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Revista Cubana de Farmacia

Print version ISSN 0034-7515On-line version ISSN 1561-2988

Rev Cubana Farm vol.41 no.2 Ciudad de la Habana May-Aug. 2007

 

Empresa Laboratorio Farmacéutico "Julio Trigo"

Desarrollo de un método analítico para el control de la calidad del colirio de pilocarpina 2 %

Martha Botet García,1 Caridad Margarita García Peña,2 Jacqueline Aylema Romero,3 Caridad Rodríguez4 y Vivian Martínez Espinosa5

Resumen

Se desarrolló y validó un método analítico alternativo para el control de la calidad del colirio de pilocarpina por espectrofotometría ultravioleta, ya que este método resulta más rápido, sencillo y económico. Además, se validó el método analítico reportado para el estudio de estabilidad por cromatografía líquida de alta resolución. Ambos métodos se compararon estadísticamente y resultaron específicos, lineales, precisos y exactos en el rango de concentraciones estudiadas.

Palabras clave: Pilocarpina, cromatografía líquida de alta resolución, espectrofotometría ultravioleta.

El clorhidrato de pilocarpina es una amina terciaria, parasimpaticomimética que estimula directamente los receptores colinérgicos. Produce la contracción del músculo esfínter del iris, da lugar a la cons­tricción del músculo pupilar (miosis); constricción del músculo ciliar (acomodación), lo que provoca el aumento de la acomodación y una reducción de la presión intraocular, asociada con un incremento del flujo de salida y un decremento del flujo de entrada del humor acuoso. Además también puede inhibir la secreción del humor acuoso.1

La espectrofotometría ultravioleta es un poderoso instrumento en una variedad de problemas analíticos. Aunque en muchas oportunidades tiene el inconveniente de la falta de especificidad, debido a la interferencia con los productos de degradación, los cuales en ocasiones pueden presentar un espectro idéntico al componente sin degradar, y en otras las concentraciones a determinar son muy pequeñas y están por debajo del límite de sensibilidad del método o dentro de su error experimental.2

La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) le brinda la posibilidad al analista de emplear esta herramienta para solucionar los inconvenientes de los métodos espectrofotométricos en los estudios de estabilidad, pues además de presentar una alta sensibilidad y exactitud, es en esencia un método separativo, lo que permite medir con gran selectividad el compuesto deseado, siempre y cuando se encuentre un sistema cromatográfico que asegure una adecuada separación.3

 La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas de que el método es lo suficientemente fiable para producir el resultado esperado.4-6

Los parámetros analíticos que pueden ser considerados en la validación de un método analítico, según se expresa en la United States Pharmacopoeia (USP 26, USP 27), son exactitud, precisión, especificidad, límite de detección, límite de cuantificación, linealidad, rango, tolerancia y robustez.


El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar un método analítico alternativo para el control de la calidad del colirio de pilocarpina y su validación. Además, demostrar si existen diferencias significativas entre el método desarrollado y el reportado en la Farmacopea de los Estados Unidos, USP 27, previamente validado.

Métodos

Las muestras del colirio de pilocarpina al 2 %, utilizadas para el desarrollo de este trabajo fueron identificadas como lote 2004, fabricado en la Empresa Farmacéutica “Julio Trigo”.

Validación del método analítico para la cuantificación por CLAR

En el ensayo se empleó un cromatógrafo (KNAUER) con detector UV/VIS (KNAUER) ajustado a 215 nm, un dosificador de 20 μL e integrador (SHIMADZU CR 8 A). La separación se realizó isocráticamente sobre una columna hypersil ODS, longitud de 25 cm, diámetro interno 4 mm y tamaño de partículas 5 μm. La fase móvil utilizada consistió en una mezcla desgasificada de KH2PO4 0,02 M, Acetonitrilo (88:12) con una velocidad de flujo de 1,5 mL/min.

Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se analizó la sustancia de referencia química del clorhidrato de pilocarpina (de calidad USP, con 100 % de pureza), el placebo y una muestra del producto terminado sometida a condiciones drásticas como: hidrólisis ácida HCl 0,1 N e hidrólisis básica, almacenada a una temperatura de 70 oC durante 21 días.

 Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se preparó una curva de calibración con soluciones patrón de clorhidrato de pilocarpina en un rango de concentraciones de 48 a 112 µg/mL, que representan del 60 al 140 % de la concentración teórica del principio activo en la solución.

Se evaluó la precisión del método. La repetibilidad se estudió sobre la base de 6 determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 días diferentes para comprobar la precisión intermedia del método.

En el estudio de la exactitud se empleó el método de recuperación; se prepararon muestras con diferentes niveles de clorhidrato de pilocarpina que representan el 80, 100 y 120 % de la concentración teórica del principio activo en la solución, según la formulación propuesta. Con el objetivo de verificar la relación lineal de la respuesta analítica con respecto a los diferentes niveles de concentración utilizados, se realizó el estudio de linealidad a través de los coeficientes de variación de los factores de respuesta CVf, los cuales deben ser menores que el 5 %. Además se realizó la prueba de proporcionalidad, para lo cual se utilizó el estadígrafo t Student, con el objetivo de demostrar la proporcionalidad de la señal obtenida. También se determinó la influencia del factor concentración en la variabilidad de la respuesta obtenida, a través de la prueba de Cochran (G calculada debe ser menor que G tabulada).4-6

Desarrollo y validación del método analítico para la cuantificación por espectrofotometría ultravioleta (UV)

En el desarrollo del método analítico por espectrofotometría ultravioleta se utilizó un espectrofotómetro Spectronicâ GénesisTM 2PC. Para la selección adecuada de la longitud de onda a utilizar, se realizaron previamente espectros UV, en la zona de 200 a 400 nm, con la sustancia de referencia, producto terminado, placebo y materia prima del clorhidrato de pilocarpina, disueltos en agua destilada; se observó un máximo de absorbancia a 215 nm.

La solución de referencia se obtuvo disolviendo el clorhidrato de pilocarpina, sustancia de referencia, en agua destilada hasta obtener una concentración de 20 mg/mL aproximadamente.

En la preparación de la solución de ensayo para la valoración se disolvió una alícuota de la muestra del colirio en agua destilada hasta una concentración de alrededor de 20 mg/mL. Se lee a 215 nm contra un blanco de agua destilada.

Con el objetivo de evaluar la especificidad del método se emplearon muestras con la sustancia de referencia química del clorhidrato de pliocarpina, placebo, muestra de producto terminado pilocarpina colirio y muestras sometidas a condiciones drásticas de hidrólisis ácida y básica, realizando un scanning de las soluciones entre 200 y 400 nm.

Para el estudio de la linealidad de la respuesta del detector se preparó una curva de calibración con solución patrón de clorhidrato de pilocarpina en un rango de concentraciones de 10 hasta 30 mg/mL que representan del 50-150 % de la concentración teórica del principio activo en la solución.

Se evaluó la precisión del método. La repetibilidad se estudió sobre la base de 6 determinaciones y se efectuaron valoraciones por 2 analistas en 2 días diferentes para comprobar la precisión intermedia del método; para el estudio se utilizaron los estadígrafos F-Fischer y t-Student, con el objetivo de determinar la existencia de diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por ambos analistas y entre las medias obtenidas, respectivamente. Primeramente, se realizó la prueba de Fischer y se verificó la homogeneidad de las varianzas alcanzadas por diferentes analistas; se debió obtener un valor calculado menor que el tabulado. En el caso del estadígrafo t-Student se debe obtener también un valor calculado menor que el tabulado.

En el estudio de la exactitud se empleó el método de recuperación, para lo cual se prepararon muestras con diferentes niveles, que representan el 80, 100 y 120 % de la concentración teórica del principio activo en la solución.

