semiconductores y en controles medio ambientales.3

Las principales desventajas de la aplicación práctica general del método del LAL en la industria médico-farmacéutica y biotecnológica son: 1) los juegos de reactivo o kits presentan un alto costo en divisas en el mercado internacional y solo pueden ser adquiridos por importación; 2) el desarrollo del método requiere de condiciones controladas, y empleo de materiales y reactivos libres de endotoxinas; 3) la susceptibilidad de contaminación durante la corrida del ensayo puede provocar la invalidez de los resultados obtenidos; y 4) requiere de un personal técnico muy bien entrenado. Estas características y otras hacen que se generen mitos a la hora de montar el método, por ejemplo, trabajar en áreas especiales y en condiciones de seguridad que muchas veces son más estresantes que factibles.

El objetivo del presente trabajo es el desarrollo de un procedimiento con resultados válidos que permita disminuir la manipulación de reactivos, el tiempo y el costo total del ensayo, y precisar acerca de los requerimientos más elementales para el montaje exitoso del método. Además, se estudiará la factibilidad del empleo de agua para inyección para sustituir el agua libre de endotoxinas (LAL Reagent Water), que suministran según su solicitud las casas distribuidoras de reactivo LAL para el desarrollo del método.

Métodos

Reactivos. Para el estudio se empleó el juegos de reactivos Pyrogen Plus, Biowhittaker Inc., método de gelificación con una sensibilidad (l) de 0,06 unidades de endotoxinas por mililitro (UE/mL). La reconstitución y almacenamiento de los reactivos se realizó según la guía del fabricante. En todo el estudio se empleó el mismo lote de reactivo LAL.

Para la reconstitución de los reactivos y preparación de diluciones se empleó agua libre de endotoxinas (LAL Reagent Water) Biowhittaker, Inc. (< 0,001 UE/mL) en presentación de 20 y 100 mL.

Materiales. Excepto donde se indica, el material empleado es certificado libre de endotoxinas o despirogenizado por calor seco a 180 °C por 4 h en un ciclo previamente validado. Los recipientes empleados no adsorben endotoxinas o liberan productos que inhiben o potencian la reacción del LAL.

Condiciones de trabajo. Debido a que las endotoxinas son muy ubicuas, el ensayo debe realizarse de modo que se reduzcan las posibilidades de contaminación de reactivos y muestras. Se trabajó en un área donde se evita el trasiego de personal, el polvo y fuentes directas de aire acondicionado. Durante el desarrollo del método se evitó mover o hablar encima de los viales y tubos destapados. Los reactivos y muestras se mantuvieron cubiertos con papel parafilm cuando no estaban en uso.

Preparación de la curva patrón. Excepto donde se indica, en cada ensayo se emplearon 4 réplicas. Se preparó una solución a 1 UE/mL (solución A) del modo indicado en la guía del fabricante en tubos de borosilicato o tubos de centrífuga de 15 mL Corning de poliestireno certificados libres de endotoxinas. Los pasos siguientes son una modificación a la guía del fabricante. A partir de la solución A se realizó una dilución 1:4 en el mismo tipo de tubo de reacción para obtener una concentración de 0,25 UE/mL en 1 mL de volumen final (solución B).

Para la preparación de la curva patrón se emplearon directamente los tubos donde se desarrolla la reacción con el reactivo LAL. La curva se generó a partir de la solución B por serie de 4 diluciones 2 x. De este modo, se obtuvieron para el ensayo las concentraciones siguientes: 0,125; 0,06; 0,03 y 0,015 UE/mL en 0,1 mL volumen final. Siempre se aplicó agitación vigorosa por 30 s entre cada paso de dilución empleando un Vortex.

Método LAL. A 0,1 mL de muestra, blanco o estándar en tubos de vidrio sódico cálcico de 10 x 75 mm, se adicionó 0,1 mL de reactivo LAL con ayuda de la pipeta repetidora (Eppendorf Multipette Plus o Socorex 411 según se indique), se agitó la gradilla, e inmediatamente se colocaron los tubos cuidadosamente en un calentador de bloque seco donde se incubaron en reposo por 60 min a 37 ± 1ºC.