Comparación estadística

Con el objetivo de realizar una comparación estadística entre los resultados por CLAR y los obtenidos por el método analítico alternativo desarrollado por espectrofotometría ultravioleta se aplicó el estadígrafo de la t de Student para determinar si existían diferencias significativas entre los 2 métodos.

Resultados

Validación del método analítico para la cuantificación por CLAR

La figura muestra los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método. Como se observa al comparar la señal obtenida para la sustancia de referencia (I) y la muestra de pilocarpina clorhidrato (II), existe similitud en cuanto al tiempo de retención. En el cromatograma correspondiente al placebo (III) no se obtuvo ninguna señal en la zona de interés, lo cual indica que los excipientes o sustancias auxiliares de la solución no interfieren en la determinación del principio activo. En cuanto a las muestras sometidas a condiciones drásticas; se observan en los cromatogramas (IV, V) la aparición de picos secundarios, atribuibles a un posible producto de degradación, el cual no interfiere en la determinación del principio activo.



Fig. Resultados del estudio de especificidad del método cromatográfico. I-Cromatograma de la sustancia de referencia química. II- Cromatograma del producto terminado (muestra). III- Cromatograma del placebo. IV- Cromatograma de la muestra degradada por hidrólisis ácida. V- Cromatograma de la muestra degradada por hidrólisis básica.

Simultáneamente se realizó un scanning al pico correspondiente al principio activo en un rango de 200 a 400 nm, para una pureza del 99,5 %.

En la tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema y la exactitud. Los resultados del estudio de precisión del método desarrollado aparecen reportados en la tabla 2.

Tabla 1. Resultados del estudio de la linealidad del sistema y exactitud

Parámetros

CLAR

UV

Límites

 

Linealidad del sistema

y= 0,30663 X + 2,018
r = 0,99956

y= 23,677 x + 0,00193614
r= 0,99948.

y= a x + b
r ³ 0,99900

CVf= 0,94 %

CVf = 1,13 %

CVf ≤ 5,0 %

tcalc= 2,03
ttab= 3,18

tcalc= 2,99
ttab= 3,18

tcalc <  ttab

           

 

Exactitud

 

 

y= 1,14589 x - 0,89245
r= 0,99945

y = 0,999788 x + 0,0138373
r= 0,99916

y= a x + b
r ³ 0,99000

CVf= 1,58 %

CVf= 2,17 %

CVf ≤ 5,0 %

R= 99,28 %

R= 99,70 %

R= 98,0 – 102,0 %

tcalc = 1,69
ttab = 2,57

tcalc= 1,77
ttab= 3,18

tcalc < ttab

Gcalc= 0,5879
Gtab = 0,9750

Gcalc= 0,8709
Gtab= 0,9750

Gcalc < Gtab

Tabla 2. Resultados del estudio de la precisión del método analítico por CLAR

Analista 1

Analista 2

Día 1

Día 2

Día 1

Día 2

103,5 %

102,2 %

102,8 %

102,9 %

102,8 %

102,0 %

102,7 %

102,5 %

102,5 %

102,1 %

103,8 %

102,4 %

102,5 %

102,0 %

102,5 %

103,6 %

103,0 %

102,4 %

102,8 %

103,0 %

103,0 %

102,4 %

103,0 %

102,6 %

CV = 0,33 %

CV = 0,16 %

CV = 0,40 %

CV = 0,39 %

                                        Fcal= 2,52    Ftab (10,10 / 0,05)= 2,97
                                    tcal= 1,59     ttab (22 / 0,05)= 2,07

Validación del método analítico para la cuantificación por UV

Los resultados obtenidos en el estudio de especificidad del método realizado a 215 nm, al placebo, la sustancia de referencia química, y el colirio de pilocarpina se muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Estudio de especificidad por espectrofotometría ultravioleta

Muestra

Absorbancia (310 nm)

Placebo

0,002

0,003

0,003

Sustancia de referencia química de clorhidrato de pilocarpina

0,410

0,403

0,405

Colirio de pilocarpina 2 %

0,406

0,399

0,404

En la tabla 1 se reportan los resultados del estudio de la linealidad del sistema y la exactitud, mientras que los resultados correspondientes a la precisión aparecen en la tabla 4.

Tabla 4. Resultados del estudio de la precisión por espectrofotometría

Analista 1

Analista 2

Día 1

Día 2

Día 1

Día 2

99,7 %

99,8 %

100,7 %

99,3 %

99,6 %

98,9 %

98,7 %

99,6 %

99,9 %

100,8 %

99,4 %

100,5 %

100,5 %

100,8 %

99,9 %

100,9 %

100,9 %

101,7 %

100,9 %

98,1 %

101,9 %

99,7 %

101,2 %

99,6 %

CV= 0,80 %

CV= 0,90 %

CV= 0,88 %

CV= 0,98 %

tcal= 1,79
ttab= 2,33

Fcal= 2,45
Ftab= 5,05

                       Leyenda: CV: coeficiente de variación; t: estadígrafo t-Student; F: estadígrafo F-Fischer.

Comparación estadística

Los resultados de la comparación estadística de los resultados obtenidos por CLAR y el método analítico desarrollado por espectrofotometría ultravioleta se aprecian en la tabla 5.

Tabla 5. Comparación estadística de los métodos por CLAR y UV

CLAR
(%)

Espectrofotometría
(%)

Límites

102,9
102,5
102,4
103,6
103,0
102,6

100,5
100,9
101,9
101,7
101,2
100,9

 

 

 

CVf ≤ 5,0 %
tcal< ttab

Media= 101,5%
CV= 1,35 %

Media= 101,4 %
CV= 1,38 %

Tcal = 1,98
ttab= 2,33
CVf  = 2,09

Discusión

Como se puede apreciar en la figura el método reportado por CLAR resulta específico al no detectarse interferencias de picos adicionales en la zona de elusión del producto principal. El scanning realizado con el objetivo de determinar la pureza del pico de pilocarpina, en el rango de 200 a 500 nm demostró que no existía solapamiento de otros productos de degradación.

Los resultados obtenidos en el estudio de especifidad del método espectrofotométrico, reflejados en la tabla 3, al analizar muestras del placebo, la sustancia de referencia de clorhidrato de pilocarpina y el producto terminado, indican que los excipientes no interfieren en la determinación del principio activo, lo que demuestra la especificidad del método para el control de la calidad al no observarse absorbancia del placebo a la longitud de onda máxima del principio activo. Sin embargo, al analizar las muestras sometidas a condiciones drásticas se observaron interferencias de los productos de degradación a la longitud de máxima absorbancia de la pilocarpina, lo que demuestra que el método no es específico para el estudio de estabilidad del colirio.

Las curvas de calibración de los métodos validados para el control de la calidad y el estudio de estabilidad del colirio de pilocarpina resultaron ser lineales. Al aplicar la prueba del intercepto a cada uno de los métodos, resultaron no significativos ya que las t tab fueron mayores que las t cal, por lo que se rechaza la hipótesis nula de que el intercepto es igual a cero, para ambos métodos. En la prueba de linealidad mediante el coeficiente de variación de los factores de respuesta CVf, se obtuvieron coeficientes de variación menor del 5 % y se demostró el cumplimiento de la linealidad en el intervalo de concentraciones estudiados para ambos métodos validados.

En los estudios de repetibilidad se obtuvieron coeficientes de variación adecuados, menores que 1,5 % lo que demuestra la buena precisión de los métodos. Los valores obtenidos para los estudios de la precisión intermedia demostraron que no existen diferencias significativas entre las precisiones alcanzadas por los analistas en diferentes días para una probabilidad de 0,05 %, ya que los valores de F cal son menores que la F tab. Al realizar las prueba de la t de Student para ambos métodos, el valor calculado resultó ser menor que el tabulado, lo cual demuestra que no existen diferencias significativas entre las medias alcanzadas con un nivel de significación del 5 %.