Al finalizar la incubación, se leyó el ensayo por inversión cuidadosa de los tubos de reacción un ángulo de 180 º. La presencia de un gel sólido que resiste sin colapsar la inversión del tubo se registró como resultado positivo, cualquier otra condición se registró como negativo.

Cálculo de la concentración de endotoxinas. Para determinar la concentración de endotoxinas en la muestra, se calculó la media geométrica entre los puntos finales correspondientes a cada réplica, lo cual quiere decir la mayor dilución que produce una respuesta positiva en el ensayo, y se multiplicó por la sensibilidad del método (0,06 UE/mL).4

Estrategias a evaluar

Ensayo 1. Se preparó la serie de diluciones de la curva patrón a razón de una punta de 10-100 µL certificada libre de endotoxinas (puntas tipo Biopur de Eppendorf), por dosificación. El método LAL se desarrolló con el empleo de materiales libres de endotoxinas, como pipeta Pyrex de vidrio de 10 mL desechable para reconstituir el reactivo LAL y el estándar de endotoxinas, y puntas para pipeta repetidora de 2 mL Eppendorf Biopur para adicionar el reactivo LAL.

Ensayo 2. Se preparó la serie de diluciones de la curva patrón utilizando la misma punta de 10-100 µL Eppendorf Biopur, para cada réplica de la serie de diluciones teniendo especial cuidado en evitar que la punta tuviera contacto con cualquier superficie. El resto de las condiciones son similares al ensayo 1

Ensayo 3. La curva patrón se preparó como se describe en el ensayo 2. En el resto de los pasos se utilizó material nuevo no certificado libre de endotoxinas: puntas para macro pipeta de 1-10 mL de polipropileno para reconstituir el reactivo LAL y el estándar de endotoxinas, y puntas para pipeta repetidora Socorex 411, Ecostep de 3,75 mL para dispensar el reactivo LAL.

Control de endotoxinas en agua para inyección. Se determinó la concentración de endotoxinas en agua para inyección. Se realizó una serie de diluciones 2 x hasta 1:4 en tubos de reacción de vidrio sódico cálcico de 10 x 75 mm y se empleó el procedimiento que se describe en el ensayo 3. Se corrieron 2 réplicas para la curva patrón y las muestras.

Resultados

En la tabla 1 se muestran los resultados de las estrategias empleadas. En todos los casos el punto final obtenido se encontró dentro del error del método (± 2l).

La máxima dilución válida (MDV) para el agua para inyección calculada según la fórmula descrita en la Guía directiva para la validación del ensayo del LAL5 (MDV = límite de endotoxinas/sensibilidad del ensayo), es de 1:4. Este valor significa la mayor dilución de un producto a la cual un método de sensibilidad dada es capaz de detectar el límite de endotoxinas de dicha muestra. En la tabla 2 se describen los resultados del ensayo de evaluación del agua para inyección. Empleando la base de cálculo descrita en el acápite de métodos, se obtuvo una concentración de endotoxinas en el agua para inyección valorada de 0,12 UE/mL.

TABLA 1. Resultado de la curva patrón con el empleo de cada uno de los ensayos

	Ensayo 1
Réplica	Blanco	0,125	0,06	0,03	0,015
1	-	+	+	-	-
2	-	+	+	-	-
3	-	+	+	-	-
4	-	+	+	-	-
Ensayo 2
1	-	+	+	-	-
2	-	+	+	-	-
3	-	+	+	-	-
4	-	+	+	-	-
Ensayo 3
1	-	+	+	-	-
2	-	+	+	-	-
3	-	+	+	-	-
4	-	+	+	-	-

TABLA 2. Resultados del ensayo del LAL en la determinación de la concentración de endotoxinas en agua para inyección

Curva patrón (UE/mL)
	0,12	0,06	0,03	0,015
Replica 1	+	+	-	-
Replica 2	+	+	-	-
Dilución de la muestra
	Sin diluir	1/2	1/4
Replica 1	+	+	-
Replica 2	+	+	-

Discusión

La curva patrón en el método de gelificación se emplea para confirmar la sensibilidad que establece el fabricante. La Guía directiva de la FDA para la validación del método del LAL,5 refiere los criterios y procedimientos de la USP4 para la calificación inicial y recalificación del analista/laboratorio/método cuando describe el procedimiento de control de calidad del método de gelificación. En este sentido establece que la media geométrica de la concentración de los puntos finales debe ser mayor o igual que 0,5 l y menor o igual que 2 l (error de ± 2 l ), en 4 réplicas de la curva patrón para que el ensayo sea válido. Nos apoyamos en este criterio para evaluación de la metodología general y de cada estrategia.

Los 3 ensayos que se estudiaron cumplen con los criterios que plantea la USP,4 por lo tanto producen resultados válidos o correctos.

Tres razones estimularon a plantear la hipótesis de que sería posible sustituir las puntas de pipetas libres de endotoxinas por puntas nuevas no certificadas libres de endotoxinas para el desarrollo del ensayo: 1) Las altas temperaturas que se utilizan para el moldeo de las puntas de pipetas, pueden despirogenizar o reducir el contenido de endotoxinas en estas hasta niveles indetectables.6 La posibilidad de contaminación estará en la manipulación y almacenamiento posterior. 2) Las puntas de pipetas son de polipropileno, un material que adsorbe marcadamente endotoxinas. Novitsky y otros7 plantean que se obtiene menos de 1 % de recobro de endotoxina adicionada a recipientes de polipropileno independientemente del método utilizado para fijar o extraer las endotoxinas del material. 3) El tiempo de contacto entre la punta de pipeta y la solución a dosificar es bastante corto.

La estrategia descrita en el ensayo 1 se emplea como patrón de comparación y para la evaluación de la metodología general utilizada. Plantea las condiciones más cercanas a lo óptimo que se describe en la literatura,3,8,9 donde en general, se enfatiza en que todo el material empleado sea libre de endotoxinas y en la utilización de una punta de pipeta por dosificación.

Los resultados del ensayo 2 demuestran que es posible emplear la misma punta de pipeta libre de endotoxina para cada serie de dilución (una por réplica). En el ensayo 3 se realiza la evaluación de la sustitución de las puntas para reconstituir los reactivos y dispensar el reactivo LAL. Como se ha planteado anteriormente, también se obtuvieron resultados válidos con esta estrategia.

El agua para inyección valorada cumple con el límite de 0,25 UE/mL establecido por la USP 24. Sin embargo, no podría ser empleada para el desarrollo del método del LAL por gelificación ya que presenta un contenido de endotoxinas mayor que la sensibilidad del reactivo. Esto provoca la activación del reactivo y la subsiguiente gelificación de todas las muestras incluyendo el control negativo.

El problema de la calidad del agua es especialmente importante en los métodos de gelificación. En los métodos cromogénicos y turbidimétricos, el desarrollo de una curva patrón real facilita que se sustraiga el contenido de endotoxinas aportado por el agua porque esta se emplea como blanco de ensayo. Es así que se enfatiza que el agua empleada en ensayos de gelificación presente un contenido de endotoxinas particularmente bajo.

La floculencia o presencia de precipitado es indicativo de la presencia de endotoxinas en la mezcla de reacción, pero en una cantidad menor que la sensibilidad del método. Si esta ocurre en el control negativo, frecuentemente indica que el agua está contaminada con bajos niveles de endotoxinas. Si se adicionan bajos niveles de endotoxinas al reactivo LAL cuando se reconstituye, la reacción comenzará en el bulbo de reactivo LAL y el método parecerá más sensible de lo que debe ser cuando se realiza la curva patrón.3

En conclusión, el método empleado ahorra materiales relativamente costosos, reduce la manipulación (y por tanto probabilidades de contaminación) y el tiempo total del ensayo. Es indispensable contar con una pipeta repetidora para dispensar el reactivo LAL en un tiempo menor de 2 min según establece la USP 24.4 Debido a la susceptibilidad de contaminación de muestras y reactivos, las condiciones para el desarrollo del método deben ser muy cuidadosas; sin embargo, tal como se ha planteado en la literatura,3,8 se demuestra que no es necesario el empleo de áreas especiales (estériles o cabinas de flujo laminar).