En los estudios de exactitud realizados para los 2 métodos, los valores de porcentaje de recobro estuvieron dentro de los límites establecidos para los métodos espectrofotométricos y cromatograficos (98-102 %), y los valores del coeficiente de variación para cada uno de los niveles de concentración estudiados resultaron menores que el 5 %. En la influencia del factor concentración sobre la variabilidad de los resultados de la exactitud al aplicar la prueba de Cochran, las concentraciones empleadas son equivalentes, lo que indica que la concentración no influye en la variabilidad de estos. No existieron diferencias significativas entre las recuperaciones medias y el 100 % de recuperación al aplicar la prueba de la t de Student, ya que la t cal fue menor que la t tab, por lo que el método es exacto. La curva de recuperación reportada de mg teóricos contra los mg prácticos demostró un comportamiento lineal. La prueba de significación del intercepto resultó no significativa y el valor de la pendiente no difiere significativamente de la unidad. Los valores alcanzados de la pendiente, el intercepto y el coeficiente de correlación demostraron la exactitud y linealidad del método.

Al analizar estadísticamente los resultados obtenidos de los métodos analíticos por CLAR y el desarrollado por espectrofotometría ultravioleta, para la cuantificación del colirio de pilocarpina 2 %, para el estudio de estabilidad y control de la calidad, respectivamente, se pudo comprobar que no existen diferencias significativas entre los resultados, al ser la t cal menor que la t tab.

Summary

Development of a analytical method for quality control of 2 % Pilocarpine eyedrops

A alternating and analytical method was developed and validated for quality control of Pilocarpine eyedrops by UV spectrophotometry, since this method is more fast, simple, and cheap. Also, for stability study by high performance liquid chromatography, reported analytical method was validated. Both methods were statistically compared, and were specific, linear, accurate, and in the rank of study concentrations.

Key words: Pilocarpine, high performance lilquid chromatography, UV spectrophotometry.

Referencias bibliográficas

1. Martindale W. The extra Pharmacopoeia 28th ed. London: Pharmaceutical Press; 1989. p. 1224-6.

2. Cromatografía en la Química Clínica. HPLC en Reactivos Merck. Alemania. 1988. p. 3-16.

3. Quattrocchi OA, Laba RF. Introducción a la HPLC en Aplicación y práctica. Buenos Aires: Ed. Artes Gráficas Farro SA; 1992. p. 106-22; 284; 302-28.

4. Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria. Validación de Métodos Analíticos. Sección Catalana de AEFI. Comisión de normas de buena fabricación y control de la calidad. Sept.  Barcelona: AEFI; 1999. p. 1-94.

5. United States Pharmacopoeial Convention, USP 23-NF 17. Validation of compendial methods. 23 ed. Rockville; Mack Printing; 1995. p. 1982- 4.

6. International Conference on Harmonization (ICH) of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use, Validation of analytical procedures: Methodology, ICH-Q2B, Geneva, 1996. ICH harmonized tripartite guideline. Methodology of validation of analytical method. Recomendado en nov. 1996. Geneva: ICH; 1996.

Recibido: 8 de enero de 2007. Aprobado: 9 de febrero de 2007.
MC. Martha Botet García. Empresa Laboratorio Farmacéutico "Julio Trigo". Avenida Independencia km 7.5, Boyeros, La Habana, Cuba. Correo electrónico: caridad@cidem.quimefa.cu

1 Master en Tecnología y Control de Medicamentos. Empresa Laboratorio Farmacéutico "Julio Trigo".
2 Master en Tecnología y Control de Medicamentos. Investigador Agregado. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM).
3 Licenciada en Bioquímica. Reserva Científica. CIDEM
4 Técnica en Análisis Químico. Empresa Laboratorio Farmacéutico "Julio Trigo".
5 Técnica en Tecnología Farmacéutica. CIDEM.

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