El empleo de la estrategia que se describe en el ensayo 3 resulta más ventajoso ya que utiliza solo el 40 % de las puntas libres de endotoxinas con respecto al protocolo que usa una punta por dosificación o pipeteo. Este ahorro podría ser notablemente más significativo en cuanto aumente el número de diluciones de una muestra a ensayar. Además, se concluye que es posible emplear puntas nuevas no certificadas libres de endotoxinas para la reconstitución de los reactivos.

De forma cualitativa, la ausencia de floculencia o turbidez en el blanco puede ser suficiente para evidenciar que el agua que se emplea es de buena calidad. Existen métodos muy sensibles como el turbidimétrico cinético (0,001 UE/mL) y el cromogénico cinético (0,005 UE/mL) que podrían ser utilizados para controlar el agua que se pretende emplear en el método de gelificación o gel-clot del LAL en cualquiera de sus versiones más comunes (0,03; 0,06 ó 0,12 UE/mL de sensibilidad). El tamizaje de varios lotes de agua para inyección y la selección de uno o varios lotes que cumplan con las exigencias que requiere este método, es una opción viable para la sustitución del agua comercial en la corrida de rutina del método en laboratorios de control de calidad, los cuales procesan una gran cantidad de muestras y por tanto, consumen un volumen significativo de agua libre de endotoxinas.

Summary

The control of endotoxins in the final product of parenteral drugs is among the main applications of the limulus amebocyte lysate (LAL). For the successful application of this test, it is necessary to have a thorough knowledge of a series of abilities. That's why, it is usually made at specialized laboratories having a vast experience. In spite of the fact that it is already a widely established and known method, the application of the assay may be laborious, take time and consume reagents until the obtention of the right results. In the present paper, it is described the standardization of the LAL assay by the gelification method. Various strategies are evaluated in order to optimize and/or reduce the total time of the assay, the use of materials as certified endotoxin-free points, test tubes, and the substitution of endotoxin-free water, supplied by the manufacturers of LAL reagent, by injection water. The standardized procedure produces valid results according to the criteria of the U.S. Pharmacopoeia

Key words: LAL method, endotoxins, pyrogens, quality control, injections.

Referencias Bibliográficas

1. Pearson FC. LAL Assay. En: Pearson FC, eds. Pyrogens: Endotoxin, LAL testing, and depyrogenation. New York: Marcel Dekker; 1985. p.119-42.
   
2. Cooper JF. Validation of Bacterial Endotoxins Test Methods. LAL Times 1999;6(2):1-7.
   
3. Novitsky TJ. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) Assays. En: Olson WP, eds. Automated Microbial Identification: Technologies for the 2000s. Buffalo Grove: Interpharm Press; 1996: 277-98.
   
4. Bacterial Endotoxin Test. The United States Pharmacopoeia 24 and National Formulary 19. Rockville: United States Pharmacopeial Convention; 2000: 1829-30.
   
5. Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products and Medical Devices. U.S. Department of Health and Humans Services, Public Health Service, Food and Drugs Administration. December, 1987.
   
6. Novitsky TJ. Validation controls for depyrogenation. LAL Update 1986: March: 1-4.
   
7. Novitsky TJ, Schmidt-Gengenbach J, Remillard JF. Factors affecting recovery of endotoxin adsorbed to container surfaces. J Parenteral Sci Technol 1986;40(6):284-6.
   
8. Gould MJ. Performing the LAL gel-clot test in facilities. Nephrol News Issues 1998; November: 26-9.
   
9. __________. Limulus Amebocyte Lysate assays and filters applications. En: Meltzer TH, Jornitz MW, eds. Filtration in the Biopharmaceutical Industry. New York: Marcel Dekker; 1998:605-18.

Recibido: 6 de octubre de 2003. Aprobado: 14 de noviembre de 2003.
Lic. Rolando Perdomo Morales. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Ave. 26 No. 1605, entre Boyeros y Puentes Grandes, municipio Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba. E-mail: [e-mail]

 

1 Licenciado en Bioquímica. Investigador Aspirante.
2 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas.